检测水稻植株镉离子的试剂盒及检测方法

1.本发明涉及植物保护技术领域，尤其涉及一种检测水稻植株镉离子的试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.镉被广泛应用于电镀、采矿、冶炼、电池等工业领域，导致我国农田广泛的受到镉污染。镉可通过食物链进入人体，在人体内有长达10-30年的生物半衰期。过量的镉积累，会导致包括肾损伤、骨质疏松甚至癌症的发生。因此，镉被国际癌症研究机构归类为第一致癌物，各国均制定了一些强制性标准，用于限定食品中的镉含量。
3.水稻就是一种易于富集镉的农作物。近年来，湖南的镉大米事件，引起了广泛关注。目前，生产上主要从现有的水稻品种中筛选镉低积累的应急品种，但这仅可部分解决稻米镉污染问题，生产在迫切需要适宜在重度镉污染地区种植的镉低积累水稻品种。因此，筛选和培育能在不同镉污染程度地区种植的镉低积累水稻品种成为一种迫切。
4.按gb/t5009.15规定，目前已有的镉含量检测方法主要有：原子吸收光谱法、原子荧光法、比色法和高效液相色谱等方法。然而，上述方法均不同程度地存在实验周期长、成本高、检测步骤繁琐等弊端，难以大规模推广使用。需要寻求一种以镉离子为分子生物标志物，通过基于cd
2
依赖性dnazyme酶促反应和荧光共振能量转移(fret)机制，建立cd
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检测生物传感器，实现对水稻植株中cd
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的快速检测的方法。


技术实现要素：

5.本发明针对上述需要解决的技术问题，提供了一种检测水稻植株镉离子的试剂盒及其检测方法，是以镉离子为分子生物标志物，通过基于cd
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依赖性dnazyme酶促反应和荧光共振能量转移(fret)机制，建立cd
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检测生物传感器，实现对水稻植株中cd
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的快速检测。该方法具有灵敏度高、稳定性好及成本低等独特优势，整个检测过程周期短、反应迅速，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用，对镉低积累水稻品种的快速鉴定与选育具有重要意义。
6.为了实现上述目的，本发明提供了一种检测水稻植株镉离子的试剂盒，包括：enzyme strand和substrate strand；
7.所述enzyme strand的dna序列如seq id no.1所示；
8.所述substrate strand的dna序列如seq id no.2所示。
9.上述的试剂盒，进一步的，所述enzyme strand的3’端修饰有荧光淬灭基团；所述substrate strand的5’端修饰有荧光基团。
10.上述的试剂盒，进一步的，所述荧光淬灭基团为bhq2，所述荧光基团为rox。
11.上述的试剂盒，进一步的，所述试剂盒还包括mes缓冲液。进一步的，所述mes缓冲液包括20～150mm mes、10～100mm nacl，ph＝4.5～6.5。进一步的，所述mes缓冲液包括50mm mes、25mm nacl，ph＝6.0。
12.基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种水稻植株中镉离子的检测方法，所述检测方法为：
13.s1、将enzyme strand和substrate strand进行预杂交获得预杂交液；
14.s2、将待检测的水稻组织与到预杂交液混合，通过检测荧光信号的强度检测镉的含量。
15.上述的检测方法，进一步的，所述s1具体为：
16.s1-1、将enzyme strand和substrate strand干粉分别用mes缓冲液稀释至10～500nm，按1:1～10:1体积比进行充分混合得到混合液；
17.s1-2、将所述混合液在90℃～97℃水浴锅中保温5～15min，自然冷却过夜，形成互补双链结构。
18.上述的检测方法，进一步的，所述s2具体为：
19.s2-a1、取水稻幼苗第一片完全展开叶的叶片浸入预杂交液中；
20.s2-a2、进行抽真空处理，在-50kpa～100kpa时开始计时并维持5～30min，静置过夜；
21.s2-a3、将叶片置于植物活体分子影像系统中观察叶片荧光光谱。
22.上述的检测方法，进一步的，所述s2具体为：
23.s2-b1、剪取水稻幼苗根上部分，收集断口处流出的伤流液；
24.s2-b2、将所述水稻伤流液与所述预杂交液混合得到混合液；
25.s2-b3、将所述混合液置于植物活体分子影像系统中观察荧光光谱。
26.上述的检测方法，进一步的，所述s2具体为：
27.s2-c1、取水稻种子浸入预杂交液中，黑暗环境静止过夜；
28.s2-c2、将种子置于植物活体分子影像系统中观察荧光光谱。
29.与现有技术相比，本发明的优点在于：
30.1、本发明提供了一种检测水稻植株镉离子的试剂盒，以镉离子为分子生物标志物，通过基于cd
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依赖性dnazyme酶促反应和荧光共振能量转移(fret)机制，建立cd
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检测生物传感器，达到对水稻叶片中cd
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的快速检测，从而实现镉低积累水稻品种的快速鉴定与选育。
31.2、本发明提供了一种检测水稻植株镉离子的试剂盒在检测水稻植株中镉离子中的应用，该方法具有灵敏度高、稳定性好及成本低等独特优势，整个检测过程周期短、反应迅速，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。对水稻植株中cd
2
的快速检测以及对镉低积累水稻品种的快速鉴定与选育具有重要意义。
附图说明
32.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
33.图1为为本发明实施例1的试剂盒检测镉离子的原理图；
34.图2为本发明实施例2中检测水稻叶片实际样本鉴定结果图；
35.图3为本发明实施例3中检测水稻伤流液实际样本鉴定结果图；
36.图4为本发明实施例4中检测水稻种子实际样本鉴定结果图。
37.图5为本发明实施例5中灵敏度检测结果图。
具体实施方式
38.以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
39.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
40.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
41.实施例
42.以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
43.实施例一：
44.一种检测水稻植株镉离子的试剂盒，包括enzyme strand链、substrate strand链和mes缓冲液。
45.其中enzyme strand和substrate strand链由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
46.enzyme strand的dna序列如seq id no.1所示，具体为：
47.5'-gttcgccatcttccttcgatagttaaaatagtgact-bhq2-3'
48.substrate strand的dna序列如seq id no.2所示，具体为：
49.5'-rox-agtcactatra*ggaagatggcgaac-3'。
50.其中，t-bhq2代表在3'末端的t碱基上修饰淬灭基团bhq2；rox-a代表在5'末端的a碱基上修饰荧光基团；ra*代表硫代磷酸化修饰的cd
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依赖性dnazyme酶切位点。
51.mes缓冲液为：100ml浓度为50mm的mes(2-(n-吗啉)乙磺酸)溶液，其配制方法为：称取0.1461g nacl置于烧杯中，加入少量50mm的mes溶液，充分溶解后，用50mm的mes溶液定容至100ml，最后用naoh溶液将ph调至6.0，得到mes缓冲液。
52.本实施例的检测试剂盒检测原理参见图1，具体为：
53.substrate strand和enzyme strand核苷酸序列两端互补特征，随着温度降低，enzyme strand和substrate strand充分退火形成互补双链结构。双链结构导致enzyme strand链上的淬灭基团(bhq2)和substrate strand链上的荧光基团(rox)彼此靠近，在荧光共振能量转移(fret)作用下，预杂交后的混合液不显示出荧光信号或仅有微弱的背景荧光信号。
54.若反应体系中存在cd
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时，游离的cd
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与enzyme strand中cd
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依赖性dnazyme酶链相结合，形成有催化活性的酶链。被激活的酶链催化substrate strand链从ra*切割，失去完整结构的enzyme strand/substrate strand/cd
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复合物最终解体，释放出cd
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、enzyme strand链和被切割后的substrate strand链。被释放的cd
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将进一步参与到下一轮酶促反应循环中，而重新变为游离态的enzyme strand链，则会和混合液中少量游离的substrate strand链再次形成互补双链结构，在荧光共振能量转移(fret)作用下，进一步降低背景信
号。被切割后的substrate strand游离片段，由于荧光基团(rox)与淬灭基团(bhq2)彼此分离，从而产生了强荧光信号。
55.若反应体系中缺少cd
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时，enzyme strand和substrate strand会形成稳定的互补双链结构，在荧光共振能量转移(fret)作用下，预杂交后的混合液不显示出荧光信号或仅有微弱的背景荧光信号，从而实现cd
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的鉴定。
56.环境中cd
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的含量越高，荧光信号越强。通过比较荧光信号强弱，实现镉低积累水稻品种的快速鉴定与选育。
57.实施例2：
58.一种快速检测水稻植株镉离子的方法，其检测对象为镉低积累水稻品种珞红3b和镉高积累水稻品种华占叶片，具体检测方法包括以下步骤：
59.(1)enzyme strand和substrate strand预杂交：将实施例1的检测试剂盒中enzyme strand和substrate strand干粉分别用mes缓冲液稀释至100nm，稀释后的enzyme strand和substrate strand按4:1体积比进行充分混合，将混合液在95℃水浴锅中保温7min，关闭电源，让其自然冷却过夜，使之形成互补双链结构，获得预杂交液。全程需避光条件下进行。
60.(2)水稻幼苗培养：
61.2.1、取镉低积累水稻品种(珞红3b)和镉高积累水稻品种(华占)各50粒饱满种子，用清水浸种48小时，期间每隔12小时更换一次清水。取出种子用湿毛巾包好置于37℃恒温箱中催芽，种子露白后，将种子播种于底部开口96孔板中，然后将96孔板置于水培盒中，加入清水，使水面刚好没过种子为好，置于37℃光培室中让其继续生长。
62.2.2、水培生长两天后，将清水替换为水稻水培营养液(用的是coolaber公司的yoshida水稻营养液(干粉)，货号是nsp1040-1kg。)使其继续生长，期间每隔3天更换一次营养液。2周后，在营养液中加入cdcl2，使其终浓度为4mg/l，继续培养1周。
63.(3)水稻叶片侵染：
64.3.1、在2ml离心管中加入1.5ml无菌水，同时加入少量表面活性剂(triton x-100)，使其充分混匀。
65.3.2、用剪刀从水稻幼苗第一片完全展开叶中部剪取1.5cm长叶段置于离心管中，上下颠倒混匀8min后，将水稻叶片转移至无菌水中清晰3遍。将水稻叶片取出并置于吸水纸上，充分去除表面残留水后，将叶片置于新的2ml离心管中。
66.3.3、向离心管中分别加入步骤(1)中的预杂交液，使液面没过没过叶片顶端。
67.3.4、将离心管盖打开并置于抽真空装置中进行抽真空处理，当压强达到-70kpa时开始计时并维持10min。取出离心管，盖上盖子，将离心管置于黑暗条件下静置过夜。
68.(4)水稻叶片cd
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检测：次日用镊子小心取出水稻叶片，将叶片置于吸水纸上小心吸净表面预杂交液，于植物活体分子影像系统中观察叶片荧光光谱，激发光谱设定为520nm，水稻叶片中cd
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含量越高，荧光信号越强。通过叶片荧光信号强弱，实现镉低积累水稻品种的快速鉴定与选育。
69.检测结果参见图2：颜色越红(图中显示为颜色越深)表示cd
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含量越高，颜色越淡表示cd
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含量越低。其中ck没有进行cd
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处理，所以叶片中间几乎没有红色(图中显示为颜色更深的部分为红色，叶片中间少量及断口处的红色，应该是噪点)；3b和华占都进行了cd
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处理(cd
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处理浓度及时间均相同)，由于3b是已知的cd
2
低积累水稻，所有其叶片中cd
2
含量低(颜色浅)，华占是常规材料(正常吸收cd
2
)，所以颜色深。
70.不同的实验条件，对实验结果有一定影响。每个反应的最佳条件为对应的信噪比达到最大值。本实施例在最适条件下，我们对叶片进行cd
2
含量检测，结果为：3b＝0.029mg/kg；华占＝0.331mg/kg，实验的效果达到最优。
71.实施例3：
72.一种快速检测水稻植株镉离子的方法，其检测对象为镉低积累水稻品种珞红3b和镉高积累水稻品种华占伤流液，其检测方法具体包括以下步骤：
73.(1)enzyme strand和substrate strand预杂交：
74.将实施例1的检测试剂盒中enzyme strand和substrate strand干粉分别用mes缓冲液稀释至100nm，稀释后的enzyme strand和substrate strand按4:1体积比进行充分混合，将混合液在95℃水浴锅中保温7min，关闭电源，让其自然冷却过夜，使之形成互补双链结构，全程需避光条件下进行。
75.(2)水稻植株伤流液的获取：
76.2.1、取镉低积累水稻品种(珞红3b)和镉高积累水稻品种(华占)各50粒饱满种子，用清水浸种48小时，期间每隔12小时更换一次清水。取出种子用湿毛巾包好置于37℃恒温箱中催芽，种子露白后，将种子播种于底部开口96孔板中，然后将96孔板置于水培盒中，加入清水，使水面刚好没过种子为好，置于37℃光培室中让其继续生长。
77.2.2、水培生长两天后，将清水替换为水稻水培营养液使其继续生长，期间每隔3天更换一次营养液。2周后，在营养液中加入cdcl2，使其终浓度为4mg/l，继续培养1周。
78.2.3、培养结束后，用剪刀在距离根部1cm处整齐剪断水稻幼苗并继续置于光培室中生长。半个小时后，可见在水稻幼苗断口出渗出伤流液，用移液枪分别收集珞红3b和华占伤流液。
79.(3)水稻伤流液cd
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检测：
80.3.1、用移液枪吸取珞红3b和华占伤流液各50μl分别置于干净pcr小管中，向两个管中分别加入5μl步骤1.3中的预杂交液，充分混匀后将pcr小管置于植物活体分子影像系统中观察荧光光谱，激发光谱设定为520nm，伤流液中cd
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含量越高，荧光信号越强。通过伤流液荧光信号强弱，实现镉低积累水稻品种的快速鉴定与选育。
81.检测结果参见图3。图3类似于图2，是同一批材料进行的不同检测。cd
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由水稻根系进入细胞，从根部细胞转运至木质部，在水稻基部节间由木质部转运至韧皮部，进入韧皮部的cd
2
随着水分向叶片运输。因此，伤流液中cd
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含量可以反映水稻根系吸收的cd
2
含量。图3中华占颜色最深，表示华占根系吸收的cd
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含量最多(注：华占伤流液管上半部颜色红，下半部变黄，是因为pcr小管下端呈锥形，不能和上端保持在同一水平面上，拍照时摄像头不能聚焦导致)。
82.不同的实验条件，对实验结果有一定影响。每个反应的最佳条件为对应的信噪比达到最大值。本实施例在最适条件下，我们对伤流液进行cd
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含量检测，结果为：3b＝0.017mg/kg；华占＝0.0441mg/kg，实验的效果达到最优。
83.实施例4：
84.一种快速检测水稻植株镉离子的方法，应用的具体对象为镉高积累水稻品种华占
分别种植于常规田和镉离子污染田中收获的水稻种子，具体包括以下步骤：
85.(1)enzyme strand和substrate strand预杂交：将实施例1的检测试剂盒中enzyme strand和substrate strand干粉分别用mes缓冲液稀释至100nm，稀释后的enzyme strand和substrate strand按4:1体积比进行充分混合，将混合液在95℃水浴锅中保温7min，关闭电源，让其自然冷却过夜，使之形成互补双链结构，获得预杂交液。全程需避光条件下进行。
86.(2)水稻种子的获取：
87.2.1、取华占水稻种子正常催芽并播种于苗圃，取25天苗龄植株移栽于盆钵(盆钵内径266mm，高190mm)中，每钵3株，共移栽十盆。其中五盆材料常规土壤培育，另外五盆根据加入土壤重量加入相应cdcl2溶液，使其土壤中镉离子浓度为1.0mg/kg。
88.2.2、移栽完成后，将盆钵移入玻璃温室，避免雨水对镉离子浓度产生影响。期间正常水肥管理，直至成熟并收货水稻种子。
89.(3)稻米cd
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检测：
90.3.1、分别取不同镉离子浓度土壤中收获的华占水稻种子，小心用镊子去除外壳，然后将去壳后的谷粒放入1.5ml离心管中，然后向两个离心管中分别加入步骤1.3中的预杂交液，使其液面没过种子，用锡箔纸包好后置于黑暗环境静止24小时。
91.3.2、取出种子，用吸水纸充分吸净种子表面残留水分后，将种子置于植物活体分子影像系统中观察荧光光谱，激发光谱设定为520nm，种子中cd
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含量越高，荧光信号越强。通过种子荧光信号强弱，实现稻米中镉离子含量检测。
92.检测结果参见图4：由于华占种子中cd
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含量高，所以颜色较红(种子上半部呈黄色和图3是相同原理)，整个图4分为明场和暗场部分，明场即是在正常光源下进行拍照，暗场是在520nm激发波下拍照。
93.不同的实验条件，对实验结果有一定影响。每个反应的最佳条件为对应的信噪比达到最大值。本实施例在最适条件下，我们对稻米进行cd
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含量检测，结果为：3b＝0.029mg/kg；华占＝0.331mg/kg，实验的效果达到最优。
94.考察实施例5检测方法的灵敏度：
95.采用实施例5的方法，对不同cd
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浓度(0～450nm)标准品进行了检测，结果见图5。
96.从图中可知，当cd
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浓度低至50nm(约为5.62*10-6g/kg)时均能显示出荧光(检测到)，而国标中规定稻米中cd
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浓度为不超过2*10-4
g/kg，我们的检测下限比gb低两个数量级甚至更低，证明本技术的检测方法灵敏度高。
97.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。