一种人脑胶质瘤细胞系及其构建原位移植模型的方法和应用

1.本发明属于实验动物技术领域，涉及人脑胶质瘤小型猪原位移植模型的建立，具体涉及一种人脑胶质瘤细胞系及其构建原位移植模型的方法和应用。


背景技术：

2.胶质瘤是最常见的恶性脑肿瘤，占恶性原发性中枢神经系统(cns)肿瘤的80％。恶性脑胶质瘤的治疗是一个世界性难题，其治疗效果差的关键问题在于恶性的胶质细胞瘤细胞分化不全且深入神经细胞深处，手术不可能全部切除。研究表明,尽管恶性脑胶质瘤中心坏死组织的血脑屏障(blood-brain-barrier, bbb)已遭破坏，但肿瘤边缘部分bbb仍完整。bbb的存在使药物利用率降低,影响了化疗药物的疗效，故恶性脑胶质瘤复发率极高，预后最差的是多形性胶质母细胞瘤(gbm)，其中位生存时间为14.6个月，只有26.5％的患者存活持续2年。神经胶质瘤的浸润性不可避免地导致所有肿瘤细胞的手术切除不完全，迫切需要更有效的肿瘤特异性疗法。因此，建立有效、稳定的脑胶质瘤动物模型对其治疗研究具有重要意义。
3.通常建立肿瘤移植模型的方法是采用小鼠或者大鼠来源的细胞系进行原位移植或者选取裸鼠移植人的肿瘤细胞。前者的鼠源性细胞系与人体存在很大差别，后者裸鼠体型较小并且生存期短，在建立模型之后进行肿瘤干预性治疗窗口期短，动物实验操作和饲养要求严格。既往的研究成果是以大、小鼠为实验对象获得的，而人体脑组织结构和颅骨厚度与小动物相比差异较大，故不能将其效应及参数推及到人。
4.小型猪体型适中，与人体较为接近，猪在解剖、组织和生理生化等许多生物学指标上与人类非常相似，被认为是研究人类疾病最合适的实验动物模型，特别在肿瘤相关的代谢、影像和治疗研究的理想动物模型。在肿瘤动物模型方面，小型猪的应用相对较少，目前国内外报道主要集中皮肤和色素瘤模型，不同来源和遗传背景的小型猪可自发皮肤黑色素瘤。但该类模型发生比率不宜控制，时间长，个体差异大，短期内很难获取大量肿瘤学资料。为此，越来愈多的研究关注小型猪的异种移植模型。同时，建立小型猪人胶质瘤异种移植模型，还必须解决猪本身对人体组织细胞的免疫排斥反应问题，即必须选择合适的免疫抑制剂确定相应的剂量，使其能够通过bbb达到免疫抑制的效果，也能确保动物长期存活。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人脑胶质瘤细胞系及其构建原位移植模型的方法和应用。
6.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
7.本发明公开了一种人脑胶质瘤细胞系，该人脑胶质瘤细胞系命名为人脑胶质瘤细胞glioma-rp，于2021年11月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c202179。
8.本发明还公开了上述的人脑胶质瘤细胞系的子代细胞系。
9.本发明还公开了上述的人脑胶质瘤细胞系或子代细胞系在制备人脑胶质瘤的细胞/动物模型中的应用。
10.本发明还公开了上述的人脑胶质瘤细胞系或子代细胞系在研究人脑胶质瘤发生、发展、转移机理中的应用。
11.本发明还公开了上述的人脑胶质瘤细胞系或子代细胞系在筛选治疗人脑胶质瘤的药物中的应用。
12.本发明还公开了上述的人脑胶质瘤细胞系或子代细胞系在研究人脑胶质瘤的耐药机理中的应用。
13.本发明公开了上述的人脑胶质瘤细胞系的建立方法，包括以下步骤：
14.1)获得新鲜的人脑胶质瘤切除标本，切成小块，接种裸鼠成瘤；
15.2)将瘤组织原位移植经过免疫抑制剂处理的小型猪的大脑，形成胶质瘤；
16.3)处死荷瘤动物，取出肿瘤组织，癌细胞培养，获得特性稳定的人脑胶质瘤细胞系glioma-rp。
17.优选地，收集对数生长期的人胶质瘤细胞u87(1
×
106)移植于裸鼠皮下，待形成肉眼可见肿瘤后备用。选择体重约为10-15kg的小型猪，联合口服环孢素软胶囊(20mg/kg)和他克莫司胶囊(0.01mg/kg)，三天后，取裸鼠皮下新鲜的肿瘤组织，将其修剪为1mm3小组织块，原位移植于免疫抑制剂处理的小型猪大脑纹状体。持续使用免疫抑制剂21天，待动物明显消瘦后，磁共振检测发现脑部占位性病变，确认肿瘤发生的部位，肿瘤生长到1cm以上时，观察小型猪神经行为症状。
18.处死动物并解剖，取肉眼可见肿瘤组织进行原代培养。将经过猪体内筛选的肿瘤细胞注射免疫抑制剂处理的猪(大脑纹状体)，术后持续使用免疫抑制剂处理，待小型猪明显消瘦后，核磁共振检测确认肿瘤的发生，处死动物并解剖，取肉眼可见肿瘤组织固定，he染色确认肿瘤的组织形态，gfap免疫组化检测确定其胶质瘤特征，人特异性线粒体检测确定其人源性特征。
19.优选地，所述免疫抑制剂为环孢素和他克莫司联合的免疫抑制剂，用量用法为：小型猪在移植肿瘤组织前3天，开始联合口服免疫抑制剂环孢素软胶囊 20mg/kg和他克莫司胶囊0.01mg/kg，直至原位移植后3周。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.本发明首次公开了人脑胶质瘤细胞glioma-rp，于2021年11月2日将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c202179。该人脑胶质瘤细胞glioma-rp能够大量扩增，细胞性状稳定，能够在体外传代培养，且可以稳定多次传代。
22.本发明公开的人脑胶质瘤小型猪移植模型是将人胶质瘤细胞系移植于裸鼠形成实体瘤后进行组织块移植，避免直接使用人的肿瘤细胞移植小型猪，会因为小型猪自身的免疫反应将人肿瘤细胞排斥；同时进一步通过体内筛选获取适应猪体内生长的胶质瘤细胞，从而，提升肿瘤的异种移植成功率。
23.联合使用环孢素软胶囊和他克莫司胶囊，并摸索相应的使用剂量(剂量分别为20mg/kg和0.01mg/kg)和使用的时机(移植肿瘤组织前3天)，造成小型猪体内免疫功能急剧下降，容易接受人胶质瘤组织，在脑部形成实体瘤。
24.经过大量的验证和评估，在模型创建方式上进行了不断探索：一是通过将人胶质
瘤细胞移植裸鼠，获得肿瘤组织，进一步通过移植肿瘤组织建立小型猪脑胶质瘤原位移植模型；二是经过体内筛选，将适合猪体内生长的胶质瘤组织进行体外培养，获得可以移植成瘤的细胞系；三是建立了完善的移植手术方案，确保术后小型猪的存活；四是明确了免疫抑制剂的种类和剂量，确定了环孢素软胶囊和他克莫司胶囊两种免疫抑制剂联合使用。
25.生物保藏
26.本发明的人脑胶质瘤细胞系，命名为人脑胶质瘤细胞glioma-rp，于2021 年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为cctcc no：c202179。
附图说明
27.图1为本发明使用人脑胶质瘤u87细胞移植裸鼠后形成的实体瘤相关实验结果；其中，a为人脑胶质瘤u87细胞遗传学str分型鉴定结果；b为人脑胶质瘤u87细胞裸鼠皮下移植模型；c为人脑胶质瘤u87细胞裸鼠皮下移植he 染色结果；
28.图2为u87肿瘤组织移植小型猪的手术过程照片；
29.图3为本发明制备的人脑胶质瘤u87小型猪皮下移植瘤组织结构he染色结果；
30.图4为u87肿瘤组织移植小型猪3周后的核磁检测结果；
31.图5为u87肿瘤组织移植小型猪3周后脑组织肿瘤大体观；其中，其中，a为正常的猪脑照片；b为成瘤后的猪脑照片；
32.图6为u87肿瘤组织移植小型猪3周后脑组织肿瘤he染色结果；
33.图7为u87肿瘤组织移植小型猪3周后脑组织人线粒体染色结果；
34.图8为u87肿瘤组织移植小型猪3周后脑组织gfap染色结果；
35.图9为小型猪脑形成的胶质瘤组织原代培养细胞形态(he染色)；
36.图10为原代培养细胞移植到免疫抑制的小型猪大脑后形成的肿瘤；
37.图11为小型猪注射glioma-rp细胞形成的胶质瘤模型核磁检测结果；其中，a和b分别为小型猪不同体位核磁扫描图像。
具体实施方式
38.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
39.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
40.下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
41.本发明的目的是通过移植人脑胶质瘤细胞u87建立裸鼠移植模型，成瘤后进一步将该肿瘤组织原位移植于小型猪大脑纹状体，该小型猪是联合口服环孢素软胶囊和他克莫司胶囊进行免疫抑制处理。移植后3周左右，核磁共振检测，脑部肿瘤发生率可达70％。脑部组织结构病理分析确认为胶质瘤的形态，人特异性线粒体在脑肿瘤组织中呈阳性表达，确认肿瘤的人源性特征。进一步将将小型猪大脑形成的胶质瘤组织原代培养，获得肿瘤细胞系glioma-rp移植到处于免疫抑制状态的小型猪大脑，3周后成瘤率可达到85％以上。
42.建立小型猪人胶质瘤异种移植模型，最重要的是解决猪本身对人体组织细胞的免疫排斥反应。即必须选择合适的免疫抑制剂确定相应的剂量，使其能够通过bbb达到免疫抑制的效果，也能确保动物长期存活。
43.环孢霉素a(csa)和他克莫司均是临床常用的免疫抑制剂，多用于器官移植和自身免疫疾病。csa主要是通过选择性抑制t淋巴细胞活化而发挥免疫抑制作用。抑制淋巴细胞在抗原活着分裂原刺激下的分化、增殖，阻断淋巴细胞生长周期使其停滞在g0或者g1期，导致il-2分泌受到抑制，同时通过抑制 t淋巴细胞和促炎因子进而影响巨噬细胞产生和释放il-1，进而达到免疫抑制的效果。
44.他克莫司主要通过抑制il-2的释放，全面抑制t淋巴细胞的作用，从而达到免疫水平的抑制。结合我们的实验探索，发现csa和他克莫司联合用药能起到更好的免疫抑制效果。
45.本实验设计他克莫司和环孢霉素联合用药进行免疫抑制。结果表明小型猪体重变化一定程度上反应了免疫抑制剂的药效，联合用药组体重增长最慢，同时肿瘤移植成功率达到90％。
46.相比于肿瘤细胞系移植模型，通过将在免疫缺陷裸鼠体内形成的肿瘤组织进行移植不仅可以较好地保持瘤组织的结构和微环境，而且有利于肿瘤的生长，有效提高异种移植的成功率。同时，直接移植分散的人体肿瘤细胞，很容易被猪(免疫抑制剂处理)体内残存的免疫系统一一排斥；而移植的肿瘤组织，已经形成完整的结构且细胞成分复杂，猪(免疫抑制剂处理)体内的免疫体统很难排斥完整肿瘤组织；同时进一步通过体内筛选获取适应猪体内生长的胶质瘤细胞，从而有利于肿瘤细胞在猪体内的存活，提高肿瘤异种移植的成功率。
47.胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，gfap)是一种ⅲ型中间丝状蛋白，是星形胶质细胞活化的标志物，在鉴别胶质瘤是否来源于星型细胞的诊断上具有重要作用。长期以来，研究者将gfap表达水平作为胶质瘤细胞分化的最可靠标志。正常的星形胶质细胞高表达，而恶性程度高的肿瘤细胞一般会表达较少。gfap的高表达与胶质瘤细胞的恶性表型转化及肿瘤的进展相关，而gfap的表达上调可以促进胶质瘤的分化，恶性程度降低。
48.据此，本研究首先将人胶质瘤细胞u87移植免疫缺陷裸鼠，获得移植肿瘤组织备用；选择与人体结构相似的小型猪为实验对象，联合口服环孢霉素a软胶囊(20mg/kg)和他克莫司胶囊(0.01mg/kg)，三天后手术移植，取人胶质瘤裸鼠皮下肿瘤组织，将其修剪为1mm3组织块，移植于免疫抑制剂处理的小型猪，移部位为猪大脑纹状体(中线右侧1厘米，枕骨顶前方3厘米处颅转开孔，孔径1.2mm，避免触及硬脑膜)。术后持续使用免疫抑制剂处理
21天，待小型猪明显消瘦后，核磁共振检测确认肿瘤的发生。
49.处死动物并解剖，取肿瘤组织进行胰酶和edta联合消化后，获得原代培养的肿瘤细胞。将肿瘤细胞注射免疫抑制剂处理的猪大脑纹状体，术后持续使用免疫抑制剂处理21天，待小型猪明显消瘦后，核磁共振检测确认肿瘤的发生，处死动物并解剖，取肉眼可见肿瘤组织固定，he染色确认肿瘤的组织形态， gfap免疫组化检测确定其胶质瘤特征，人特异性线粒体检测确定其人源性特征。
50.1.肿瘤细胞溯源性检测及裸鼠皮下移植模型建立
51.将人脑胶质瘤细胞u87进行str分型，确认u87肿瘤的遗传特性。检测结果如图1中a所示，结果显示所选择的16个基因座均检测到信号，原发瘤和肺转移瘤同源性为99.99％，确认该肿瘤组织为人源性。
52.人脑胶质瘤肿瘤细胞用rpmi1640培养基、10％胎牛血清正常培养；接种前进行胰酶消化、pbs冲洗、培养基重悬，定量到106数量级。收集对数生长期的人胶质瘤细胞u87，皮下接种裸鼠(6-8周龄，雄性)，剂量为106/100μl，待形成肉眼可见的肿瘤后备用(如图1中b所示)，同时取部分肿瘤组织4％多聚甲醛固定后，石蜡包埋切片he染色确认其胶质瘤组织形态，结果如图1中 c所示。
53.2.免疫抑制剂的选择和使用
54.尝试选用两种免疫抑制剂对小型猪进行处理，分别为环孢霉素a软胶囊 (新赛斯平)和他克莫司胶囊(普乐可复)。环孢霉素a软胶囊主要用于临床预防异体移植物的排斥反应，常用于肾、肝、心、肺、以及胰腺移植等。临床上使用剂量为10-15mg/kg/天，两次给药，该剂量维持至术后1-2周。本发明结合临床用药剂量和实验动物的表观反映，进行多个浓度批次的摸索。在使用高剂量时，先后出现部分动物死亡，或表现出腹泻、体格消瘦、皮肤炎症等不良反应，最后确定环孢霉素a的使用浓度为20mg/kg/次，一天一次，连续使用，直至模型成功。因环孢霉素a和他克莫司联合使用，极大的限制了t细胞功能，本发明联合使用环孢霉素a(20mg/kg)和他克莫司(0.01mg/kg)，动物出现高度免疫抑制症状，但并未出现死亡和并发症的发生，说明该剂量的控制是有效的。基于术前和术后免疫干预，免疫抑制方案从术前三天开始一直持续到术后 3周，并伴随体重的变化及时调整用药量，体重降低后适量减少用药量。术后3 周进行核磁检测，对模型动物进行影像学评估。
55.3.小型猪的麻醉和手术
56.麻醉剂选择丙泊酚注射液，麻醉剂量为4mg/kg，麻醉方式为耳静脉注射。根据猪的年龄和体重关系，项目组确定使用3月龄，体重约为10-15kg的小型猪为模型动物。实验前适应性饲养1周以适应环境，并排除先天性或潜在感染性疾病的存在，同时在术前三天开始给与不同的免疫抑制剂提前干预。
57.手术过程参见图2，包括：头部皮肤去毛消毒，在枕骨嵴前颅骨中线上，纵向切开4-5cm的颅骨皮肤。在枕骨嵴前3cm，距中线1cm处用1.2mm颅钻开颅骨孔，硬脑膜用注射器穿透。将裸鼠皮下u87肿瘤组织切成体积为1mm3组织块，利用套管针将其移入深度为硬脑膜下9-10.5mm的纹状体位置。颅骨钻孔用骨蜡填充，创口消毒后缝合，关闭皮肤层。术后持续观察动物的生存状况，未出现脑水肿、感染等异常状况。
58.4.核磁影像学检测
59.术后持续给予免疫抑制剂3周后，麻醉小型猪进行核磁检测。西门子skyra 3.0t磁
共振，分别执行横断面t2w1加权、矢状面t2w1加权、横断面t1加权、弥散序列等成像序列检测肿瘤的大小和位置(结果如图3所示)。累计共完成12例小型猪脑胶质瘤模型手术制备，有11例通过核磁检测发现脑部肿瘤形成。
60.5.肿瘤标志物的检测
61.持续观察小型猪神经行为症状，必要时使用200mg/ml戊巴比妥心内注射处死动物并解剖。分离皮下肿瘤组织，4％多聚甲醛固定后，石蜡包埋切片he 染色确认其胶质瘤组织形态。解剖后分离出小型猪的大脑，依据影像结果，肉眼观察，初步确认肿瘤发生的部位，参见图5，取该部位组织4％多聚甲醛固定，石蜡包埋制作切片，脱蜡和水化后，he染色确认其胶质瘤组织形态，参见图 6。同时用非特异性蛋白封闭并消除内源性过氧化物酶活性，一抗分别选择人线粒体抗体和gfap在4℃孵育过夜，加入二抗(羊抗鼠)室温孵育20分钟，dab 显色后苏木素复染，酒精脱水，甲醛透明并中性树脂封片，光学显微镜下观察。结果如图7和图8所示，人线粒体抗体和gfap在胶质瘤发生部位均表达呈阳性( )，而正常的猪脑组织表达为阴性。
62.6.肿瘤细胞的培养
63.使用150mg/kg戊巴比妥钠静脉注射处死成瘤的猪并解剖，取肉眼可见肿瘤组织进行胰酶(0.25％)和edta(0.02％)联合消化后，用含20％胎牛血清 (fbs)的1640培养基培养，获得原代培养的肿瘤细胞，命名为glioma-rp(图 9)。
64.7.猪胶质瘤移植模型的建立
65.选择体重约为10-15kg的小型猪，联合口服环孢霉素a软胶囊(20mg/kg) 和他克莫司胶囊(0.01mg/kg)三天。将经过猪体内筛选的肿瘤细胞glioma-rp 注射(2
×
106)免疫抑制剂环孢霉素a(20mg/kg)和他克莫司(0.01mg/kg)处理的猪大脑纹状体，术后持续使用免疫抑制剂处理21天，待小型猪明显消瘦后，核磁共振检测确认肿瘤的发生，处死动物并解剖，取肉眼可见肿瘤组织固定，he染色确认肿瘤的组织形态，gfap免疫组化检测确定其胶质瘤特征，人特异性线粒体检测确定其人源性特征。核磁检测确认glioma-rp细胞移植到免疫抑制剂处理的小型猪大脑，3周后成瘤率可达到85％以上(图10和图11)。
66.综上所述，本发明通过异种移植建立了人脑胶质瘤小型猪异种移植模型，获得稳定成瘤的细胞系glioma-rp。该模型是将人脑胶质瘤细胞u87接种裸鼠，将获取的荷瘤鼠肿瘤组织原位移植到小型猪脑部纹状体，建立猪胶质瘤异种原位移植模型。该模型主要是通过联合使用免疫抑制剂环孢素和他克莫司抑制小型猪免疫功能，将胶质瘤组织块直接原位移植到猪脑纹状体并形成肿瘤。移植 3周时，核磁检测确认肿瘤发生率达到70％以上，处死动物解剖后能够观察到脑部肿瘤的形成，进一步进行he染色确认肿瘤的组织形态。人特异性线粒体表达强阳性确定该移植瘤来源于人。肿瘤标志物gfap表达呈阳性，确认了胶质瘤特性。进一步将将小型猪大脑形成的胶质瘤组织原代培养，获得的肿瘤细胞glioma-rp移植到免疫抑制剂处理的小型猪大脑，3周后成瘤率可达到85％以上。
67.以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。