具有预防或缓解高尿酸血症的鼠李糖乳杆菌fmb14及应用的制作方法

具有预防或缓解高尿酸血症的鼠李糖乳杆菌fmb14及应用
一、技术领域
1.本发明涉及具有预防或缓解高尿酸血症的鼠李糖乳杆菌fmb14及应用，属于食品微生物领域。
二、

背景技术：

2.在过去的20年中，人们的生活方式发生了巨大的改变，物质水平的提高增加了一些代谢综合征疾病的发生率，改变了人们的健康状况。高尿酸血症是一种由内源和外源因素共同引起的代谢性疾病，高尿酸血症是痛风发生的主要因素，且除此之外还会引发如高血压、急性和慢性肾脏疾病、肥胖、脂肪肝和糖尿病等。目前全球有超过1000万例痛风患者，而高尿酸血症由于前期无症状，作为一种巨大的健康隐患，常常被人们忽视。临床上的往往只在痛风或急性关节炎发生后才介入治疗，目前多使用非布司他和苯溴马隆进行药物治疗，主要依赖抑制尿酸合成(抑制黄嘌呤氧化酶)和促进尿酸排泄两类药物，这类药物往往会造成过敏皮疹、白细胞及血小板减少、肝功能损害等不良副作用。此外，高尿酸血症会引起肠道菌群的紊乱和肠壁功能的破坏，从而引发其他疾病。
3.益生菌介入已成为治疗代谢性疾病的常规方法之一，在高尿酸血症治疗领域却被忽视。目前报到的部分益生菌可在肠道系统中产生尿酸酶，并将尿酸降解为尿囊素随尿液排出。此外益生菌还可抑制黄嘌呤氧化酶活性或降低其含量以减少尿酸生成。肌苷作为嘌呤核苷，饮食中摄入过多肌苷会引起血尿酸升高，长期高肌苷饮食造成高血清尿酸浓度会破坏肠道菌群的稳态，从而损伤肠道屏障。大量文献已证实乳酸菌定植于肠道，且具有一定的嘌呤代谢功能，可以竞争性的代谢嘌呤以达到调节高尿酸血症的目的。此外，乳酸菌的定植会提高肠道免疫力，降低炎症因子水平，起到保护机体的作用。
4.可见，提供一种可控制高嘌呤饮食引起的高尿酸血症且使用安全的微生物具有重要意义。
三、

技术实现要素：

5.技术问题
6.针对现有资源及技术上的不足，本发明提供了具有预防或缓解高尿酸血症的鼠李糖乳杆菌fmb14及应用，该鼠李糖乳杆菌fmb14制备的菌液在应用时，能够有效降低小鼠尿酸水平、降低黄嘌呤氧化酶含量、降低炎症反应、缓解肠道菌群紊乱，效果显著。
7.技术方案
8.一种鼠李糖乳杆菌fmb14，该菌株分类命名：鼠李糖乳杆菌fmb14(lacticaseibacillus rhamnosus fmb14)，于2021年10月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学邮编：430072，其保藏号为cctcc no:m20211270。
9.所述鼠李糖乳杆菌fmb14的应用，是指鼠李糖乳杆菌fmb14在预防或缓解高尿酸血症方面的应用，或鼠李糖乳杆菌fmb14在体外降解肌苷方面的应用或是指鼠李糖乳杆菌fmb14缓解高嘌呤膳食引起的高尿酸血症方面的应用，或是指鼠李糖乳杆菌fmb14在降低高
尿酸血症引起的炎症方面的应用，或者缓解高尿酸血症引起的肠道菌群紊乱方面的应用。
10.用所述的鼠李糖乳杆菌fmb14可以制备预防或缓解高尿酸血症的药物。
11.有益效果：
12.本发明鼠李糖乳杆菌fmb14在应用时，能够有效降低小鼠血清尿酸水平、降低炎症水平、调节肠道菌群紊乱，效果显著。
13.(1)本发明提供的鼠李糖乳杆菌fmb14在500μmol/l肌苷中，24h降解率达到36.4％。
14.(2)本发明提供的鼠李糖乳杆菌fmb14模拟肠胃存活率达到58.0％、肠道细胞定殖率达到50％，从而可稳定的降低由于高嘌呤饮食(肌苷)引起的血清尿酸含量升高，缓解高尿酸血症症状。
15.(3)本发明提供的鼠李糖乳杆菌fmb14菌液，制备过程简单，具有制备方便、安全性高的优点。
16.(4)本发明提供的鼠李糖乳杆菌fmb14菌液干预高尿酸血症模型小鼠后，小鼠血清尿酸平均值显著小于模型组的小鼠的血清尿酸平均值，至少小65.9μmol/l，说明本发明的鼠李糖乳杆菌fmb14菌液具有明显的降尿酸效果，有效预防高尿酸血症的发生。用所述的鼠李糖乳杆菌fmb14可以制备预防或缓解高尿酸血症的药物。
17.(5)本发明提供的鼠李糖乳杆菌fmb14菌液干预高尿酸血症模型小鼠后，小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶含量由1810.0pg/mg降低至808.2pg/mg，与正常组黄嘌呤氧化酶含量(719.7pg/mg)接近，用所述的鼠李糖乳杆菌fmb14可以制备预防或缓解高尿酸血症的药物。
18.(6)本发明提供的鼠李糖乳杆菌fmb14菌液显著地降低了高尿酸小鼠的炎症水平，鼠李糖乳杆菌fmb14菌液干预后，小鼠血清炎症因子il-1β，il-18，il-6和tnf-α较模型组分别降低了22.1％,26.1％,15.0％和21.1％。鼠李糖乳杆菌fmb14可以在降低高尿酸血症引起的炎症方面得到应用。
19.(7)本发明提供的鼠李糖乳杆菌fmb14菌液显著地调节了高尿酸血症小鼠肠道菌群结构。在门水平上，firmicutes正常组丰度为43.0％，高嘌呤饮食导致其升高为65.3％，而鼠李糖乳杆菌fmb14干预后降至52.2％，缓解率达到20.0％。而高嘌呤饮食导致bacteroidetes丰度由49.4％降低至32.8％，经过鼠李糖乳杆菌fmb14干预后恢复至43.3％，缓解率达到31.6％。鼠李糖乳杆菌fmb14可以改善肠道微生态系统，在缓解高尿酸血症引起的肠道菌群紊乱方面得到应用。
四、附图说明：
20.图1为鼠李糖乳杆菌fmb14的平板培养照片；
21.图2为鼠李糖乳杆菌fmb14革兰氏染色的镜检结果；
22.图3为是动物实验中各组别小鼠血清尿酸水平。
23.图4为各组小鼠动物实验中各组别小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶水平。
24.图5为动物实验中各组别小鼠血清中炎症因子水平。
25.图6为动物实验中各组别小鼠肠道微生物多样性的pcoa分析。
26.图7为动物实验中各组别小鼠肠道微生物门水平相对丰度结果。
27.生物保藏
28.鼠李糖乳杆菌fmb14，该菌株分类命名：鼠李糖乳杆菌fmb14(lacticaseibacillus rhamnosus fmb14)，于2021年10月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学邮编：430072，保藏编号为cctccno:m 20211270。
五、具体实施方式
29.通过具体实施例，并结合附图对本发明进一步阐述：
30.1.鼠李糖乳杆菌fmb14的分离、筛选
31.菌株分离自甘肃省张掖市传统发酵乳样品。样品采集后低温运送至实验室并转入灭菌处理的研钵中研磨，加入无菌水稀释成10ml的样品液，然后再次用无菌水按照10-5-10-7
的比例稀释后，分别取100μl涂于改良mrs固体培养基上，37℃条件下静置培养24h。挑取平板上的单菌落，并将该单菌落接种于改良mrs液体培养基中，37℃下静置培养24h，采用划线法将培养的菌液重复划线于改良mrs固体平板上，进行纯化，重复纯化3次。纯化三代后，得到的单菌落编号为fmb14。如附图1所示，所述菌株fmb14在改良mrs固定平板上的菌落为乳白色至淡黄色，呈圆形，直径1-2mm，表面光滑无光泽，中间凸起，不透明，边缘整齐，无晕环；对筛出菌株进行革兰氏染色，结果如附图2所示，所述菌株的菌体为革兰氏阳性菌，呈短杆状，表面较光滑，无芽孢。挑取上述的单菌落接种于改良mrs液体培养基中，37℃下静置培养24h，然后将菌液与30％甘油1:1混合后保存于-80℃冰箱，进行后续的实验。
32.2.鼠李糖乳杆菌fmb14的鉴定及保藏
33.将步骤1所筛选得到的菌株fmb14培养24h，取菌液1ml于1.5ml离心管，提取细菌基因组(按照omega e.z.n.a bacteria dna kit操作步骤进行)。
34.以步骤(1)提取的菌株dna作为模板，利用细菌16srrna通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctca-3’)和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)进行扩增，扩增片段送至北京六合华大生物公司进行序列测定，测序结果如seq id no.1所示。blast比对结果表明，菌株fmb14与lacticaseibacillus rhamnosus的序列相似性为99.93％，因此判断菌株fmb14为鼠李糖乳杆菌。
35.将筛选到的菌株fmb14进行菌种保藏，所述鼠李糖乳杆菌fmb14的保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心；保藏日期：2021年10月14日；鼠李糖乳杆菌fmb14 lacticaseibacillus rhamnosus fmb14的保藏编号为cctcc no:m 20211270。
36.3.鼠李糖乳杆菌fmb14体外降解肌苷能力
37.(1)将保存的鼠李糖乳杆菌fmb14划线于改良mrs固体培养基上，挑取一环单菌落接种于改良mrs液体培养基中活化24h，再按1％接种量重新接种于5ml新鲜mrs液体培养基中，37℃培养48h调整菌体浓度为1
×
108cfu/ml备用。
38.(2)配制10mmol/l磷酸钾溶液，具体为称取2.123g磷酸钾溶解于100ml容量瓶，用超纯水定容至100ml，震荡混匀，用磷酸调至ph7.0，4℃冰箱中备用
39.(3)配制1000μmol/l肌苷-磷酸钾溶液，具体为称取0.268g肌苷溶解于1l的容量瓶中，用(2)中准备的10mmol/l磷酸钾溶液定容至1l，震荡混匀，4℃冰箱中备用。
40.(4)将(3)中的肌苷-磷酸钾溶液溶液用(2)中的磷酸钾溶液梯度稀释为500、250、100、50、25μmol/l的肌苷-磷酸钾溶液，分别取900ul后与100ul终止剂高氯酸溶液混合，混
合均匀后吸取20μl，使用hplc外标法测定保留时间并制作定量标准曲线。
41.(5)高效液相色谱使用色谱柱zorbax sb-aq column(5μm4.6
×
250mm)，流动相a为甲醇，b为超纯水，洗脱程序如下：0-15min(0％a),15-20min(0-10％a),20-25min(10-0％a)，流速1ml/min，柱温250℃，测定波长250nm，洗脱时间25min。
42.(6)取1ml(1)中培养液4℃,5000r/min离心10min，菌体使用1ml无菌pbs重复洗涤三次，重悬于1ml肌苷-磷酸钾溶液(500μmol/l)中，37℃静置培养24h，48h后测定肌苷与次黄嘌呤含量。
43.(7)将(6)所得菌悬液4℃,5000r/min离心10min，上清与终止剂高氯酸按体积比9:1混合均匀后，取20μl用于hplc分析，每组进行三次平行实验。
44.(8)测定结果见表1，结果显示，fmb14菌体24h降解了36.4％的肌苷溶液，具有较强的肌苷降解能力。
45.表1 fmb14体外降解肌苷的效率
[0046][0047][0048]
4.鼠李糖乳杆菌fmb14的模拟胃肠消化液和肠道吸附性实验
[0049]
(1)模拟胃液制备与操作
[0050]
模拟胃液按照如下方法配制：用9.5％盐酸加蒸馏水稀释至ph值为1.5，每100ml加入1.0g胃蛋白酶，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。量取菌体发酵液5ml，将菌液于4℃，8000rpm条件下离心10min，将菌泥重悬于5ml所制模拟胃液中，于37℃、50r/min条件下放置4h，重复3次；检测：对处理后的样品溶液进行梯度稀释，使用倾注法做活菌计数，再计算存活率，实验重复三次，结果见表2。
[0051]
(2)模拟肠液制备与操作
[0052]
模拟肠液按照如下方法配制：将6.8g的kh2po4溶于500ml蒸馏水中，加入3g牛胆盐和10g胰蛋白酶，用浓度为4g/l的naoh溶液调节溶液ph值至6.8，用蒸馏水定容至1l后，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。取经过模拟胃液处理的菌液，于4℃，8000rpm条件下离心10min，将菌泥重悬于5ml所制模拟肠液中，于37℃、50r/min条件下放置4h，重复3次；检测：对处理后的样品溶液进行梯度稀释，使用倾注法做活菌计数，再计算存活率，结果见表2，鼠李糖乳杆菌fmb14在模拟胃液中存活率达82.7％，在模拟肠液中存活率达到58.0％。
[0053]
(3)本实施例中，存活率的计算公式如下：
[0054]
存活率＝(处理后菌数/原始菌数)
×
100％。
[0055]
表2 fmb14模拟胃肠道耐受性结果
[0056][0057]
5.鼠李糖乳杆菌fmb14对结肠癌细胞caco-2的粘附实验
[0058]
(1)dmem细胞培养液购自gibco公司；该dmem培养液含10％热灭活胎牛血清和双抗(青霉素浓度100u/ml、链霉素100u/ml)。
[0059]
(2)按照实施例2的方法进行鼠李糖乳杆菌fmb14菌株活化，然后按照体积分数1％的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h，获得菌液，离心收集菌体，离心条件为8000r/min、4℃、离心10min；用无菌pbs缓冲液洗涤3次，将菌体重悬于无菌pbs缓冲液中，制成浓度为1
×
108cfu/ml的fmb14菌悬液，无菌pbs缓冲液购买于索莱宝生物。
[0060]
(3)将caco2细胞置于步骤(1)的培养液中，于37℃、5％co2、相对湿度95％的二氧化碳培养箱中孵育，2天传代1次，6代后将细胞接种于6孔培养板中，接种密度为1
×
106cfu/ml，待细胞长至单层后进行黏附试验；
[0061]
(4)将已长成单层的caco2细胞用无菌pbs缓冲液漂洗2次，每孔加入0.5ml的步骤(2)的菌悬液和0.5ml新鲜的培养液，于37℃、5％co2、相对湿度95％的二氧化碳培养箱中孵育2h，然后用无菌pbs缓冲液漂洗细胞5次，以除去未粘附的fmb14，每个处理做3个平行。
[0062]
(5)在6孔板中加入1ml胰酶消化5分钟，轻轻吹打后进行涂布法做活菌计数(同实施例3)，计算出粘附率，结果见表3，粘附率的计算公式如下：
[0063]
粘附率＝黏附菌数/初始菌数
×
100％
[0064]
表3 fmb14在caco2细胞上的粘附率及粘附个数
[0065][0066]
(6)结合表3可以看出，鼠李糖乳杆菌fmb14肠细胞粘附率达到50％，具有较强的细胞定植能力，即鼠李糖乳杆菌fmb14在肠道内定植后，可长期稳定的产生作用。
[0067]
6.鼠李糖乳杆菌fmb14菌液制备
[0068]
(1)将保存的鼠李糖乳杆菌fmb14划线于改良mrs固体培养基上，挑取得到的单菌落接种于改良mrs液体培养基中，按1％接种量重新接种于5ml新鲜mrs液体培养基中，37℃培养24h调整菌体浓度为1
×
108cfu/ml备用。
[0069]
(2)离心(1)收集的菌体，离心条件为8000r/min、4℃、离心10min；用无菌pbs缓冲液洗涤3次，将菌体重悬于无菌生理盐水中，制成浓度为1
×
108cfu/ml的fmb14菌悬液在随后的动物模型中使用，现用现制。
[0070]
7.鼠李糖乳杆菌fmb14对高尿酸血症小鼠的血清中尿酸的影响
[0071]
动物试验采用4周龄、无特定病原体级的体重20
±
3g的健康雄性kunming小鼠30只(购自于扬州大学比较医学中心)，适应性培养1周后，随机分为3组，每组10只，分别为对照组、模型组、fmb14组(鼠李糖乳杆菌fmb14)，实验期间小鼠的进食和饮水不受任何因素的限制。
[0072]
实验设置如下：
[0073]
对照组：每天灌胃2次0.1ml生理盐水，每次灌胃间隔1h；
[0074]
模型组：按照肌苷2.5mg/kg(药品/体重)、氧嗪酸钾3.5mg/kg每天灌胃1次肌苷与氧嗪酸钾混合生理盐水0.1ml，1h后灌胃0.1ml生理盐水；
[0075]
fmb14干预组，按照肌苷2.5mg/kg(药品/体重)、氧嗪酸钾3.5mg/kg每天灌胃1次肌苷与氧嗪酸钾混合生理盐水，1h后灌胃0.1ml鼠李糖乳杆菌fmb14菌液(1
×
108cfu/ml)；
[0076]
实验12周后，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射0.1ml/10g1％的戊巴比妥钠溶液麻醉后，摘眼球取血并辅以颈椎脱臼法处死。血液样本于3500r/min离心15min，取上清后用于血清中指标分析。尿酸含量采用尿酸elisa检测试剂盒(酶免)方法检测。检测结果如附图3所示，鼠李糖乳杆菌fmb14干预组小鼠的尿酸浓度与模型组相比，血清尿酸浓度从179.1μmol/l降低至113.2μmol/l，下降36.8％，且与对照组血清尿酸水平相近(98.7μmol/l)，说明本发明的鼠李糖乳杆菌fmb14具有缓解高尿酸血症的功能。
[0077]
8.鼠李糖乳杆菌fmb14对高尿酸血症小鼠的肝脏中黄嘌呤氧化酶含量的影响
[0078]
实验动物分组及实验设置同实施例7，黄嘌呤氧化酶(xod)的检测参照wu等人的方法(wu et al.,gut microbes 2021,13,1-18.)，使用elisa试剂盒(酶免)进行。
[0079]
取0.1g小鼠肝脏样品，加入900μl生理盐水，4℃充分匀浆后3500r/min离心15min去上清进行测试。结果如附图4所示，对照组，模型组和fmb14干预组的黄嘌呤氧化酶含量分别为719.7，1810.0和808.2pg/mg，fmb14干预组小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶含量较模型组显著下降，下降比达55.3％，且与对照组小鼠的黄嘌呤氧化酶含量接近，说明鼠李糖乳杆菌fmb14干预可将黄嘌呤氧化酶控制在正常水平。综合来看，本发明提供的鼠李糖乳杆菌fmb14能够将肝脏内黄嘌呤氧化酶水平控制在正常范围内，可防止高尿酸血症的发生。用所述的鼠李糖乳杆菌fmb14可以制备预防高尿酸血症的药物。
[0080]
9.鼠李糖乳杆菌fmb14降低高尿酸血症小鼠血清促炎因子il-1，il-6，il-18和tnf-α，增加抗炎因子il-10水平
[0081]
实验动物分组及实验设置同实施例7，炎症因子il-1β，il-6，il-10，il-18和tnf-α检测参照wu等人的方法(wu et al.,gut microbes 2021,13,1-18.)，检测使用elisa(酶免)的方法进行，结果如附图5所示。鼠李糖乳杆菌fmb14干预高尿酸血症小鼠后，小鼠血清炎症因子水平有显著下降，其中正常组小鼠血清中il-1β，il-6，il-10，il-18和tnf-α含量为169.9，540.6，203.3和213.4pg/mg，而模型组小鼠血清中各炎症因子浓度上升为320.0，905.6，374.8和394.2pg/mg，高尿酸血症导致小鼠炎症反应增强，而鼠李糖乳杆菌fmb14干预组小鼠的血清炎症因子il-1β，il-6，il-10，il-18和tnf-α含量下降至249.3，669.6，318.5和310.9pg/mg，较模型组分别下降了22.1％,26.1％,15.0％和21.1％。此外，小鼠血清中的抗炎因子il-10含量由正常组1046.9pg/mg下降为模型组中的897.9pg/mg，而鼠李糖乳杆菌fmb14干预组中上升至965.4pg/mg。本发明提供的鼠李糖乳杆菌fmb14能够缓解高尿酸血症带来的低度全身炎症。鼠李糖乳杆菌fmb14可以在降低高尿酸血症引起的炎症方面得到应用。
[0082]
10.鼠李糖乳杆菌fmb14对高尿酸血症小鼠肠道菌群的调节作用
[0083]
实验动物分组及实验设置同实施例7，参照li等人的方法(lietal.,food res.int.,2021,143,110270)，收集小鼠结肠内容物0.1g，送至北京六合华大公司使用illunima miseq对小鼠粪便基因组中的16srdna全长进行了高通量测序。利用qiime平台统
计细菌群落组成和类群丰度，计算群落α和β多样性指数。结果显示对照组、模型组和fmb14干预组的丰富度没有明显差异，但pcoa(聚类分析)分析发现(图6)高尿酸血症改变了肠道菌群的全局性结构，使其与对照组区分开，而fmb14的处理可以一定程度恢复高尿酸血症小鼠的肠道菌群结构的紊乱。鼠李糖乳杆菌fmb14可以在缓解高尿酸血症引起的肠道菌群紊乱方面得到应用。
[0084]
此外，如附图7所示，高尿酸血症组小鼠肠道菌群在门水平上，模型组firmicutes门的丰度为65.3％，较对照组43.1％有显著增加，而鼠李糖乳杆菌fmb14干预组该门丰度降低至52.2％。此外，模型组中bacteroidetes和proteobacteria门的丰度与对照组相比均显著下降，分别由49.4％和2.5％降至32.8％和1.1％，鼠李糖乳杆菌fmb14干预组中bacteroidetes和proteobacteria门的丰度恢复至43.3％和3.0％。鼠李糖乳杆菌fmb14干预对高尿酸血症引起的肠道菌群中firmicutes门、bacteroidetes门、proteobacteria门的紊乱均有显著调节效果。
[0085]
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。