拮抗菌株JYC314及其应用

collection center,cgmcc))，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为cgmcc no.24047，保藏日期为 2021年12月06日。
8.本发明提供了该拮抗菌株jyc 314在防治植物病害中的应用；植物病害为马铃薯的晚疫病或疮痂病。
9.本发明提供了该拮抗菌株jyc 314在制备植物病害或病原菌抑制剂中的应用；病原菌为疮痂链霉菌或致病疫霉菌；所述植物病害为马铃薯的晚疫病或疮痂病。
10.本发明还提供了一种病原菌抑制剂，包含该拮抗菌株jyc 314和/或拮抗菌株jyc 314的菌液。
11.本发明的有益效果：
12.本发明从马铃薯疮痂病发病较重的田块中健康植株的根际土壤中取样分离拮抗菌株，通过平板对峙法和纸片法筛选并验证拮抗菌株，主要从形态学、生理生化和分子生物学的角度对所获拮抗菌株进行鉴定，旨在为马铃薯疮痂病和晚疫病的防治提供新的生防资源。该拮抗菌株jyc 314可显著抑制多种疮痂链霉菌和致病疫霉菌生长，能有效防治马铃薯疮痂病和晚疫病。
附图说明
13.图1是菌株jyc 314对马铃薯疮痂链霉菌的抑制效果-平板对峙试验；
14.图2是菌株jyc 314对马铃薯晚疫病病菌的抑制效果-平板对峙试验；
15.图3是菌株jyc 314基于16srdna序列构建的系统发育进化树；
16.图4是菌株jyc 314菌悬液对多种马铃薯疮痂病链霉菌的抑制效果-纸片法；
17.图5是菌株jyc 314对多种致病疫霉菌生长的抑制效果—菌丝重量法；
18.图6是菌株jyc 314形态学鉴定；
19.图7是菌株jyc 314的生理生化测定-糖酵解试验；a：对照；b：拮抗菌株jyc 314；
20.图8是菌株jyc 314的生理生化测定-大分子物质的水解试验；a：对照；b：拮抗菌株jyc 314；
21.图9是菌株jyc 314的生理生化测定-imvic试验；a：对照；b：拮抗菌株jyc 314。
具体实施方式
22.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
23.实施例1：马铃薯疮痂病拮抗菌株jyc 314的分离与纯化
24.1.土样采集
25.从云南的马铃薯疮痂病发病田块中采集健康植株的根际土壤，采集深度为10-20cm，用无菌自封袋密封好后带回实验室，保存于4℃冰箱，用于拮抗菌株的分离。
26.2.供试靶标病原微生物
27.3株马铃薯疮痂链霉菌(s.scabies、s.acidiscabies、s.turigidiscabies)，3株马铃薯晚疫病菌(p.infestans)，菌株编号及生理小种类型分别为snk-q9(1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11)、dq-1(1.2.3.4.5.10)、ml-s13-418 (1.2.4.5.6.10)，上述菌株均由云南农业大学植物保护学院马铃薯病害研究室提供。
28.3.供试培养基
29.疮痂链霉菌培养采用高氏一号培养基或燕麦琼脂培养基，细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基。致病疫霉菌采用黑麦番茄培养基培养。具体培养基配方如下：
30.燕麦琼脂培养基(oma)：20g燕麦片、20g琼脂条、水1000ml，ph7.2-7.4；
31.牛肉膏蛋白胨培养基(na)：3g牛肉膏、10g蛋白胨、水1000ml，20g琼脂条，ph7.4-7.6；
32.黑麦番茄培养基：70g黑麦、150m番茄汁、水850ml、1.2g碳酸钙、17g琼脂条，自然ph；
33.4.拮抗菌株jyc 314的分离和纯化
34.采用热处理土壤稀释分离法分离菌株，挑取单菌落菌株划线培养，连续纯化3次，以1:1混合于70％的甘油中，-80℃冰箱保存备用。
35.5.oma培养基的制备：按照上述培养基配方称取各物质后，将琼脂条和燕麦片各放入400ml水中浸泡 30min，利用果汁机将燕麦片打碎后和琼脂条一起加热煮沸，待培养基冷却后，1％氢氧化钠溶液调节培养基ph为7.2-7.4，分装于2个1000ml三角瓶中，每瓶500ml，密封好后放入高压灭菌锅中于121℃灭菌30min，待气压降至0mpa时，再灭菌一次，将培养基倒入90mm培养平板，超净工作台冷却吹干备用。
36.6.链霉菌菌悬液的制备：吸取本实验室保存的链霉菌菌株菌悬液于oma培养基平板表面，无菌金属涂布器均匀涂抹，封口膜密封后将其倒置于微生物培养箱，28℃暗培养7-10天，待培养基表面长满疮痂链霉菌后，于超净工作台上往培养皿中加入2ml无菌水，利用无菌刮铲将链霉菌从培养基表面刮下，移液枪吸取皿内液体冲刷培养基表面2-3次，将皿内液体转移至5ml无菌离心管中备用。
37.7.拮抗菌株的筛选
38.采用平板对峙培养法初步测定菌株jyc 314对马铃薯疮痂链霉菌的拮抗作用。具体操作方法为：将纯化的菌株jyc 314接种于涂有疮痂链霉菌菌悬液的燕麦琼脂培养基平板，封口膜密封后放置于28℃培养箱中暗培养7天，以只接种疮痂链霉菌菌悬液的oma平板为对照，培养时间截止时，根据培养基平板是否出现抑菌圈及抑菌圈大小来筛选出抑菌效果较好的菌株；平板对峙培养法结果表明，对照培养基中3种疮痂链霉菌均能够在燕麦琼脂培养基中正常生长并能布满整个培养基表面，没有出现抑菌圈；而接种jyc 314 菌株的培养基表面均出现了抑菌圈，说明菌株jyc 314均能抑制疮痂链霉菌s.turigidiscabies、s.acidiscabies、 s.scabies的生长，对3种疮痂链霉菌具有抑制性(图1)。
39.采用平板对峙培养法测定菌株jyc 314对致病疫霉菌的拮抗作用，使用无菌打孔器分别在长满含有致病疫霉菌菌丝的黑麦番茄培养基平板和单独的黑麦番茄培养基平板上进行打孔，将含有致病疫霉菌丝的菌饼倒扣于黑麦培养基平板中央的小孔内，将待测菌株的菌体挑至含有致病疫霉菌菌饼的黑麦番茄培养基平板上，放置于20℃微生物培养箱中暗培养7-10天，培养结束时，采用十字交叉测量法测定菌落生长直径。平板对峙培养结果显示，对照培养基中致病疫霉均能够正常生长并能长满整个黑麦番茄培养基平板，菌落生长直径为56.19mm，3点接种和4点接种法的致病疫霉菌落生长直径分别为14.27mm、0mm，与对照相比均有显著性差异(p《0.05)，说明菌株jyc 314对致病疫霉菌的生长具有显著的抑制作用(表1、图2)。
40.表1菌株jyc 314对马铃薯晚疫病病菌的抑制效果
[0041][0042]
注：表中小写字母表示0.05水平下的差异显著性
[0043]
综上所述，根据平板对峙培养的结果，获得了一株对马铃薯疮痂链霉菌和致病疫霉菌生长有抑制作用的菌株，将其命名为jyc 314。
[0044]
实施例2：拮抗菌株jyc 314的分子生物学鉴定
[0045]
1.细菌基因组dna的提取
[0046]
将实施例1制备并挑取纯化培养的菌株jyc314单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养平板上，28℃暗培养120小时后，采用上海生工ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取菌株jyc314的基因组dna，具体步骤如下：
[0047]
(1)取0.5ml-1ml过夜培养的细菌菌液，加入到1.5ml离心管中，室温8000rpm，离心1min，弃上清，手机菌体。加入100微升bufferdigestion和80微升20mg/ml溶菌酶溶液，37℃水浴30min，水浴完成后加入20微升的proteinase k溶液，震荡混匀。56℃水浴30min，至细胞完全裂解。水浴后加入20微升的 10mg/ml rnasea溶液，室温放置2-5min，
[0048]
(2)加入200微升的bufferbd，充分颠倒混匀，70℃水浴10min。
[0049]
(3)加入200微升的无水乙醇，充分颠倒混匀。
[0050]
(4)将吸附柱放入收集管中，用移液枪将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
[0051]
(5)将吸附柱放入收集管中，加入500微升的pw solution，10000rpm离心30s倒掉滤液；
[0052]
(6)将吸附柱放入收集管中，加入500微升的wash solution，10000rpm离心30s倒掉滤液；
[0053]
(7)将吸附柱放入收集管中，加入500微升的pw solution，于12000rpm离心2min倒掉滤液；
[0054]
(8)取出吸附柱，放入1个新的1.5ml离心管中，加入50-100微升的ce buffer静置3min，12000rpm 离心2min，收集dna溶液。提取的dna放置-20℃保存。
[0055]
2.16srdna序列的扩增
[0056]
以菌株jyc 314基因组dna为模板，利用通用引物27f(5
′‑
agtttgatcmtggctcag-3
′
)和 1492r(5
′‑
ggttaccttgttacgactt-3
′
)扩增菌株jyc 314的16srdna。pcr扩增条件为预变性 94℃/4min，变性94℃/45s，退火55℃/45s，延伸72℃/1min，循环30次，最后延伸72℃/10min。pcr反应体系如下：
[0057]
表2 pcr反应体系
[0058][0059]
pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明能够获得一条明亮的条带，获得大约1500bp左右的扩增产物，电泳条带回收后再使用上述引物对上述扩增基因片段进行测序，测序工作交由上海生工生物工程有限公司完成，测得该菌株的16srdna的核苷酸序列长度为1429bp，16srdna基因测序结果如下：
[0060]
atggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaagggagcttgctcctggattcagcggcggacg ggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgtccggaaacgggcgctaataccgcatacgtcctgagggagaaagtggg ggatcttcggacctcacgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccgtaactgg tctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaag cctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgct gttttgacgttaccaacagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaattactg ggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcagcaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactactgagctagagt acggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgat actgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgactagccgttgggat ccttgagatcttagtggcgcagctaacgcgataagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggc ccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgctgagaactttccagagatggat tggtgccttcgggaactcagacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaac ccttgtccttagttaccagcacctcgggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatc atggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccga tcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccg ggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagctagtctaaccgcaa
[0061]
将测序结果输入至美国国家生物技术信息中心(ncbi)数据库中，使用blast软件在genbank中与其他的16srdna序列进行同源性比较，结果显示菌株jyc 314的16srdna序列与铜绿假单胞菌的多个菌株的16srdna序列完全吻合。选择相近的序列与菌株jyc 314的序列，使用系统分化分析软件mega7.0 以邻接法(neighbor-joining method)构建系统发育进化树(图3)，结果显示菌株jyc 314与铜绿单胞菌聚(pseudomonas aeruginosa strain s-04 mt626658.1)在同一系统进化分支，进化关系最近，同源性达到 99.31％，初步判断该
菌株jyc 314为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)。
[0062]
实施例3：拮抗菌株jyc 314菌悬液对马铃薯疮痂链霉菌生长的影响
[0063]
1.材料与方法
[0064]
供试材料：
[0065]
供试菌株：s.scabies、s.acidiscabies、s.turigidiscabies；
[0066]
其他材料：18mm定性圆形滤纸片、金属涂布棒、90mm培养皿、封口膜、移液枪、离心管、无菌水、果汁机、金属刮铲、金属镊子、数显式游标卡尺；
[0067]
试验方法：
[0068]
oma培养基和链霉菌菌悬液的制备方法同实施例1。
[0069]
拮抗菌株菌悬液的制备：无菌枪头挑取已经纯化的拮抗菌株于含有1ml无菌水的5ml无菌离心管中，使用震荡混匀器涡旋震荡30s后备用。
[0070]
采用纸片法开展疮痂链霉菌抑制试验：吸取100μl链霉菌菌悬液于oma培养基平板，使用无菌金属涂布棒将其涂抹均匀，无菌镊子夹取无菌滤纸片将其放置于培养平板中央，并沿周边轻按滤纸片，使其紧贴于培养基表面，移液枪吸取50μl待测菌株菌悬液，缓慢释放于滤纸片，待纸片表面晾干后，封口膜密封后将其放置微生物培养箱，28℃暗培养7-10天，以在涂有疮痂链霉菌菌悬液的oma培养基平板上接种无菌水和放置滤纸片作为对照，培养时间截止后，采用十字交叉测量法测定抑菌圈直径。
[0071]
2.结果与分析
[0072]
采用抑菌圈法再次检测菌株jyc 314对3种马铃薯疮痂链霉菌s.turigidiscabies、s.acidiscabies和 s.scabies的抑制性。结果表明：测定结果为对照1和对照2均能长满培养基表面，没有出现抑菌圈。加入待测菌株jyc 314菌悬液的培养基表面出现了抑菌圈，抑菌圈直径分别为27.75mm、27.50mm、38.66mm，且与对照(0mm)相比均有显著性差异(p《0.05)，说明菌株jyc 314能够显著抑制疮痂病原菌s.scabies、 s.turigidiscabies、s.acidiscabies、的生长，对s.scabies的抑制效果最明显。(图4)
[0073]
表3菌株jyc 314对马铃薯疮痂病原菌生长的影响
[0074][0075][0076]
注：表中小写字母表示0.05水平下的差异显著性
[0077]
实施例4：拮抗菌株jyc 314对多种马铃薯致病疫霉菌生长的影响
[0078]
1.材料与方法
[0079]
供试致病疫霉菌菌株编号及生理小种类型：snk-q9(1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11)、dq-1(1.2.3.4.5.10)、ml-s13-418(1.2.4.5.6.10)。
[0080]
其他材料：耙式竹签、5mm打孔器、90mm培养皿、封口膜、万分之一天平。
[0081]
试验方法:
[0082]
黑麦番茄培养基制备方法同实施例1。
[0083]
采用平板对峙培养法测定菌株jyc 314对致病疫霉菌的拮抗作用。具体操作方法为：使用无菌打孔器分别在长满含有致病疫霉菌菌丝的黑麦番茄培养基平板和单独的黑麦番茄培养基平板上进行打孔，将含有致病疫霉菌丝的菌饼倒扣于黑麦培养基平板中央的小孔内，将待测菌株的菌体挑至含有致病疫霉菌菌饼的黑麦番茄培养基平板上，放置于20℃微生物培养箱中暗培养7-10天，培养结束时，采用耙式竹签将培养皿中的致病疫霉菌菌丝从黑麦番茄培养基表面剥离，放置万分之一天平进行称重，以菌丝重量作为衡量菌丝生长的指标。
[0084]
2.结果与分析
[0085]
测定在菌株jyc 314胁迫下ml-s13-418、dq-1、snk-q93个致病疫霉菌菌丝的重量。结果表明，对照培养中3个菌株均能够正常生长，菌丝重量分别为0.0169g、0.0488g、0.0618g，而接种有菌株jyc 314 的培养基中，ml-s13-418、dq-1、snk-q9菌丝重量均显著低于对照(p《0.05)，说明在菌株jyc 314的胁迫下，菌丝生长均受到了显著抑制，且随着jyc 314接种量的增加，菌丝生长抑制愈加明显。
[0086]
表4菌株jyc314对马铃薯晚疫病病菌菌丝生长量的影响
[0087][0088][0089]
注：表中小写字母表示0.05水平下的差异显著性
[0090]
实施例5：拮抗菌株jyc 314形态学鉴定
[0091]
挑取分离纯化的jyc 314菌株单菌落划线于牛肉膏蛋白胨培养基上培养48小时后，观察菌落的形态特征，同时利用革兰氏染色法确定该菌的细胞壁类型。形态观察结果为菌株jyc 314在牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好，菌落呈现乳白色或灰白色，圆形光滑湿润、中央隆起、边缘不整齐，菌体为杆状，大小为 0.6-0.8μm
×
2.0-5.0μm，革兰氏染色阳性，产芽孢，好氧或兼性厌氧生长。菌落周围呈淡绿色，随培养时间延长绿色加深，后期转为紫色或褐色(图6)。
[0092]
实施例6：拮抗菌株jyc 314生理生化测定结果
[0093]
参见《常见细菌系统鉴定手册》对其菌体进行糖类发酵、明胶液化试验、硫化氢产生试验、淀粉水解试验、甲基红试验、vp试验、吲哚产生试验、牛奶石蕊试验、柠檬酸盐利用试验、脲酶产生试验等生理生化指标的测定。生理生化测定结果表明菌株jyc 314可分解葡萄糖产酸、产生明胶酶分解明胶、可利用柠檬酸盐，可产生h2s气体，牛奶石蕊试验结果为阳性；菌株jyc 314不降解乳糖，不水解淀粉，不产生脲酶分解尿素，甲基红试验、吲哚产生试验、vp试验结果均为阴性(见表5、图7-9)。
[0094]
表5拮抗菌株jyc314的生理生化特征
[0095][0096][0097]
注：表中“ ”表示阳性结果；
“‑”
表示阴性结果。
[0098]
综上所述，根据菌株jyc 31416srdna序列分析、形态特征、生理生化特性，结合《常见细菌系统鉴定手册》判断该菌株jyc 314属于铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)，且该菌株对多种马铃薯疮痂链霉菌和致病疫霉菌具有显著的抑制作用，可有效防治马铃薯疮痂病和晚疫病。
[0099]
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。