一种基于CRISPR/Cas9的酵母基因组稳定整合方法

gene integration in yeast,acs synth.biol.2018,7,11,2675
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2685)。然而，这些研究中的大多数主要关注多重基因组整合的效率，而对整合的异源基因和途径的稳定性研究较少。
5.现有技术中，寻找合适的整合位点是必要的，特别是对于需要在酵母中建立整条合成途径的情况，往往需要外源整合多个基因，合适整合位点的选择对外源基因的稳定高效表达至关重要。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的上述不足，本发明开发了一种基于crispr/cas9的酵母基因组稳定整合方法，用于构建和稳定维持多基因生物合成途径。
7.本发明首先提供了一种基于crispr/cas9的酵母基因组稳定整合方法，在酵母基因组中整合位点选自以下17个，其中，整合位点对应基因组上的位置为相邻两个基因的基因间区域，整合位点int1位于rpb5和cns1之间；int2位于rib5和pop4之间；int4位于dbf4和cdc34之间；int5位于sec20和lcd1之间；int6位于rsp5和nsa2之间；int7位于ret2和rpn12之间；int9位于ces10和rps31之间；int10位于iri3和pbr1之间；int11位于acc1和tim23之间；int12位于rpo31和rpt5之间；int14位于arp7和gln1之间；int15位于cdc4和smc1之间；int16位于cdc14和ptr3之间；int17位于use1和srm1之间；int18位于erv1和pop6之间；int19位于rpc17和nop9之间；int21位于sen2和mdn1之间。本技术中整合位点int1～int22对应使用的sgrna对应结合到酵母基因组的靶点序列如seq id no.3～24所示。
8.所述基于crispr/cas9的酵母基因组稳定整合方法中使用的酵母菌株可以是常用的用于基因工程的酵母，比如酵母为酿酒酵母。
9.优选的，待整合的为虾青素生物合成途径，整合进酵母基因组中的基因为虾青素生物合成途径基因：crte、crtyb、crti、crtz和crtw，各基因整合位点为：crte基因为int12；crtyb基因为int17；crti基因为nt19；crtz基因为int7；crtw基因为int18。进一步优选的，crte的genbank登录号为cdz97186，crtyb的genbank登录号为aii26676，crti的genbank登录号为atb19150，crtz的genbank登录号为crh37458，crtw的genbank登录号为wp_127898117。一种用于生产虾青素的酵母基因工程菌，使用所述基于crispr/cas9的酵母基因组稳定整合方法制备得到。
10.优选的，待整合的为阿玛碱生物合成途径，整合进酵母基因组中的基因为阿玛碱生物合成途径基因：ges、g8h、gor、isy、io、7-dlgt、7-dlh、lamt、sls、str、sgd和hys，以及辅助途径基因cpr、cyb5、sam2、zwf1、gapn、adh2、gal4和ggps2，各基因整合位点为：cpr和cyb5为int16；ges为int9；g8h为int11；isy和gor为int14；adh2为int12；ggps2为int4；gal4为int10；sls和str为int17；lamt和7-dlgt为int19；io和7-dlh为int7；sgd和hys为int18；zwf1和gapn为int5；sam2为int6。进一步优选的，ges的genbank登录号为afd64744，g8h是genbank登录号为agx93050.1，gor的genbank登录号为kf302069，isy的genbank登录号为ky882236，io的genbank登录号为kf302067，7-dlgt的genbank登录号为kf302068，7-dlh的genbank登录号为kf302067，lamt的genbank登录号为b2kpr3，sls的genbank登录号为l10081.1，str的genbank登录号为x61932，sgd的genbank登录号为aj302044，hys的genbank登录号为ku865325，cpr的genbank登录号为np_001190823，cyb5的genbank登录号为
kp411012，sam2的genbank登录号为np_010790，zwf1的genbank登录号为np_014158，gapn的genbank登录号为wp_002262986，adh2的genbank登录号为kp411010，gal4的genbank登录号为np_015076，ggps2的genbank登录号为af513112。一种用于生产阿玛碱的酵母基因工程菌，使用所述基于crispr/cas9的酵母基因组稳定整合方法制备得到。以简单碳源发酵生产植物次级代谢产物阿玛碱(ajmalicine)的酿酒酵母工程菌，生产阿玛碱的生物合成途径涉及20个异源基因，多轮的异源基因整合和代谢水平的调控，对基因组编辑工具包的效率有较为严格的要求。同时，由于多基因表达往往由相同的启动子和终止子驱动，对整合位点的稳定性也是较为严峻的考验，以保证异源合成途径菌株的稳定性。经多次传代和发酵，利用本发明开发的稳定整合工具包，成功获得了以简单碳源发酵稳定生产阿玛碱的酿酒酵母工程菌。
11.本发明开发的基于crispr/cas9的酵母基因组稳定整合方法，能够实现外源基因的稳定整合，为外源基因在酵母体内的稳定组装提供了有力工具。
附图说明
12.图1为cas9表达载体的质粒图谱。
13.图2为prs426-spsgh-intx的质粒图谱。
14.图3为prs426-mvenus(a)及prs426-ura3(b)的质粒图谱。
15.图4为不同整合位点荧光表达水平。
16.图5为荧光蛋白基因整合到对照组位点及int11的荧光表达水平。
17.图6为prs415-eno2p-crtyb/i/e/w/z-pgk1t的质粒图谱。
18.图7为虾青素合成途径基因检测结果图，每个泳道对应一个位点整合的基因，其中每组5个泳道(int12-17-19-7-18)对应平板上的一个合成虾青素的单菌落。
19.图8为阿玛碱生物合成途径。
20.图9为pesc双基因表达盒的质粒图谱
21.图10为阿玛碱标准品和样品ajm7的色谱图。
22.图11为ajm7样品合成的阿玛碱的质谱图。
具体实施方式
23.实施例1：稳定整合位点的全基因组分析
24.高附加值化合物细胞工厂的构建需要在酵母基因组中插入多个受强启动子控制的基因。如果由相同的启动子驱动，同源重组介导的等位基因替换或基因组重排可能在异源基因之间发生，导致多基因生物合成途径的稳定性低。基于侧翼区域很可能受等位基因替换或基因组重排影响的假设，本发明将异源基因和途径整合到两个必需基因之间的区域中。在这种情况下，任何异源基因表达盒之间的重组都会导致细胞致死。因此，本发明可以稳定地维持酵母染色体中的异源基因和通路。总得来说，理想的整合位点应具备以下特点：1)在两个必需基因之间；2)大于700bp的基因间区长度；3)整合效率高；4)异源基因的高表达水平；5)对细胞适应度的影响最小。
25.本发明在全基因规模上，对必需基因两侧的基因间区域分析潜在的稳定整合位点。根据功能基因组研究，酿酒酵母中约6000个基因中有1156个对富培养基中的细胞生长
至关重要。在这些必需基因中，本发明确定了约210个区域，其中两个或多个必需基因连续定位，这意味着两者之间不存在任何非必需基因。为了尽量减少对转录元件(例如启动子和终止子)的影响以及相应的细胞适应性，本发明过滤掉了那些基因间区域短于700bp的基因，并将潜在整合位点列表缩小到22个以进行实验验证，详细位置信息如表1所示。
26.表1本发明确定的22个稳定整合位点
[0027][0028][0029]
本发明采用cas9表达载体的质粒图谱如图1所示。插入各整合位点对应sgrna的n20后的质粒图谱如图2所示。其中，cas9基因序列如seq id no.1所示，cas9对应的启动子序列如seq no.2所示。各整合位点对应的sgrna对应结合到酵母基因组的靶点序列如seq id no.3～24所示。各整合位点对应的上游通用同源修复引物序列如seq id no.25～46所示；下游通用同源修复引物序列如seq id no.47～68所示。
[0030]
实施例2：选定整合位点的表征和稳定性验证
[0031]
使用crispr/cas9系统，以mvenus表达盒作为报告基因，如图3所示，将mvenus分别整合到本发明初步确定的整合位点中。每个位点挑取32个整合后的单菌落，用scd-leu-ura液体培养基培养(整合位点为int3、int13时，生长缓慢)，生长至饱和后转接50μl至新的培养基，24h后测荧光值，mvenus激发/发射波长498/533；判断插入位点sgrna整合效率(x/32)，以及各位点荧光表达强度。
[0032]
观察转化子的生长状况(如快慢及疏密程度)，整合位点为int8、int20、int22的转化子个数极少，说明对菌株自身代谢有影响，因此排除上述三个整合位点。如图4和5所示，除上述三个位点外，其余17个位点挑取的32个单菌落均有荧光，由此可得100％的整合效率。因此，选择其余17个整合位点进行后续研究。
[0033]
此外，表达水平彼此相当接近(int14达到最高)，并且与先前研究中报道的充分表征的整合位点相当。更重要的是，我们发现整合位点在不同的酿酒酵母菌株中高度保守。例
如，尽管酿酒酵母by4741和cen.pk2具有相对多样化的基因组序列，但grna靶向序列完全相同，这可能是由于必需基因和基因间区域的高度保守性。
[0034]
进一步，本发明验证了新确定的整合位点的稳定性，之前报告的整合位点作为对照。如图3所示，当我们整合mvenus和ura3表达盒时，它们都在启动子tdh3和终止子cyc1的控制下，同源重组介导的等位基因替换会导致ura3表达盒的丢失，得到的菌株能够在添加5-氟乳清酸(5-foa)琼脂板上生长。因此，我们可以通过在scd/5-foa琼脂板(每100ml的scd培养基中加入0.1g 5-foa)上生长的能力来评估整合到基因组中的异源基因表达盒的稳定性。实验组和对照组ura3的丢失率如表2所示。没有任何菌落表明整合到两侧为必需基因(int4和int11)的基因组基因座中的异源基因表达盒是高度稳定的。相反，当整合到三个前人报道过的基因组位点(yprcδ15c、xii-1和xii-4)时，可以检测到不少数量的克隆，说明存在基因组不稳定导致ura3表达盒丢失的情况。根据实验估算，前人报道的基因组位点(yprcδ15c、xii-1和xii-4)均存在不稳定的情况，平均丢失率大约为10-5
到10-4
，而本发明的所表征的位点，没有存在表达盒丢失的情况，进一步证明了本发明开发的位点的稳定性。
[0035]
表2本发明开发的整合位点和以前报道的整合位点的稳定性测试
[0036][0037][0038]
实施例3：稳定整合工具包在多基因虾青素合成途径中的应用
[0039]
为了进一步证明这些新发现的整合位点在构建多基因生物合成途径中的应用，虾青素生物合成途径基因crte(genbank登录号为cdz97186)、crtyb(genbank登录号为aii26676)、crti(genbank登录号为atb19150)、crtz(genbank登录号为crh37458)和crtw(genbank登录号为wp_127898117)，如图6所示，均受启动子eno2和终止子pgk1控制，利用所构建的整合工具包，将上述基因整合到本技术所开发的位点上，具体的整合信息如表3所示。
[0040]
表3虾青素合成途径基因整合到基因组上对应的位点信息
[0041]
基因整合位点crteint12crtybint17crtiint19crtzint7crtwint18
[0042]
能够将其高效整合到酵母基因组中，如图7所示。在非选择性培养基中连续转移5次后，所有菌落均出现橙色至红色和阳性诊断pcr条带(图7)，这证实了5个异源基因表达盒虽然都在相同的启动子和终止子的控制下，但稳定维持在酵母基因组中。
[0043]
实施例4：利用稳定整合工具包构建从头合成阿玛碱的酵母工程菌
[0044]
阿玛碱临床上被广泛用于治疗高血压、心率不齐、哮喘等疾病，其生物合成途径为牻牛儿基焦磷酸(gpp)在ges(genbank登录号为afd64744)、g8h(genbank登录号为agx93050.1)、gor(genbank登录号为kf302069)、isy(genbank登录号为ky882236)、io(genbank登录号为kf302067)、7-dlgt(genbank登录号为kf302068)、7-dlh(genbank登录号为kf302067)、lamt(genbank登录号为b2kpr3)、sls(genbank登录号为l10081.1)作用下生产断马钱子苷，断马钱子苷与色胺在str(genbank登录号为x61932)作用下生产异胡豆苷(strictosidine)，异胡豆苷在sgd(genbank登录号为aj302044)和hys(genbank登录号为ku865325)两个酶作用下生成阿玛碱(生物合成途径如图8所示)。阿玛碱具有重要应用价值的mias类天然产物，其工程菌构建存在的主要问题是生物合成途径长导致工程菌不稳定。将上述生物合成途径对应的基因整合到本发明开发的稳定整合位点中，包括辅助途径基因cpr(genbank登录号为np_001190823)、cyb5(genbank登录号为kp411012)、sam2(genbank登录号为np_010790)、zwf1(genbank登录号为np_014158)、gapn(genbank登录号为wp_002262986)、adh2(genbank登录号为kp411010)、gal4(genbank登录号为np_015076)、ggps2(genbank登录号为af513112)，详细的整合信息如表4所示。
[0045]
其中int16、int14、int17、int19、int7、int18、int5位点利用pesc质粒的双基因表达盒(启动子gal1-目的基因-终止子cyc1和启动子gal10-目的基因-终止子adh1)，如图9所示，实现一个位点分别整合两个基因。
[0046]
表4途径基因对应的整合位点
[0047]
基因整合位点cpr和cyb5int16gesint9g8hint11isy和gorint14adh2int12ggps2int4gal4int10sls和strint17lamt和7-dlgtint19io和7-dlhint7sgd和hysint18zwf1和gapnint5sam2int6
[0048]
实施例5：阿玛碱底盘菌发酵及产物检测
[0049]
挑取单菌落(ajm7)，接种到含3ml ypd培养基的试管中，在250rpm、30℃的摇床中培养24h左右；接种到含有20ml ypd 2％葡萄糖培养基的250ml摇瓶中，30℃、250rpm的摇床上培养24h左右，离心后将菌体用ypd 2％半乳糖培养基重悬后继续24℃、250rpm的摇床上继续培养7天，每组样品3个重复。
[0050]
样品处理及lcms检测发酵产物：发酵结束后离心收集发酵液，吸取10ml发酵冷冻干燥后，1ml蒸馏水复溶后加入1ml乙酸乙酯萃取2次，0.22μm有机微孔滤膜过滤后置于进样
瓶中。采用hplc-ms-esi离子源对阿玛碱进行定量检测，其中色谱条件：thermo scientific hypuritytm c18 hplc column(150mm
×
4.6mm,3μm)；岛津lc-ms 8045：按色谱条件进行含量测定流动相为0.1％甲酸水(a)，甲醇(b)，梯度洗脱：0～20分钟，60％a～2％a；20～40分钟，2％a～60％a，流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样量为4μl检测波长420nm。ms条件为：scan m/z 50-800；阿玛碱标准品在lc-ms中mrm检测条件为[m-h]

m/z：354/144.20，ce＝-25v(dl温度250℃，喷雾电压为1.8kv，雾化气体流量为6l/min。ajm7的色谱和质谱结果分别如图10和图11所示。ajm7经多次传代发酵液中成功检测到目标产物，阿玛碱、表阿玛碱和四氢鸭脚木碱三种物质统称为异育亨宾生物碱，总产量达715.2mg/l；其中，阿玛碱的产量为368.4mg/l，表阿玛碱的产量为179.2mg/l，四氢鸭脚木碱的产量为167.6mg/l。