一种C5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用与流程

一种c5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及一种c5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.米尔贝霉素在国际上又被称为弥拜霉素，于1975年日本三共株式会社公司在筛选微生物发酵液时发现的物质，具有广谱防治活性，活性高，用量小，对人畜安全，不污染环境，对天敌无害，不易产抗性。米尔贝霉素主要成分为米尔贝霉素a3和a4，属16元大环内酯类抗生素，其结构与阿维菌素相类似，是一种微生物源杀虫杀螨剂，作用机理新颖，通过害螨或害虫的谷氨酸门控的cl-通道的开放，从而使cl-内流增加，带负电荷的cl-引起神经元休止电位超级化，使正常的动作电位不能释放，导致昆虫麻痹死亡。而其衍生物米尔贝肟主要通过增强虫体的抑制性神经递质gaba的释放使虫体麻痹死亡。米尔贝霉素对各种螨虫、农业害虫以及园艺害虫也有很好的防治效果，由于米尔贝霉素的渗透传导作用，喷洒在植物叶片上表面的药剂可渗透到叶片下表面，杀死靶标螨虫并对其形成长效的防治，另外，米尔贝霉素的杀螨活性也不易受温度的影响且作用机理不同于传统杀螨剂，对一些已生产抗性的害螨仍有很高的防效，因此被认为是当今世界上最优良的杀螨剂。
3.目前，米尔贝霉素现已在美国、日本等43个国家和地区进行了登记，但我国目前仍未进行米尔贝霉素及其衍生物的农药登记，其肟化物在我国已商品化用于兽药，可有效预防犬心丝虫症及驱除肠道内的寄生虫，如蛔虫、钩虫等。米尔贝肟是米尔贝霉素a3和a4的肟衍生物，对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。米尔贝肟较为普遍的是通过半合成的方法生产。首先由米尔贝霉素a3/a4产生菌株发酵得到米尔贝霉素a3/a4，然后将其c5-羟基氧化成酮。这种c5-酮米尔贝霉素与盐酸羟胺在二噁烷-甲醇-水中发生反应，得到米尔贝肟。显然，如果能获得直接产c5-酮米尔贝霉素的菌株，将缩短米尔贝肟的生产工艺，大幅降低生产成本。
4.根据已阐明的米尔贝霉素生物合成途径可知，米尔贝霉素a3/a4的生物合成首先形成c5-酮米尔贝霉素，再在milf基因编码的c5-酮还原酶作用下将c5位还原成羟基，得到米尔贝霉素a3/a4。2015年黄隽等人(黄隽、林甲檀、周敏、白骅，吸水链霉菌hs023 milf基因敲除构建5-酮米尔贝霉素基因工程菌，微生物学报，2015，55(1):107-113)利用同源重组的方法进行了milf基因敲除，获得了一株c5-酮米尔贝霉素基因工程菌。然而利用同源重组进行基因敲除操作复杂且耗时较长，需要进一步研究生产c5-酮基米尔贝霉素的工程菌的构建方法。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种c5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种c5-酮基米尔贝霉素生产菌株，所述c5-酮基米尔贝霉素生产菌株是以含有milf基因的米尔贝霉素a3/a4产生菌株为出发菌株，然后向出发菌株中转化携带crrna的crispri质粒，从而干扰milf基因表达所得。
8.根据本发明优选的，所述出发菌株为吸水链霉菌或冰城链霉菌。
9.根据本发明优选的，所述crrna的序列如seq id no.1所示。
10.根据本发明优选的，所述milf基因的序列如seq id no.2所示。
11.上述c5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法，包括步骤如下：
12.(1)以milf基因作为靶基因，在开放阅读框内搜索ddcpf1酶原间隔序列临近基序识别靶基因序列的ttv/tttv，选取原间隔序列临近基序之后的24个核苷酸为原间隔序列，即得到干扰milf基因表达的crrna，具体核苷酸序列如seq id no.2所示；然后将crrna插入至质粒载体pset-ddcpf1的4656位点处，得到重组质粒primilf；
13.(2)将重组质粒primilf转化大肠杆菌感受态细胞，经抗性筛选后得到转化子；然后将转化子接种于lb液体培养基中，过夜培养，再转接于lb液体培养基中，培养至od600值为0.4～0.6，离心后去除上清液，用lb液体培养基悬浮沉淀，得到转化子悬浮液；
14.(3)收集出发菌株的孢子至无菌tes溶液中，得到浓度为1
×
108～1.5
×
108个/ml的孢子悬浮液；将转化子悬浮液和孢子悬浮液混合后离心，去除75～85％上清液，通过剩余上清液重悬孢子并涂布于ms固体培养基上，在28～30℃下倒置培养16～19h后，在ms固体培养基上涂布含有萘啶酮酸和阿泊拉霉素的水溶液，继续置于28～30℃倒置培养6～8d，得到接合子单菌落；
15.(4)挑取接合子单菌落接种于ms固体培养基上，在28～30℃下培养6～8d，挑选阳性重组菌，再转接于斜面固体培养基上，在28～30℃下继续培养6～8d，得到c5-酮基米尔贝霉素生产菌株。
16.根据本发明优选的，步骤(1)中，所述质粒载体pset-ddcpf1为含有ddcpf1酶编码基因的质粒载体pset152。
17.根据本发明优选的，步骤(4)中，所述斜面固体培养基组分如下：蔗糖5.0g/l，脱脂奶粉1.0g/l，k2po
4 0.5g/l，麦芽提取物4.0g/l，ph 7.3。
18.上述c5-酮基米尔贝霉素生产菌株在制备c5-酮基米尔贝霉素中的应用。
19.根据本发明优选的，所述应用，包括步骤如下：
20.将c5-酮基米尔贝霉素生产菌株接种于的种子培养基中，在28～30℃，200～230rpm条件下培养36h，收集菌丝，然后将种子液按照6～10％的体积比接种至发酵培养基中，28～30℃，200～230rpm条件下培养8～10天，得发酵液，从发酵液中分离得到c5酮基米尔贝霉素。
21.根据本发明优选的，所述种子培养基组分如下：蔗糖8.0g/l，酵母提取物5.0g/l，蛋白胨3.5g/l，脱脂奶粉2.0g/l，k2po
4 0.5g/l，ph7.3。
22.根据本发明优选的，所述发酵培养基组分如下：蔗糖90.0g/l，黄豆饼粉15.0g/l，脱脂奶粉8.0g/l，棉籽蛋白粉5.0g/l，caco
3 3.0g/l，k2po
4 0.5g/l，feso
4 0.5g/l，ph7.5。
23.本发明的技术特点及有益效果：
24.1、本发明milf基因作为靶基因，采用crispri技术设计了干扰milf基因表达的
assisted multiplex genome editing and transcriptional repression in streptomyces.appl environ microbiol 84:e00827-18。https://doi.org/10.1128/aem.00827-18)
41.将所得的干扰质粒分别命名为primilf、primilf1、primilf2。
42.2.milf基因干扰突变菌的构建
43.将上述合成的干扰质粒primilf、primilf1、primilf2分别转化大肠杆菌et12567，在含有阿泊拉霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、氯霉素(50μg/ml)的lb固体培养基上进行培养，经抗性筛选后得到阳性转化子et12567/primilf、et12567/primilf1、et12567/primilf2。将阳性转化子分别接种于3ml lb液体培养基中(含有阿泊拉霉素25μg/ml、卡那霉素25μg/ml、氯霉素25μg/ml)，37℃振荡过夜培养。次日以3％的接种量转接于5ml新鲜的lb液体培养基(含有阿泊拉霉素25μg/ml、卡那霉素25μg/ml、氯霉素25μg/ml)，培养至od600值为0.4～0.6为佳。用50ml离心管离心去上清(thermo lynx6000，转子f14-14
×
50cy，8000r/min，10min)，再用10ml新鲜lb液体培养基洗涤菌体2次，最后用500μl新鲜lb液体培养基悬浮，分别得到转化子悬浮液。
44.刮取新鲜长成吸水链霉菌孢子至无菌tes溶液中(浓度为5.73％，ph值为7.2)制备孢子浓度为1
×
108个/ml的悬浮液，使用无菌tes溶液洗涤2次，置于29℃预萌发30min。
45.取500μl已预萌发的的孢子液分别加入到转化子悬浮液中，混合并轻摇，离心去除800μl上清液，利用200μl剩余上清液重新悬浮孢子并涂布于含有30mm mg
2
的ms固体培养基上，在29℃倒置培养18h，然后在ms固体培养基上涂布1ml含有0.2mg的萘啶酮酸及50μg阿泊拉霉素的水溶液，液体被吸收后，继续在29℃倒置培养，得到接合子。
46.3.milf基因干扰突变菌的筛选
47.选取生长速度快的接合子单菌落，然后挑取接合子单菌落接种于新鲜的ms固体培养基(含有阿泊拉霉素50μg/ml、萘啶酮酸0.5mg/ml)上，在29℃下培养7d并进行筛选，待孢子成熟后将其在无抗斜面固体培养基上继续培养，培养条件为29℃，最后获得5株产孢丰富，长势良好的干扰突变阳性的工程菌株。
48.实施例2：出发菌株吸水链霉菌和干扰突变阳性菌的发酵分析
49.分别取实施例1斜面培养所得工程菌株接种于种子培养基中，在29℃，230rpm条件下培养36h，取4ml的种子培养液转接于50ml的发酵培养基中，在29℃，230rpm培养8天。吸取1g搅拌均匀的发酵液至100ml三角瓶，加入20ml无水乙醇，超声波破碎30min后离心取上清液经过滤做hplc分析。
50.hplc条件，流动相：甲醇：乙醇：水＝350:100:50，流速：1.0ml/min，柱温：25℃，波长：242nm，进样量：10μl，分析柱：eclipse plus c18(4.6
×
150mm，5um，agilent)。
51.以crrna构建的干扰质粒成功干扰milf基因表达，将该干扰突变阳性的工程菌株命名为吸水链霉菌rimilf。
52.干扰突变菌rimilf及出发菌株吸水链霉菌的hplc分析结果如图2所示。由如图2可知，milf基因被干扰表达后可阻断c5-酮还原酶的合成，促使其合成c5-酮米尔贝霉素a3/a4，c5-酮米尔贝霉素a3/a4出峰时间较米尔贝霉素a3/a4均延后1min。说明本发明构建的干扰突变菌rimilf仅仅通过对携带所述crrna的primilf干扰质粒接合转移就可以沉默milf基因，有效地抑制了c5-酮还原酶将c5位还原成羟基，实现了c5-酮米尔贝霉素的工业生产，
缩短了c5-酮基米尔贝霉素的生产工艺周期，减少了昂贵试剂的使用，大幅降低了生产成本。