一种基于平衡补偿的重组流感病毒构建方法

1.本发明涉及流感病毒反向遗传学技术，尤其涉及一种基于平衡补偿的重组流感病毒构建方法。


背景技术：

2.近年来，反向遗传学的快速发展促进了携带多种报告基因且具有复制能力的重组甲型流感病毒(influenza a virus,iav)的产生，这些流感报告病毒能够实现病毒复制的快速量化。此外，基于流感报告病毒还能够建立病毒感染小动物活体成像模型，该模型对于新型抗病毒药物的开发具有重要意义。这些iav感染的活体成像动物模型对新型抗病毒药物的开发产生深远的影响。
3.然而，由于iav基因组的分节段结构限制了其对外来基因插入的耐受性，这些流感报告病毒在细胞或动物体内复制过程中，容易呈现复制能力降低、毒力下降或基因组不稳定等现象。因此，当前流感报告病毒构建大多选择较小的报告基因。
4.一系列定向进化策略能够为报告iav提供优化。例如，katsura et al.和cai et al.利用报告iav在小鼠中进行连续传代和定向筛选，最终产生的小鼠适应性突变株其毒力与野生型相近，且报告基因表达水平显著提高。测序分析显示，在这两种情况下，相关突变均发生于rna依赖的rna聚合酶(rdrp)，尽管其精确的突变位点有所不同[katsura h,et al.amino acid changes in pb2 and ha affect the growth of a recombinant influenza virus expressing a fluorescent reporter protein.sci rep.2016feb 5；6:19933.cai h,et al.directed evolution of an influenza reporter virus to restore replication and virulence and enhance noninvasive bioluminescence imaging in mice.j virol.2018jul 31；92(16):e00593-18.]。然而，考虑到这种定向进化策略极为耗时，且无法保证最终效果，开发一种普遍适用的重组流感病毒构建策略具有重要意义。
[0005]
甲型流感病毒的基因组包含8段单股负链病毒rna片段。根据各个片段负责编码的主要病毒蛋白，它们分别被命名为pb2,pb1,pa,ha,np,na,m,ns。在病毒复制的过程中，这8条病毒rna(vrna)分别与多个单位的np蛋白以及一组pa、pb1和pb2构成的rdrp(rna dependent rna polymerase)复合体行成vrnp，最终以vrnp(viral ribonucleoprotein)的形式包装进入病毒体。尽管这些病毒rna片段的长度从2341至891核苷酸不等，但它们都具有相似的遗传结构，节段中间为中心编码区，两端各有一段非编码区(ncr)。同时vrna的5'端前13个核苷酸(nts)和3'端前12个nts相互作用部分互补形成病毒rdrp复合物的启动子结构。流感聚合酶复合物和启动子结构的构象是可变的，通过相互作用动态地调节病毒转录和复制。此外，病毒基因组多节段需要结合病毒聚合酶进行复制和转录，这一过程中病毒基因组多节段存在相互竞争。例如，当rdrp复合物不足时，一个节段vrna的复制/转录会受到其他七个对应片段存在的负面影响，而随着聚合酶存量趋于饱和时，这种竞争可以得到缓解。
of pb1 segment of h5n1 influenza virus promotes rna polymerase activity and contributes to viral pathogenicity.plos one.2014；9(3):e93366.epub 2014/03/29.]。对于那些在其3'-ncr的保守区域携带原始c4的片段，可以采用c4到u4的突变作为补偿性增强。
[0016]
在一方面，片段特异性的ncr序列也参与了vrna的转录/复制。据报道，na基因3
′
端的u13到c13突变可以促进病毒rna和蛋白质的表达，而utr内其他位点的突变也可以不同程度地调节病毒基因组的转录和翻译[li x,et al.u13
→
c13 mutation in the variable region of the na gene 3'utr of h9n2 influenza virus influences the replication and transcription of na and enhances virus infectivity.virus genes.2019；55(4):440-7.epub 2019/04/27.]。在本发明的一个实施方案中，在na的可变ncr序列中，可以选择u13到c13的突变补偿重组病毒的衰减。
[0017]
在一方面，由于iav感染期间vrna和mrna的积累是动态的，并且是片段特异性的，病毒rdrp的固有活性和模板偏好都可能对调节有很大贡献。因此，在本发明的一个实施方案中，可以选择聚合酶突变来平衡补偿以实现基因组多节段的微平衡。
[0018]
上述所有平衡补偿方案可以独立或组合使用，以实现报告病毒基因组的适度补偿，即重新实现基因组多节段的微平衡。
[0019]
本发明包含如下技术方案：
[0020]
1、一种重组流感病毒的构建方法，其特征在于，所述方法基于平衡补偿的原则，在插入外源基因的目标节段引入补偿性突变，所述补偿性突变能够重新实现重组病毒基因组多节段的微平衡，产生具备遗传稳定性的重组流感病毒；
[0021]
其包括如下步骤：
[0022]
a.质粒材料制备，在插入外源基因的目标节段引入补偿性突变；
[0023]
b.病毒拯救，将病毒拯救质粒共同转染到宿主细胞中，经共同培养后，从上清液中收获重组流感病毒，反向遗传学拯救带有突变的重组流感病毒。
[0024]
2、根据编号1所述的方法，其特征在于，所述插入外源基因的目标节段选自如下任一种或至少两种的组合：ns、pb1、pb2、pa、na和np中的任一种；
[0025]
优选地，所述外源基因选自报告基因和/或编码免疫原性蛋白的基因；
[0026]
优选地，所述外源基因的大小为0.2kb
–
10kb，进一步优选为0.3kb
–
5kb，最优选为0.5kb
–
2kb；
[0027]
优选地，所述报告基因包括gluc和/或fluc；
[0028]
优选地，所述补偿性突变包括如下任一种或至少两种的组合：启动子增强突变、3'-ncr中的c4到u4的突变、na的可变ncr中的u13到c13的突变和聚合酶突变。
[0029]
3、根据编号1所述的方法，其特征在于，所述插入外源基因的目标节段为ns；
[0030]
所述外源基因为gluc；
[0031]
所述补偿性突变为启动子增强突变；
[0032]
所述启动子增强突变包括在ns-gluc片段的3'ncr上引入额外突变g3a/c8u。
[0033]
4、根据编号1所述的方法，其特征在于，所述插入外源基因的目标节段为ns；
[0034]
所述外源基因为fluc；
[0035]
所述补偿性突变为启动子增强突变；
[0036]
所述启动子增强突变包括在ns-fluc片段的3'ncr上引入额外突变g3a/u5c/c8u。
[0037]
5、根据编号1-4任一项所述的方法制备得到的重组流感病毒。
[0038]
6、一种重组报告流感病毒，其特征在于，在流感病毒的目标节段中插入报告基因，并且在插入所述报告基因的所述目标节段中引入补偿性突变，所述补偿性突变能够重新实现重组报告流感病毒基因组多节段的微平衡，产生具备遗传稳定性的重组报告流感病毒；其中，
[0039]
所述目标节段选自如下任一种或至少两种的组合：ns、pb1、pb2、pa、na和np中的任一种；
[0040]
所述报告基因的大小为0.2kb
–
10kb，进一步优选为0.3kb
–
5kb，最优选为0.5kb
–
2kb；
[0041]
所述补偿性突变包括如下任一种或至少两种的组合：启动子增强突变、3'-ncr中的c4到u4的突变、na的可变ncr中的u13到c13的突变和聚合酶突变。
[0042]
7、根据编号6所述的重组报告流感病毒，其特征在于，所述报告基因为gluc，所述重组报告流感病毒为pr8-ns38m-gluc，其平衡补偿后ns节段核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0043]
8、根据编号6所述的重组报告流感病毒，其特征在于，所述报告基因为fluc，所述重组报告流感病毒为pr8-ns358m-fluc，其平衡补偿后ns节段核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0044]
9、根据编号1-4任一项所述的重组流感病毒的构建方法、编号5所述的重组流感病毒或编号6-8任一项所述的重组报告流感病毒在构建流感小鼠的活体成像模型中的应用。
[0045]
10、根据编号1-4任一项所述的重组流感病毒的构建方法、编号5所述的重组流感病毒或编号6-8任一项所述的重组报告流感病毒在开发其他高致病性病毒或细菌的减活流感病毒载体疫苗中的应用。
[0046]
本发明具有如下优点：
[0047]
(1)基于本发明发现的重组流感病毒基因组多节段“平衡补偿”原则，在报告iav的构建过程中引入补偿突变来减少或消除病毒衰减机制。
[0048]
(2)成功构建了两株携带不同报告基因的报告病毒pr8-ns38m-gluc和pr8-ns358m-fluc，具备稳定的复制能力、毒力和基因组稳定性，pr8-ns358m-fluc病毒至少在5次传代中表现出合理的遗传稳定性。
[0049]
(3)本发明的方法进一步扩大了iav基因组对外来插入片段的遗传耐受性。本研究不仅提供了多种有价值的报告型iav和强大的iav感染活体成像小鼠模型，而且还为构建具有更多功能的新型报告病毒提供思路及可参考的数据，如表达两个或三个来自不同片段的外来报告基因的双或三报告病毒。此外，本发明方法的可行性为开发其他高致病性病毒和细菌的减活流感病毒载体疫苗提供了更好的机会。
附图说明
[0050]
图1为现有技术ppoli-ns-gluc的构建方案及其突变子ppoli-ns38m-gluc、ppoli-ns358m-gluc的构建方案；*，启动子增强突变；
[0051]
图2是本发明实施例1中的gluc插入导致ns节段失衡检测及启动子增强突变g3a/
c8u、g3a/u5c/c8u的平衡补偿能力检测；
[0052]
图3是本发明实施例2中的不同gluc报告流感病毒及平衡补偿突变株的体外复制动力学分析；
[0053]
图4是本发明实施例2中的不同gluc报告流感病毒及平衡补偿突变株的毒力分析；
[0054]
图5是本发明实施例3中的ppoli-ns-fluc及突变子ppoli-ns38m-fluc、ppoli-ns358m-fluc的构建方案；*，启动子增强突变；
[0055]
图6是本发明实施例3中的对比gluc和fluc插入导致ns节段失衡程度及启动子增强突变的平衡补偿能力检测；
[0056]
图7是本发明实施例4中的重组报告病毒pr8-ns38m-fluc及pr8-ns358m-fluc的遗传稳定性检测；
[0057]
图8是本发明实施例4中的重组报告病毒pr8-ns358m-fluc和亲本株pr8-wt病毒的体外复制动力学的比较；
[0058]
图9是本发明实施例4中的重组报告病毒pr8-ns358m-fluc的毒力分析；
[0059]
图10是本发明实施例5中的利用小动物活体成像技术监测重组流感病毒pr8-ns358m-fluc在小鼠体内的复制动态；
[0060]
图11是本发明实施例5中的重组流感病毒pr8-ns358m-fluc在小鼠体内的复制动态曲线；
[0061]
图12是本发明实施例5中的基于重组流感病毒pr8-ns358m-fluc在小鼠体内的生物发光密度和肺部病毒载量地相关性评价；
[0062]
图13是本发明实施例5中的利用基于重组流感病毒pr8-ns358m-fluc的流感小鼠成像模型评价抗流感阳性药物奥司他韦的抗病毒效果。
具体实施方式
[0063]
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
[0064]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0065]
实施例1：启动子序列g3a/c8u突变能够适度补偿gluc插入目标ns节段的平衡
[0066]
a.质粒材料制备。为了在ns-gluc片段中引入启动子增强突变，分别利用引物对ncrns-38m-正向与5'-ncr-反向、ncrns-358m-正向与5'-ncr-反向，以pdz-ns-gluc质粒为模板，扩增出ns38m-gluc及ns358m-gluc片段。然后将扩增片段分别与线性化ppol-i载体相连，生成ppoli-ns38m-gluc及ppoli-ns358m-gluc重组表达质粒。其中ppoli-ns-gluc、ppoli-ns38m-gluc和ppoli-ns358m-gluc的构建方案如图1所示。所用引物序列如下：
[0067]
引物ncrns-38m-正向：
[0068]
gggaccatgccggccagtaaaaacagggtgacaaagacataatg
[0069]
引物ncrns-358m-正向：
[0070]
gggaccatgccggccagtagaaacagggtgacaaagacataatg
[0071]
引物5'-ncr-反向：gggccgccgggttattagtagaaacaagg
[0072]
b.修饰后目标节段与天然节段的平衡性检测。将天然ns节段、gluc插入修饰的ns-gluc节段、或带有启动子增强突变ns38m-gluc或ns358m-gluc的节段重组表达质粒分别与天然m节段表达质粒(ppoli-m)共转染到表达rdrp的293t细胞中。孵育24小时后，收获细胞进行总rna提取。使用通用3'ncr引物rt-3'ncr进行vrna-m的反转录，使用ns特异性引物rt-vrna-ns和oligo(dt)分别对vrna和mrna进行反转录，然后使用ns特异性和m特异性qpcr-引物进行qpcr。ns片段的vrna和mrna水平被归一化为m的表达水平，以分别反应其复制和转录效率。结果通过rdrp实验qrt-pcr分析，两组突变体g3a/c8u和g3a/u5c/c8u引入都明显提高了了ns-gluc vrna的复制(图2)。有趣的是，g3a/c8u突变能够对gluc插入修饰导致的节段失衡进行适度补偿，而g3a/c8u则补偿过度(图2)。
[0073]
qpcr引物序列为：
[0074][0075]
实施例2:重组报告病毒pr8-ns38m-gluc的构建及评价
[0076]
依据实施例1的检测结果，本实施例选择ns38m-gluc用于重组报告病毒的包装。
[0077]
病毒包装步骤如下：pr8-ns38m-gluc报告病毒拯救质粒包括pdz-pa、-pb1、-pb2、-np、-ha、-na、-m和ppoli-ns38m-gluc。根据说明书的要求，使用lipofectamine 2000共同转染到293t细胞中。在转染后24小时(h.p.t.)，加入消化的mdck细胞与293t细胞共同培养。培养48小时后，从上清液中收获pr8流感报告病毒。经斑块纯化后，在10日龄的鸡胚中扩增病毒。收获的pr8-ns38m-gluc报告病毒其修饰后ns节段序列如seq id no.1所示。
[0078]
对扩增得到的重组报告病毒pr8-ns38m-gluc进行体内外病毒的特征检测。体外实验包括检测报告病毒的生长曲线，将mdck细胞铺于6孔板中，以0.01tcid
50
的感染复数(moi)感染流感病毒。在37℃下孵育1小时后，冲洗细胞并加入含有2μg/ml tpck-trypsin的新鲜opti-mem培养液。在不同的时间点收取病毒上清液进行病毒滴定和荧光素酶的检测。
[0079]
对于gluc荧光素酶活性的检测，使用piercetm gaussia luciferase flash assay kit试剂盒，将50μl的病毒上清培养液(应用适当的稀释以避免超过范围)与50μl的荧光素酶底物混合。使用sirius l tube luminometer立即检测发光情况。
[0080]
优化的pr8-ns38m-gluc报告病毒与原来的pr8-ns-gluc病毒相比，复制动力学有所改善，与亲本野生型pr8病毒(pr8-wt)几乎相同(图3)。这些结果表明，对修饰片段进行适当的补偿性增强(引入g3a/c8u双突变)可以恢复报告型iav的野生型体外复制动力学。此外，三突变g3a/c8u/u8c启动子较双突变g3a/c8u启动子其起始基因组转录/复制的能力更强，然而实验结果显示在目标修饰ns节段引入超增强三突变则会由于补偿过度，再次破坏
多个片段的平衡，导致重组报告病毒的衰减。所以对报告病毒pr8-ns-gluc的优化以引入g3a/c8u双突变为主。
[0081]
为了确定引入g3a/c8u突变是否能恢复pr8-ns-gluc病毒减弱的病毒毒力，检测了pr8-ns38m-gluc在小鼠体内的半数致死量，同时以亲本株流感病毒pr8-wt和pr8-ns-gluc报告病毒作为对照。将雌性balb/c小鼠随机分成组，每组5只。设置健康对照组、亲本株pr8-wt病毒感染对照组、pr8-ns-gluc病毒感染对照组及pr8-ns38m-gluc病毒感染组，每个病毒感染组分别设置101tcid
50
，102tcid
50
，103tcid
50
，104tcid
50
，105tcid
50
五个剂量组。用pbs将报告病毒稀释到30μl中含有上述设定的滴度。小鼠异氟烷呼吸麻醉后，每只小鼠滴鼻感染流感病毒30μl，感染病毒当天记为0天，该天小鼠的体重百分率记作100％。每天小鼠称重监测小鼠的体重变化及生存率状况，实验周期为14天。小鼠体重下降20％以上即看作小鼠死亡。统计各组小鼠体重百分比数据，做出体重变化曲线，计算半数致死剂量ld
50
。
[0082]
结果如图4所示，pr8-wt感染在100 tcid
50
的剂量下会导致小鼠体重迅速下降，而pr8-ns-gluc感染的小鼠则会出现延迟和轻微的体重下降。与原来的pr8-ns-gluc病毒相比，pr8-ns38m-gluc病毒导致小鼠体重下降更加迅速和严重，尽管它的毒力仍不及亲代pr8-wt病毒。类似的毒力恢复也可以从致死率数据中反映出来，因为pr8-wt病毒是完全致死的，而pr8-ns-gluc病毒在指定剂量下是亚致死的，pr8-ns38m-gluc造成60％的致死率(图4)。这些数据清楚地表明，重组报告iav在小鼠体内的毒力可以通过引入g3a/c8u双突变重新平衡插入报告病毒的修饰片段而得到部分恢复。
[0083]
实施例3：启动子序列g3a/c8u或g3a/u5c/c8u突变能够不同程度补偿fluc插入目标ns节段的平衡
[0084]
基于前期实验结果，考虑基因组再平衡策略是否允许iav基因组容忍更长外源性基因的插入，例如fluc基因(～60kda)。fluc在活体成像研究中具有独特的优势，包括相对容易的底物给药(腹腔注射)，信号的长效发光动力学，低成本。更重要的是，fluc作用于底物后发光具有较长的峰值发射波长(～612nm)，其组织穿透能力较强，更适用于活体成像过程。然而，fluc的尺寸很大(～60kda)，iav的基因组很难容忍如此大的插入。到目前为止，还没有稳定的基于fluc的报告型iav可用。
[0085]
为了解决这个问题，构建ns-gluc片段的gluc基因被fluc取代，产生了ns-fluc。考虑到大得多的fluc可能会干扰ns1的功能，于是在ns1和fluc之间插入了一个额外的2a蛋白酶序列以避免融合(图5)。
[0086]
a.质粒材料制备。除了在ns1和fluc之间插入一个额外的2a蛋白酶序列以避免融合外，采用与构建ns-gluc类似的策略构建了ppoli-ns-fluc(图5)。为了在野生型的ns-fluc片段中引入启动子g3a/c8u和g3a/u5c/c8u突变，分别利用引物对ncrns-358m-正向与引物5'-ncr-反向、ncrns-358m-正向与5'-ncr-反向，以ppoli-ns-fluc质粒为模板，扩增出ns38m-fluc及ns358m-fluc片段。然后将扩增的片段分别与线性化ppol-i载体相连，生成ppoli-ns38m-fluc及ppoli-ns358m-fluc重组表达质粒(图5)。
[0087]
引物ncrns-38m-正向：
[0088]
gggaccatgccggccagtaaaaacagggtgacaaagacataatg
[0089]
引物ncrns-358m-正向：
[0090]
gggaccatgccggccagtagaaacagggtgacaaagacataatg
system试剂盒。检测过程为将mdck细胞按照一定密度铺于96孔板中的，以0.01的moi感染pr8-ns358m-fluc病毒。在37℃下培养1小时后，pbs冲洗细胞并加入含有2μg/ml tpck-trypsin的新鲜opti-mem培养液。在感染后24小时(p.i.)，弃去培养基上清，然后每孔依次加入50μl pbs和50μl底物。孵育10分钟后，立即用biotek synergy neo2微板阅读器检测发光情况。
[0104]
在小鼠模型中，为了确定引入g3a/u5c/c8u突变对重组pr8-ns358m-fluc病毒毒力的影响，检测了pr8-ns358m-fluc在小鼠体内的半数致死量，同时以亲本株流感病毒pr8-wt作为对照。将雌性balb/c小鼠随机分成组，每组5只。设置健康组，每个病毒设置102tcid
50
，103tcid
50
，104tcid
50
，105tcid
50
剂量组。用pbs将报告病毒稀释到30μl中含有上述设定的滴度。小鼠异氟烷呼吸麻醉后，每只小鼠滴鼻感染流感病毒30μl，感染病毒当天记为0天，该天小鼠的体重百分率记作100％。每天小鼠称重监测小鼠的体重变化及生存率状况，实验周期为14天。小鼠体重下降20％以上即看作小鼠死亡。统计各组小鼠体重百分比数据，做出体重变化曲线，计算半数致死剂量ld50。
[0105]
结果显示pr8-ns358m-fluc具有感染性和致病性，导致体重迅速下降。此外，重组病毒在高感染剂量下造成100％的死亡(图9)。
[0106]
实施例5：iav感染小鼠活体成像动物模型的建立及应用
[0107]
接下来评估了pr8-ns358m-fluc在建立iav感染的活体成像小鼠模型方面的潜力。在小鼠异氟烷呼吸麻醉后，滴鼻感染亚致死剂量(1000 tcid
50
)的重组报告病毒pr8-ns358m-fluc，并每天监测流感小鼠肺部动态生物发光情况。
[0108]
检测过程主要步骤为，对感染亚致死剂量的pr8-ns358m-fluc小鼠进行麻醉，并以150mg/kg的剂量腹腔注射底物d-荧光素。在底物给药后10分钟，用xenogen ivis 200获取图像，并使用living image软件(4.4版)进行分析。
[0109]
成像结果可以看到同一只小鼠肺部流感病毒复制和组织分布随时间的变化情况(图10)。结果显示病毒感染是从小鼠鼻腔相关组织和两叶肺部开始的。iav感染的动态变化也被清楚地展示出来。如图11所示，小鼠肺部生物发光(bli信号)情况信号最早可在感染后第1天(p.i.)检测到，然后在第2或第3天升高并达到峰值，在第6天后，信号明显下降，表明肺部病毒清除成功。在一个单独的实验中，对感染后1、3、5、7、9天对小鼠群进行了成像和解剖(每个时间点3只小鼠)，并说明了bli信号强度与肺部病毒载量之间的高度相关性(图12)。这表明，bli监测可以准确地反映小鼠体内的流感病毒的复制情况。
[0110]
为了进一步确定基于bli的iav感染小鼠模型是否可用于评估抗病毒疗法的疗效，从病毒感染前2小时开始，给小鼠口服10或30mg/kg/day的磷酸奥司他韦，每天两次。在感染后第2天和5天进行成像，结果发现两种剂量的奥司他韦都明显降低了流感病毒信号强度，表明磷酸奥司他韦对iav感染的有效保护(图13)。这些结果清楚地表明，使用基于pr8-ns358m-fluc的活体成像小鼠模型可以敏感地检测到抗病毒药物干预的疗效。
[0111]
基于以上公开，本发明提出并证明了人工操纵iav基因组的如下基本原则，即应保持流感分节段基因组之间的微平衡，进行“平衡补偿”。上述实施例清楚地表明，“启动子增强突变”g3a/c8u的引入可以补偿ns-gluc的复制/转录效能的降低，而一组更强的增强突变g3a/u5c/c8u会导致过度补偿，产生更加糟糕的结果(图2-3)。但当应用于pr8-ns-fluc的优化时，即，当插入的外源基因片段更长时，g3a/u5c/c8u的作用要优于g3a/c8u，因为fluc更
大，对平衡的破坏更严重(图6-图9)。这些数据都强调了在iav复制/转录以及蛋白质表达和随后的病毒包装过程中对多个片段的微平衡的关键需求，以及本发明提出的“平衡补偿”的可行性。
[0112]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。