一种用于检测坚果中霉菌的引物组合、试剂盒及坚果中产霉菌毒素真菌种类的检测方法与流程

1.本发明属于食品安全生物技术领域，具体涉及一种检测坚果中霉菌的引物组合、试剂盒及坚果中产霉菌毒素真菌种类的检测方法。


背景技术：

2.霉菌毒素是由丝状真菌产生的低分子量化合物，其中较为常见的有单端孢霉烯族毒素、伏马菌素、黄曲霉毒素和赭曲霉毒素等，它们可对人体健康造成不同程度的危害，同时对食品工业造成巨大的经济损失。这些有毒化合物主要是由曲霉属、青霉属和镰刀菌属产生。黄曲霉在腰果、开心果、栗子和杏仁等霉变污染中均有报道，是引起坚果霉变的主要污染物。此外还有研究报道证明青霉是导致核桃在贮藏过程中发生霉变的主要病原菌之一。对于霉菌毒素以及产霉菌毒素的真菌的检测是保证食品安全的关键。对于真菌的鉴定是昂贵且费时的。因此，开发快速简便的方法来检测和鉴定产毒素真菌的存在，将有利于对产品的预处理以及对特定的霉菌毒素分析做出重要的判断。
3.目前检测霉菌常用的方法为传统培养法和生化检测技术。传统培养法即国标法gb 4789.15
‑
2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》，传统培养法结果准确、但检测周期较长，且操作步骤繁琐，不适合快速高效检测的需求。生化检测技术即通过霉菌在生长和繁殖的过程中所产生的代谢产物与特定底物之间的特异性反应来进行种类和数量的检测。常用的检测方法有快速测试片法和atp生物发光技术检测法。快速测试片法操作简单，成本低廉，但检测结果准确性欠佳；atp生物发光法只对活的微生物进行检测，难以区分微生物种类，易造成检测的假阳性。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测坚果中霉菌的引物组合、试剂盒及坚果中产霉菌毒素真菌种类的检测方法，本发明分别针对黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉、鲜绿青霉、尖孢镰孢菌基因组中的保守区域设计了五组引物对，利用pcr反应，简便、快速、高效实现对于坚果中产霉菌毒素真菌的检测，并可明确区分出产霉菌毒素真菌的种类。
5.本发明采用的技术方案如下：
6.一种用于坚果霉变检测的引物组合，所述引物组合包括：
7.扩增黑曲霉基因组的β
‑
微管蛋白区的引物对；
8.扩增黄曲霉基因组的α
‑
淀粉酶区的引物对；
9.扩增集峰曲霉基因组的α
‑
淀粉酶区的引物对；
10.扩增青霉属基因组的β
‑
微管蛋白区的引物对；
11.扩增镰刀菌属基因组的rpb2区的引物对。
12.所述黑曲霉基因组、黄曲霉基因组、集峰曲霉基因组、青霉属基因组、镰刀菌属基因组的genbank登录号分别为eu982068.1、dq467916.1、dq467925.1、km973203.1、
kc691666.1。
13.所述扩增黑曲霉基因组的β
‑
微管蛋白区的引物对为：
14.上游引物p1：5
’‑
acgtatacaactgccattggac
‑3’
；
15.下游引物p1：5
’‑
cacctcgttgaagtagacgtt
‑3’
。
16.所述扩增黄曲霉基因组的α
‑
淀粉酶区的引物对为：
17.上游引物p2：5
’‑
attctacaacttggctgatcg
‑3’
；
18.下游引物p2：5
’‑
tagttcagtacgccgtcca
‑3’
。
19.所述扩增集峰曲霉基因组的α
‑
淀粉酶区的引物对为：
20.上游引物p3：5
’‑
ttgcccgatcttgacaccac
‑3’
；
21.下游引物p3：5
’‑
taactggttttcatccggctt
‑3’
。
22.所述扩增青霉属基因组的β
‑
微管蛋白区的引物对为：
23.上游引物p4：5
’‑
caaccaggtgagtacaacga
‑3’
；
24.下游引物p4：5
’‑
ggactgaccgaagacgaag
‑3’
。
25.所述扩增镰刀菌属基因组的rpb2区的引物对为：
26.上游引物p5：5
’‑
gtatggaagtcgtggaagagta
‑3’
；
27.下游引物p5：5
’‑
ttgcattcggtagaggtca
‑3’
。
28.本发明还提供了所述的用于检测坚果中霉菌的引物组合的应用，用于检测坚果中会否存在产毒素真菌、或用于检测坚果中的产毒素真菌的种类是否为黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉、青霉菌、镰刀菌中的任意一种或多种。
29.本发明还提供了一种用于坚果霉变检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的用于检测坚果中霉菌的引物组合。
30.本发明还提供了一种利用所述用于检测坚果中霉菌的引物组合检测坚果中产毒素真菌种类的方法，所述方法包括以下步骤：
31.(1)将坚果破碎后放入无菌水中震荡，将震荡液进行接种培养；
32.(2)提取培养出的菌丝的基因组dna；
33.(3)以所述引物组合中的各引物对分别为上、下游引物，基因组dna为模板，进行pcr扩增，获得扩增产物；
34.(4)根据扩增产物的特异条带的分子量大小，判断坚果是否感染了黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉、青霉菌或镰刀菌。
35.步骤(3)中，所述pcr扩增的反应体系为：5μl 10
×
含mg
2
的pcr缓冲液、4μl dntp、0.4μl taq dna聚合酶、1μl上游引物、1μl下游引物、5μl dna模板，加无菌超纯水至50μl；所述pcr扩增的反应条件为：94℃变性5min后进入循环，94℃1min、57℃45s、72℃45s，共30个循环。
36.与现有技术相比，本发明存在以下有益效果：
37.(1)本发明通过在ncbi的基因序列库中比对多种菌的基因序列，在保守位点处设计的特异性引物，能够对坚果中常见的产霉菌毒素的真菌进行特异性扩增；
38.(2)通过对坚果中常见的曲霉属、青霉属和镰刀菌属进行引物设计，能够对坚果中常见霉菌进行全面检测；
39.(3)对相应组织进行dna提取、pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳后即可判定结果，操作简
便快速，一般整个检测过程可在数小时内完成，检测简便快速、高效。
附图说明
40.图1为当dna模板为尖孢镰孢菌基因组，上、下游引物为p5时的pcr扩增结果图；图中，泳道1为阴性对照，泳道2
‑
4为尖孢镰孢菌，m为10kbp ladder marker；
41.图2为当dna模板分别为黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉、鲜绿青霉基因组，上、下游引物为p5时的pcr扩增结果图；图中：泳道1
‑
2为黑曲霉、泳道3
‑
4为黄曲霉、泳道5
‑
6为集峰曲霉、泳道7
‑
8为鲜绿青霉、m为10kbp ladder marker；
42.图3为当dna模板分别为黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉基因组，上、下游引物为p1时的pcr扩增结果图；图中，泳道1为阴性对照、泳道2
‑
3为黑曲霉、泳道4
‑
6为黄曲霉、泳道7
‑
9为集峰曲霉、m为10kbp ladder marker；
43.图4为当dna模板为鲜绿青霉基因组时的pcr扩增结果图；图中，泳道1
‑
9的dna模板均为鲜绿青霉基因组，但是各泳道的上、下游引物分别为泳道1
‑
3为黑曲霉的引物p1、泳道4
‑
6为黄曲霉的引物p2、泳道7
‑
9为集峰曲霉引物p3、m为10kbp ladder marker；
44.图5为当dna模板尖孢镰孢菌基因组时的pcr扩增结果图；图中，泳道1
‑
6的dna模板均为尖孢镰孢菌，但是各泳道的上、下游引物分别为泳道1
‑
2为黑曲霉的引物p1、泳道3
‑
4为集峰曲霉基因组的引物p3、泳道5
‑
6为鲜绿青霉的引物p4、m为10kbp ladder marker；
45.图6是当dna模板分别为黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉、鲜绿青霉、尖孢镰孢菌基因组，上、下游引物为p2时的pcr扩增结果图；图中，泳道1
‑
2为黑曲霉、泳道3
‑
4为黄曲霉、泳道5
‑
6为集峰曲霉、泳道7
‑
8为鲜绿青霉、泳道9
‑
10为尖孢镰孢菌、m为10kbp ladder marker；
46.图7为当dna模板为集峰曲霉基因组，上、下游引物为p3时的pcr扩增结果图；图中，泳道1为阴性对照、泳道2
‑
3为集峰曲霉、m为10kbp ladder marker；
47.图8为当dna模板分别为黑曲霉、黄曲霉基因组，上、下游引物为p3时的pcr扩增结果图；图中，泳道1为黑曲霉、泳道2为黄曲霉、泳道3为阴性对照、m为10kbp ladder marker；
48.图9为当dna模板为鲜绿青霉基因组，上、下游引物为p4时pcr扩增结果图；图中，泳道1为阴性对照、泳道2
‑
4为鲜绿青霉、m为10kbp ladder marker；
49.图10当dna模板分别为黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉基因组，上、下游引物为p4时pcr扩增结果图；图中，泳道1为黑曲霉、泳道2为黄曲霉、泳道3为集峰曲霉、m为10kbp ladder marker；
50.图11是实施例3中样品的检测结果图；图中，泳道1为阴性对照、泳道2为黑曲霉引物p1、泳道3为黄曲霉引物p2、泳道4为集峰曲霉引物p3、泳道5为青霉属引物p4、泳道6为镰刀菌属引物p5。
具体实施方式
51.结合附图和具体实施方式，对本发明进行详细阐述。
52.下述各实施例中的引物均是交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；
53.实施例中的10
×
含mg
2
的pcr缓冲液购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
54.dntp购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
55.taq dna聚合酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司；
column，于6000xg离心1min，并弃去接液管中液体；向spin column中加入500μl的g binding buffer，于10000xg离心30s，并弃去接液管中液体；spin column中加入600μl的wash buffer，于10000xg离心30s，并弃去接液管中液体并重复此步骤一次；再次将spin column于10000xg离心1min，并将spin column转移至一个新的1.5ml离心管；项spin column中加入100μl至200μl elution buffer，并于室温温育1min；于12000xg离心1min，并弃去spin column，1.5ml离心管中含有dna，于
‑
20℃保存。
64.将上述步骤中的尖孢镰孢菌分别替换为黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉、鲜绿青霉，同理得到黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉和鲜绿青霉的dna，于
‑
20℃保存。以提取的全基因组为模板，nanodrop测定提取dna的浓度及纯度，所得黑曲霉基因组浓度为7.2ng/μl，a260/a280为2.08；黄曲霉浓度为7.2ng/μl，a260/a280为2.03；集峰曲霉基因组浓度为6.9ng/μl，a260/a280为1.91；鲜绿青霉基因组浓度为3.3ng/μl，a260/a280为1.70；尖孢镰孢菌基因组浓度为14ng/μl，a260/a280为1.84。
65.(3)引物的验证：
66.pcr反应体系为：5μl 10
×
含mg
2
的pcr缓冲液，4μl dntp，0.4μl taq dna聚合酶，上、下游引物各1μl，dna模板5μl，加无菌超纯水至50μl。
67.扩增程序为：94℃变性5min后进入循环，94℃1min、57℃45s、72℃45s，共30个循环，72℃10min。
68.将2.5μl pcr产物用1％琼脂糖电泳分离，经gelred染色后于紫外灯下观察特异条带的长度，黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉、鲜绿青霉、尖孢镰孢菌的特异条带长度分别为300bp、197bp、360bp、202bp、467bp。
69.在实际检测时，以待测物的基因组dna为模板，分别使用上述引物对进行pcr扩增，如果能特异性地扩增出相应长度的扩增产物时，即可判断待测物中存在相应的真菌；否则不存在相应的真菌。例如如果使用上、下游引物p1扩增出的产物的条带长度为300bp，则说明待测物中存在黑曲霉；如果使用上、下游引物p2扩增出的产物的条带长度为197bp，则说明待测物中还存在黄曲霉。
70.实施例2各引物对的特异性测试
71.(1)尖孢镰孢菌基因组dna的提取
72.按照实施例1步骤(2)中所述方法分别提取黑曲霉、黄曲霉、集峰曲霉、鲜绿青霉以及尖孢镰孢基因组。所得黑曲霉基因组浓度为7.2ng/μl，a260/a280为2.08；黄曲霉浓度为7.2ng/μl，a260/a280为2.03；集峰曲霉基因组浓度为6.9ng/μl，a260/a280为1.91；鲜绿青霉基因组浓度为3.3ng/μl，a260/a280为1.70；尖孢镰孢菌基因组浓度为14ng/μl，a260/a280为1.84。
73.(2)pcr体系的建立
74.pcr反应体系为：5μl 10
×
含mg
2
的pcr缓冲液，4μl dntp，0.4μl taq dna聚合酶，上、下游引物各1μl，dna模板5μl，加无菌超纯水至50μl。
75.扩增程序为：94℃变性5min后进入循环，94℃1min、57℃45s、72℃45s，共30个循环，72℃10min。
76.当dna模板为尖孢镰孢菌基因组，上、下游引物为上游引物p5、下游引物p5时，扩增产物出现一条分子量为467bp的特异条带，扩增结果如图1所示，说明扩增出的目的产物为
尖孢镰孢菌的目的基因。如果将尖孢镰孢菌基因组分别替换为黑曲霉基因组、黄曲霉基因组、集峰曲霉基因组、鲜绿青霉基因组，上、下游引物还是为上、下游引物p5，均未能扩增出任何特异条带的产物，扩增结果如图2所示，这说明该引物具有很强的特异性，可被用于生产实践中快速可靠的检测和坚果中是否感染了尖孢镰孢菌。
77.当dna模板为黑曲霉基因组，上、下游引物为上游引物p1、下游引物p1时，扩增产物出现一条分子量为300bp的特异条带，说明扩增出的目的产物为黑曲霉的目的基因。如果将黑曲霉基因组分别替换为黄曲霉基因组、集峰曲霉基因组、鲜绿青霉基因组、尖孢镰孢菌基因组，上、下游引物还是为上、下游引物p1，均未能扩增出任何特异条带的产物，，扩增结果如图3
‑
5所示。这说明该引物具有很强的特异性，可被用于生产实践中快速可靠的检测和坚果中是否感染了黑曲霉。
78.当dna模板为黄曲霉基因组，上、下游引物为上游引物p2、下游引物p2时，扩增产物出现一条分子量为197bp的特异条带，说明扩增出的目的产物为黄曲霉的目的基因。如果将黄曲霉基因组分别替换为黑曲霉基因组、集峰曲霉基因组、鲜绿青霉基因组、尖孢镰孢菌基因组，上、下游引物还是为上、下游引物p2，均未能扩增出任何特异条带的产物，扩增结果如图6所示。这说明该引物具有很强的特异性，可被用于生产实践中快速可靠的检测和坚果中是否感染了黄曲霉。
79.当dna模板为集峰曲霉基因组，上、下游引物为上游引物p3、下游引物p3时，扩增产物出现一条分子量为360bp的特异条带，扩增结果如图7所示，说明扩增出的目的产物为集峰曲霉的目的基因。如果将集峰曲霉基因组分别替换为黑曲霉基因组、黄曲霉基因组、鲜绿青霉基因组、尖孢镰孢菌基因组，上、下游引物还是为上、下游引物p3，均未能扩增出任何特异条带的产物，扩增结果如图4
‑
5、图8所示，这说明该引物具有很强的特异性，可被用于生产实践中快速可靠的检测和坚果中是否感染了集峰曲霉。
80.当dna模板为鲜绿青霉基因组，上、下游引物为上游引物p4、下游引物p4时，扩增产物出现一条分子量为202bp的特异条带，扩增结果如图9所示，说明扩增出的目的产物为鲜绿青霉的目的基因。如果将鲜绿青霉基因组分别替换为黑曲霉基因组、黄曲霉基因组、集峰曲霉基因组、尖孢镰孢菌基因组，上、下游引物还是为上、下游引物p4，均未能扩增出任何特异条带的产物，扩增结果如图5、图10所示，这说明该引物具有很强的特异性，可被用于生产实践中快速可靠的检测和坚果中是否感染了鲜绿青霉。
81.实施例3自然污染的样本的检测
82.(1)样品处理：
83.取样自浙江省杭州市临安市龙岗工业园，取25g样品坚果，破碎后加入225ml灭菌水中，振荡10min，取200μl振荡后的溶液加入到100ml马铃薯液体培养基中，28℃培养40h。
84.(2)样品dna提取
85.取步骤(1)培养基中的菌丝，按照实施例1步骤(2)的方法取样品基因组dna。
86.(3)坚果样品pcr体系建立
87.pcr反应体系：5μl 10
×
含mg
2
的pcr缓冲液，4μl dntp，0.4μl taq dna聚合酶，上游引物和下游引物各1μl，步骤(2)提取的样品dna模板5μl，33.6μl无菌超纯水。
88.扩增程序为：94℃变性5min后进入循环，94℃1min、57℃45s、72℃45s，共30个循环。
89.分别使用实施例1中的五组引物对进行pcr扩增，将2.5μl pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳，经gelred染色后于紫外灯下根据条带大小判定结果。
90.检测结果如图11所示，扩增产物出现一条分子量为197bp的特异条带，即可判断坚果感染了黄曲霉。
91.上述参照实施例对一种用于坚果霉变检测的引物组合、试剂盒及坚果中产霉菌毒素真菌种类的检测方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。