HN基因易位构建重组新城疫疫苗候选株VII-HNF的方法及用途

hn基因易位构建重组新城疫疫苗候选株vii-hnf的方法及用途
技术领域
1.本发明涉及应用反向遗传技术，特别涉及hn基因易位构建重组新城疫疫苗候选株vii-hnf的方法，该vii-hnf用于研制疫苗。


背景技术：

2.新城疫是由新城疫病毒(newcastle disease virus，ndv)强毒株引起的对世界养禽业危害极为严重的一种烈性传染病。ndv的基因组为不分节段、单股负链的rna，ndv的基因组结构模式为3
′‑
np-p-m-f-hn-l-5
′
，依次编码核衣壳蛋白(np)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、融合蛋白(f)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(hn)和大分子聚合酶蛋白(l)6种结构蛋白[yusoff，k.，and tan，w.s.newcastle disease virus：macromolecules and opportunities.avian pathol，2001，30(5)：439-55.]。np、p及l蛋白与病毒基因组rna共同形成rnp复合物，该复合物是病毒的最小感染单位，在细胞中能有效启动基因组的复制和转录，可产生感染性的病毒粒子[marcos，f.，ferreira，l.，cros，j.，park，m.s.，nakaya，t.，garcia-sastre，a.，and villar，e.mapping of the rna promoter of newcastle disease virus.virology，2005，331(2)：396-406.]。ndv基因组的转录呈现极性效应，越靠近3
′
端的基因其转录产物越丰，因此在病毒粒子中np蛋白的含量最高。
[0003]
在ndv的致病与免疫过程中，病毒表面的两个囊膜糖蛋白f和hn扮演了重要的角色。ndv毒株之间的毒力差异很大[dimitrov，k.m.，ramey，a.m.，qiu，x.，bahl，j.，and afonso，c.l.temporal，geographic，and host distribution of avian paramyxovirus 1(newcastle disease virus).infect genet evol，2016，39：22-34.]，根据对鸡和鸡胚的致病性及毒力不同，可将ndv分成强毒型、中等毒力型和弱毒型三种。f蛋白是ndv毒力和致病性的主要决定因素，在病毒的感染过程中介导病毒和细胞膜发生融合[panda，a.，huang，z.，elankumaran，s.，rockemann，d.d.，and samal，s.k.role of fusion protein cleavage site in the virulence of newcastle disease virus.microbial pathogenesis，2004，36(1)：1-10.]。强毒株f蛋白的裂解位点为多个碱性氨基酸连续排列，可被机体多个组织器官的多种蛋白酶裂解，因此，可导致全身性感染。弱毒株在f蛋白裂解区域112和115位碱性氨基酸则被中性氨基酸所代替，使相应序列成为g/e112-k/r-q-g/e115-r-l117，这种f蛋白前体仅能被有限的组织或器官分泌的胰样蛋白酶裂解，感染性很弱或无感染性[liu，h.，servan de almeida，r.，gil，p.，and albina，e.cleavage site of newcastle disease virus determines viral fitness in persistent infection cells.vet microbiol，2018，216：123-31.]。应用反向遗传技术将强毒f蛋白裂解位点序列突变为弱毒的特征序列后，其毒力明显下降[hu，s.，ma，h.，wu，y.，liu，w.，wang，x.，liu，y.，and liu，x.a vaccine candidate of attenuated genotype vii newcastle disease virus generated by reverse genetics.vaccine，2009，27(6)：904-10.]，充分证明f蛋白与ndv的毒力密切相关，因此减少病毒中f蛋白的含量，可有效降低病毒的毒力。另外一个病
毒囊膜糖蛋白hn具有识别靶细胞的唾液酸受体，介导病毒对靶细胞的吸附，并促使新生的病毒粒子从感染细胞表面释放的功能[adu-gyamfi，e.，kim，l.s.，jardetzky，t.s.，and lamb，r.a.mutagenesis of paramyxovirus hemagglutinin-neuraminidase membrane-proximal stalk region influences stability，receptor binding，and neuraminidase activity.j virol，2016，90(17)：7778-88.]。hn蛋白在ndv的免疫过程中起到非常重要的作用，由该蛋白诱导产生的血凝抑制(hi)抗体的水平高低，已成为当前评价新城疫疫苗免疫效力的主要指标。2017年和2019年扬州大学和中国农业大学相关课题组分别将疫苗病毒的hn蛋白以流行株的hn进行替换，均发现hn替换后的重组病毒与母本病毒相比，抑制流行株排毒的能力明显增强，从而证实疫苗株与流行株之间hn蛋白的同源程度，与疫苗抑制流行株感染和排毒的能力密切相关[liu，j.j.，zhu，j.，xu，h.x.，li，j.，hu，z.l.，hu，s.l.，wang，x.q.，and liu，x.f.effects of the hn antigenic difference between the vaccine strain and the challenge strain of newcastle disease virus on virus shedding and transmission.viruses-basel，2017，9：8.]。因此增加ndv疫苗株中hn蛋白的含量，可增强疫苗对ndv流行强毒株的免疫效力。
[0004]
疫苗是控制nd的主要措施，研究证明，使用与流行株基因型相匹配的疫苗，能有效预防流行强毒株的感染，在这当中hn蛋白扮演了重要的角色[bu，y.w.，yang，h.m.，jin，j.h.，zhao，j.，xue，j.，and zhang，g.z.recombinant newcastle disease virus(ndv)la sota expressing the haemagglutinin-neuraminidase protein of genotype vii ndv shows improved protection efficacy against ndv challenge.avian pathol，2019，48(2)：91-7.]。目前中国流行的ndv强毒株为基因vii型，而使用最为广泛的弱毒活疫苗为基因ii型，为此研制出适合1日龄雏鸡免疫的基因vii型弱毒活疫苗在中国具有广阔的应用前景。hu等通过f蛋白裂解位点突变的方式获得了基因vii型弱毒株ndv/ai4，但该致弱株仍具有一定的毒力[hu，z.，hu，s.，meng，c.，wang，x.，zhu，j.，and liu，x.generation of a genotype vii newcastle disease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.avian dis，2011，55(3)：391-7.]。


技术实现要素：

[0005]
发明目的：本发明的目的提供的一种hn基因易位构建重组新城疫疫苗候选株vii-hnf的方法。本发明hn基因易位编码于f基因前的重组新城疫疫苗候选株vii-hnf，于2021年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号v202177。
[0006]
本发明的另一目的是提供所述hn基因易位构建重组新城疫疫苗候选株vii-hnf的用途。
[0007]
技术方案：本发明所述的hn基因易位构建重组新城疫疫苗候选株vii-hnf的方法，如下：
[0008]
以新城疫病毒js-5-05-go致弱株ai4的基因组为研究对象，将其中的hn基因易位至f基因之前，得到易位的重组新城疫病毒基因组全长，将含该基因组全长的载体与辅助质粒共转染细胞后获得易位重组病毒vii-hnf。
[0009]
进一步地，构建方法为：以基因viid亚型新城疫病毒js-5-05-go致弱株ai4的基因组全长转录载体pndv/ai4为骨架，将其中的hn基因易位至f基因之前，得到易位重组新城疫
病毒基因组全长cdna克隆pndv/rai4-hnf，将该质粒与辅助质粒共转染bsr-t7/5细胞后获得易位重组病毒vii-hnf。
[0010]
进一步地，构建方法为：
[0011]
1.全长克隆pndv/rai4-hnf的构建
[0012]
以基因viid亚型新城疫病毒js-5-05-go致弱株ai4的基因组为研究对象，根据基因组序列设计特异性引物分别扩增出hn基因与上游m基因、p基因部分序列片段，利用同源重组将扩增出来的基因片段与线性化pcr2.1载体连接，获得重组质粒pcr2.1/p-m-hn；以相同的方法扩增出f基因与下游l基因部分序列，将扩增的序列与pcr2.1载体连接，获得重组质粒pcr2.1/f-l。通过分子克隆的方法，在pcr2.1载体中将两个片段相连后获得易位编辑后的重组质粒pcr2.1/p-m-hn-f-l。分别用限制性内切酶agei和fspai对质粒pcr2.1/p-m-hn-f-l和含有ndvai4株全长cdna克隆的转录载体pndv/ai4进行双酶切，电泳后回收目的片段并进行酶切连接，从而将易位编辑后的片段p-m-hn-f-l替换到ai4株基因组中的对应部分，构建出f和hn基因易位编码的转录载体pndv/rai4-hnf，易位编辑后其基因组结构为3
′‑
np-p-m-hn-f-l-5
′
。
[0013]
2.重组病毒vii-hnf株的拯救
[0014]
将全长质粒pndv/rai4-hnf与pci-np、pci-p和pci-l三个辅助质粒共转染bsr-t7/5细胞，转染后加入spf鸡胚尿囊液，收集上清，并接种spf鸡胚，收集96-120h后的鸡胚尿囊液，测定血凝效价，获得重组病毒vii-hnf。
[0015]
进一步地、
[0016]
扩增ai4基因组的2879-4503nt区域获得pmhn1的引物序列为：
[0017]
pmhn1-f：5
′‑
agtgtgctggaattcggcttaccggtgcagcacccttc-3
′
(seq id no.1)；
[0018]
pmhn1-r：5
′‑
ctctgaccgttctacccgtgttttttctaatt-3
′
(seq id no.2)。
[0019]
扩增ai4基因组的6327-8328nt区域获得pmhn2的引物序列为：
[0020]
pmhn2-f：5
′‑
aattagaaaaaacacgggtagaacggtcagag-3
′
(seq id no.3)；
[0021]
pmhn2-r：5
′‑
atatctgcagaattcggcttttttttcttaataaagtgacagtgggcgagac-3
′
(seq id no.4)。
[0022]
扩增ai4基因组的4504-6259nt区域获得fl1的引物序列为：
[0023]
fl1-f：5
′‑
agtgtgctggaattcggcttttactgggaacaagcaaccaaagagcaatgcacgggtagaagagtctggatccc-3
′
(seq id no.5)；
[0024]
fl1-r：5
′‑
ccttatatgtcaatgcttcttgtgttttttcttaagtcttc-3
′
(seq id no.6)。
[0025]
扩增/ai4基因组的8329-9527nt区域获得fl2的引物序列为：
[0026]
fl2-f：5
′‑
gaagacttaagaaaaaacacaagaagcattgacatataagg-3
′
(seq id no.7)；
[0027]
fl2-r：5
′‑
atatctgcagaattcggcttgtgcgcacatctggctcct-3
′
(seq id no.8)。
[0028]
扩增pcr2.1/p-m-hn的片段区域的引物序列为：
[0029]
pmhn1-f：5
′‑
agtgtgctggaattcggcttaccggtgcagcacccttc-3
′
(seq id no.1)；
[0030]
pmhnfl-r：5
′‑
ggttgcttgttcccagtaattttttcttaataaagtg-3
′
(seq id no.9)。
[0031]
扩增pcr2.1/f-l的片段区域的引物序列为：
[0032]
pmhnfl-f：5
′‑
cactttattaagaaaaaattactgggaacaagcaacc-3
′
(seq id no.10)；
[0033]
fl2-r：5
′‑
atatctgcagaattcggcttgtgcgcacatctggctcct-3
′
(seq id no.8)。
[0034]
本发明经转染获得的重组病毒vii-hnf在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。
[0035]
本发明的hn基因易位于f基因前的重组新城疫疫苗候选株，相对降低f蛋白的表达量以降低病毒的毒力，同时增加hn蛋白的表达量以增强致弱毒株对流行毒株的免疫效力，用于制造新型安全高效的nd疫苗。
[0036]
通过对含有ai4基因组的全长克隆载体pndv/a14进行改造，将其hn基因易位编码至f基因之前，成功构建了全长克隆载体pndv/rai4-hnf，经反向遗传操作获得了易位重组疫苗vii-hnf，其尿囊液的ha效价为10log2。
[0037]
本研究公开所述hn基因易位编码于f基因前的重组新城疫疫苗候选株vii-hnf的构建方法，其特征在于：以基因viid亚型新城疫病毒js-5-05-go致弱株ai4的基因组全长转录载体pndv/ai4为骨架，将其中的hn基因易位编码至f基因之前，得到易位重组新城疫病毒基因组全长cdna克隆pndv/rai4-hnf。该重组质粒与辅助质粒共转染bsr-t7/5细胞后，获得了具有较高繁殖性能的易位重组新城疫病毒vii-hnf，且毒力弱，适合于疫苗的制造。
[0038]
另外，该致弱毒株为基因viid亚型与当前新城疫流行株的基因型相一致，因此，同常规疫苗相比，易位重组疫苗株vii-hnf在控制当前新城疫的发病和流行方面显示出了广阔的应用前景。
[0039]
有益效果：本研究根据ndv基因组转录的极性效应，在确保基因组复制和转录水平的前提下，将流行株hn基因在基因组上的位置前移，相对降低f蛋白的表达量以降低病毒的毒力，同时增加hn蛋白的表达量以增强致弱毒株对流行毒株的免疫效力，研制出安全性更好，对流行株免疫效力更强的基因vii型弱毒疫苗候选株。
附图说明
[0040]
图1为重组质粒pndv/rai4-hnf构建模式图。
具体实施方式
[0041]
hn基因易位编码于f基因前的重组新城疫疫苗候选株vii-hnf于2021年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：武汉大学保藏中心)，分类命名为新城疫病毒vii-hnf，保藏号cctcc no：v202177。
[0042]
构建步骤一：hn基因易位于f基因之前的全长表达克隆的构建
[0043]
生物材料准备：
[0044]
含新城疫病毒a14株的基因组全长的载体pndv/a14(hu，z.，hu，s.，meng，c.，wang，x.，zhu，j.，and liu，x.generation of a genotype vii newcastle disease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.avian dis，2011，55(3)：391-7.)由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室构建、保存。
[0045]
pcr2.1载体：购自invitrogen公司；amv反转录酶、high fidelity dna polymerase、t4 dna连接酶、agarose gel dna extraction kit购自roche公司；转染试剂superfect和质粒抽提试剂盒(qiaprep spin miniprep kit)为qiagen公司产品；fastpfu pcr supermix及t1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶购自thermo scientific；seamless cloning master mix：购自生工生物工程(上海)股份有限
公司；其余常规试剂均为国产分析纯。
[0046]
1、中间质粒pcr2.1/p-m-hn-f-l的获得
[0047]
以基因viid亚型ndv/js-5-05-go致弱株ai4的基因组全长为研究对象，根据其全基因组序列设计引物，分别扩增出hn基因与上游m基因、p基因部分序列片段，f基因与下游l基因部分序列片段。
[0048]
引物序列是：
[0049]
pmhn1-f：5
′‑
agtgtgctggaattcggcttaccggtgcagcacccttc-3
′
(seo id no.1)
[0050]
pmhn1-r：5
′‑
ctctgaccgttctacccgtgttttttctaatt-3
′
(seq id no.2)
[0051]
pmhn2-f：5
′‑
aattagaaaaaacacgggtagaacggtcagag-3
′
(seq id no.3)
[0052]
pmhn2-r：5
′‑
atatctgcagaattcggcttttttttcttaataaagtgacagtgggcgagac-3
′
(seq id no.4)
[0053]
fl1-f：5
′‑
agtgtgctggaattcggcttttactgggaacaagcaaccaaagagcaatgcacgggtagaagagtctggatccc-3
′
(seq id no.5)
[0054]
fl1-r：5
′‑
ccttatatgtcaatgcttcttgtgttttttcttaagtcttc-3
′
(seq id no.6)
[0055]
fl2-f：5
′‑
gaagacttaagaaaaaacacaagaagcattgacatataagg-3
′
(seq id no.7)
[0056]
fl2-r：5
′‑
atatctgcagaattcggcttgtgcgcacatctggctcct-3
′
(seq id no.8)
[0057]
同源臂用下划线标注；以上引物由南京擎科生物有限公司合成。
[0058]
pcr反应：以转录载体pndv/ai4为模板配制如下pcr反应体系：
[0059][0060]
pcr反应循环参数：95℃预变性2min，95℃20s，57℃20s，72℃延伸，延伸时间为2min/kb，25个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
[0061]
用引物pmhn1-f和pmhn1-r扩增ai4基因组的2879-4503nt区域，扩增片段经agarose gel dna extraction kit回收，获得pmhn1；用引物pmhn2-f和pmhn2-r扩增ai4基因组的6327-8328nt区域，获得pmhn2；用引物fl1-f和fl1-r扩增ai4基因组的4504-6259nt区域，获得fl1；用引物fl2-f和fl2-r扩增/a14基因组的8329-9527nt区域，获得fl2。
[0062]
回收片段pmhn1、pmhn2与pcr2.1载体通过同源重组相连，转化至大肠杆菌t1感受态细胞，提取质粒，阳性质粒命名为pcr2.1/p-m-hn；回收目的片段fl1、fl2与pcr2.1载体通过同源重组相连，转化至大肠杆菌t1感受态细胞，提取质粒，阳性质粒命名为pcr2.1/f-l。
[0063]
再次通过同源重组的方法，在pcr2.1载体中将p-m-hn与f-l两个片段相连。
[0064]
引物序列是：
[0065]
pmhn1-f：5
′‑
agtgtgctggaattcggcttaccggtgcagcacccttc-3
′
(seo id no.1)
[0066]
pmhnfl-r：5
′‑
ggttgcttgttcccagtaattttttcttaataaagtg-3
′
(seq id no.9)
[0067]
pmhnfl-f：5
′‑
cactttattaagaaaaaattactgggaacaagcaacc-3
′
(seq id no.10)
[0068]
fl2-r：5
′‑
atatctgcagaattcggcttgtgcgcacatctggctcct-3
′
(seq id no.8)
[0069]
同源臂用下划线标注；以上引物由南京擎科生物有限公司合成。
[0070]
用引物pmhn1-f和pmhnfl-r扩增pcr2.1/p-m-hn的片段区域，长度为3627bp；用引物pmhnfl-f和fl2-r扩增pcr2.1/f-l的片段区域，长度为3022bp。扩增片段经agarose gel dnaextraction kit回收纯化后与pcr2.1载体通过同源重组相连，转化至大肠杆菌t1感受态细胞，提取质粒，阳性质粒命名为pcr2.1/p-m-hn-f-l。
[0071]
2、全长克隆pndv/rai4-hnf的获得
[0072]
质粒pcr2.1/p-m-hn-f-l和pndv/ai4同时用agei和fspai进行双酶切，回收pcr2.1/p-m-hn-f-l酶切后的大片段和pndv/ai4大片段。将pcr2.1/p-m-hn-f-l酶切产物与pndv/ai4酶切产物连接，构建出重组ndv基因组全长克隆pndv/rai4-hnf(见图1)。
[0073]
步骤二：重组病毒vii-hnf株的拯救
[0074]
生物材料准备
[0075]
可稳定表达t7rna聚合酶的bsr-t7/5细胞：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。cef细胞由实验室按常规方法自行制备。
[0076]
真核表达质粒pci-np、pci-p、pci-l(胡顺林，张艳梅，孙庆，刘玉良等.鹅源新城疫病毒拯救体系的建立[j].微生物学通报.2007，34(3))：由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。其中，表达np和p基因的真核表达质粒pci-np、pci-p还公开于(刘玉良.(2005).从cdna克隆产生感染性zj1株鹅源新城疫)；表达l基因的真核表达质粒pci-l还公开于(胡顺林.(2007).鹅源新城疫病毒反向遗传技术平台的建立及其应用)。
[0077]
spf种蛋购自浙江立华公司，在扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室孵化。
[0078]
1、重组病毒vii-hnf的拯救
[0079]
转染时所用质粒(pndv/ai4-hnf、pci-np、pci-p和pci-l)均采用qiaprep spinminiprepkit抽提。将pci-np、pci-p和pci-l 3个辅助质粒与重组ndv基因组全长cdna克隆pndv/rai4-hnf共转染bsr-t7/5细胞，18-24h后加入终浓度为10％spf胚尿囊液，60h后将转染样品冻融3次后，收获并接种9～11日龄spf鸡胚，96h后收集鸡胚尿囊液，按oie标准测定血凝效价，获得易位重组疫苗株vii-hnf。
[0080]
在鸡胚上传代5次后，所测ha效价为10log2，与母本毒株ai4相比上升了1个滴度。
[0081]
2、rt-pcr验证获救病毒vii-hnf
[0082]
红细胞凝集试验(hemagglutination，ha)和红细胞凝集抑制实验(hemagglutination inhibition，hi)检测均为阳性的尿囊液，在spf鸡胚上传4代后，收集尿囊液抽提病毒的总rna，用6nt随机引物反转录成cdna后用于rt-pcr反应。
[0083]
用引物test-f和test-r扩增重组病毒cdna，长度约为800bp，回收目的片段进行测序鉴定，扩增片段的测序结果显示hn基因成功易位至f基因之前。
[0084]
引物序列是：
[0085]
test-f：5
′‑
tcttcgggacgatgcttgatgatga-3
′
(seq id no.11)
[0086]
test-r：5
′‑
aagaggagtgagcagagtagtcagtg-3
′
(seq id no.12)
[0087]
以上引物由南京擎科生物有限公司合成。
[0088]
步骤三：重组病毒mdt、icpi与eid
50
的测定
[0089]
鸡胚平均致死时间(mean death time，mdt)测定：用灭菌生理盐水将重组病毒vii-hnf分别作10倍(10-6
、10-7
......10-10
)梯度稀释，每个稀释度接种5枚9～11日龄spf鸡胚，每胚0.1ml，同时设置5枚接种生理盐水的鸡胚作为对照。37℃孵育，弃去24h内死亡的鸡胚，之后每隔12h观察一次直至120h，按oie标准方法计算病毒的mdt。结果：病毒5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有死亡，该毒株的mdt值大于120h。
[0090]
雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index，icpi)测定：取ha滴度大于4log2的新鲜病毒尿囊液经无菌检验后以不含抗生素灭菌的生理盐水重做10倍稀释，经脑内接种10只1日龄的spf鸡，每只脑内接种0.05ml，同时设置10只注射生理盐水的spf鸡作为对照。按oie标准方法对鸡进行打分，计算病毒的icpi。尿囊液经脑内接种1日龄spf鸡后没有发生死亡，icpi仅为0.19，表明获救病毒的毒力完全符合弱毒的标准。
[0091]
鸡胚半数感染量(50％egg infectious dose，eid
50
)测定：将新鲜病毒尿囊液用灭菌生理盐水稀释至10-7
、10-8
、10-9
、10-10 4个稀释度，各接种10日龄spf鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚随时取出，至120小时，取出所有活胚，逐枚收取鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶128(微量法)者判为感染，计算eid
50
。结果：每0.1ml病毒含量为10
9.63
eid
50
，表明获救病毒在鸡胚上具有较高的繁殖滴度。