一种C5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用与流程

技术特征：
1.一种c5-酮基米尔贝霉素生产菌株，其特征在于，所述c5-酮基米尔贝霉素生产菌株是以含有milf基因的米尔贝霉素a3/a4产生菌株为出发菌株，然后向出发菌株中转化携带crrna的crispri质粒，从而干扰milf基因表达所得。2.如权利要求1所述的c5-酮基米尔贝霉素生产菌株，其特征在于，所述出发菌株为吸水链霉菌或冰城链霉菌。3.如权利要求1所述的c5-酮基米尔贝霉素生产菌株，其特征在于，所述crrna的序列如seq id no.1所示。4.如权利要求1所述的c5-酮基米尔贝霉素生产菌株，其特征在于，所述milf基因的序列如seq id no.2所示。5.权利要求1所述的c5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法，其特征在于，包括步骤如下：(1)以milf基因作为靶基因，在开放阅读框内搜索ddcpf1酶原间隔序列临近基序识别靶基因序列的tttv，选取原间隔序列临近基序之后的24个核苷酸为原间隔序列，即得到干扰milf基因表达的crrna，具体核苷酸序列如seq id no.2所示；然后将crrna插入至质粒载体pset-ddcpf1的4656位点处，得到重组质粒primilf；(2)将重组质粒primilf转化大肠杆菌感受态细胞，经抗性筛选后得到转化子；然后将转化子接种于lb液体培养基中，过夜培养，再转接于lb液体培养基中，培养至od600值为0.4～0.6，离心后去除上清液，用lb液体培养基悬浮沉淀，得到转化子悬浮液；(3)收集出发菌株的孢子至无菌tes溶液中，得到浓度为1
×
108～1.5
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108个/ml的孢子悬浮液；将转化子悬浮液和孢子悬浮液混合后离心，去除75～85％上清液，通过剩余上清液重悬孢子并涂布于ms固体培养基上，在28～30℃下倒置培养16～19h后，在ms固体培养基上涂布含有萘啶酮酸和阿泊拉霉素的水溶液，继续置于28～30℃倒置培养6～8d，得到接合子单菌落；(4)挑取接合子单菌落接种于ms固体培养基上，在28～30℃下培养6～8d，挑选阳性重组菌，再转接于斜面固体培养基上，在28～30℃下继续培养6～8d，得到c5-酮基米尔贝霉素生产菌株。6.如权利要求5所述构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述质粒载体pset-ddcpf1为含有ddcpf1酶编码基因的质粒载体pset152。7.如权利要求5所述构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述斜面固体培养基组分如下：蔗糖5.0g/l，脱脂奶粉1.0g/l，k2po
4 0.5g/l，麦芽提取物4.0g/l，ph 7.3。8.权利要求1所述c5-酮基米尔贝霉素生产菌株在制备c5-酮基米尔贝霉素中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，包括步骤如下：将c5-酮基米尔贝霉素生产菌株接种于的种子培养基中，在28～30℃，200～230rpm条件下培养36h，收集菌丝，然后将种子液按照6～10％的体积比接种至发酵培养基中，28～30℃，200～230rpm条件下培养8～10天，得发酵液，从发酵液中分离得到c5酮基米尔贝霉素。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述种子培养基组分如下：蔗糖8.0g/l，酵母提取物5.0g/l，蛋白胨3.5g/l，脱脂奶粉2.0g/l，k2po
4 0.5g/l，ph7.3；所述发酵培养基组分如下：蔗糖90.0g/l，黄豆饼粉15.0g/l，脱脂奶粉8.0g/l，棉籽蛋白粉5.0g/l，caco
3 3.0g/l，k2po
4 0.5g/l，feso
4 0.5g/l，ph7.5。

技术总结
本发明涉及一种C5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用。所述C5-酮基米尔贝霉素生产菌株是以含有milF基因的米尔贝霉素A3/A4产生菌株为出发菌株，然后向出发菌株中插入crRNA干扰milF基因表达所得。所述crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示，所述milF基因的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了C5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法与应用。本发明提供的C5-酮基米尔贝霉素生产菌株构建方法简单，不需要利用同源重组进行基因敲除的单交换筛选、双交换筛选等复杂流程，仅仅通过对携带所述crRNA的pRimilF接合转移就可以实现milF基因沉默，缩短了C5-酮基米尔贝霉素的生产工艺周期，减少了昂贵试剂的使用，大幅降低了生产成本。本。


技术研发人员：赵霞 李瑞彬 苏振业 王妮 黄科学
受保护的技术使用者：齐鲁制药（内蒙古）有限公司
技术研发日：2022.03.03
技术公布日：2022/6/3