一种用于细胞三维培养的PEG-RGD多肽水凝胶材料及其制备方法与应用

一种用于细胞三维培养的peg-rgd多肽水凝胶材料及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种用于细胞三维培养的peg-rgd多肽水凝胶材料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.近年来，三维细胞培养在生物医学领域受到越来越多的关注，它可以模拟细胞在体内的生长环境，比二维细胞培养具有更明显的优势。水凝胶因其特有的粘弹性、高含水性和生物相容性等特性而在药物缓释、生物传感器和组织工程等生物医学领域具有广泛的应用前景。水凝胶的三维特性与天然的细胞外基质相似，因此可以作为三维细胞培养的支架材料。由壳聚糖、胶原蛋白、透明质酸、海藻酸等天然材料制备的水凝胶被广泛应用于水凝胶支架，因为他们可以提供类似于细胞外基质的三维环境，有利于细胞的附着和生长。但是这些天然水凝胶在体内易降解，机械强度较差，作为3d细胞支架无法提供足够的支撑。合成的水凝胶材料如聚乙二醇(peg)是一种常用的高分子聚合物，具有水溶性好、生物相容性好、无毒和免疫原性低等特点，经过美国fda认可，是一类潜在的组织工程支架材料。
3.作为一种多功能的合成聚合物，peg可以被许多反应基团功能化，以实现细胞相容的包封。尽管如此，peg是一种亲水性很强的聚合物，不利于细胞粘附，也不能提供细胞粘附和扩散的结合序列以支持随后的分化。
4.解决这一问题的一种方法是在水凝胶中加入粘附肽，以模拟细胞粘附的天然ecm。rgd三肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)是包括α
ν
β3和α5β1在内的细胞表面整合素的识别基序，介导多种细胞-细胞和细胞-底物之间的相互作用，参与稳态调节、吞噬作用、细胞迁移和细胞信号转导等诸多生物学过程。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种用于细胞三维培养的peg-rgd多肽水凝胶材料及其制备方法与应用，引入粘附肽rgd(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)到聚乙二醇水凝胶中，从而增强细胞的粘附作用，进而对细胞进行三维包封，达到细胞增殖的目的。
6.本发明采用的技术解决方案是：一种用于细胞三维培养的peg-rgd多肽水凝胶材料,所述的水凝胶材料为亲水性聚合物peg和grgdg通过铜催化的叠氮化物-炔环加成反应制备的peg-rgd多肽水凝胶材料。
7.所述的亲水性聚合物peg为peg衍生物4-arm-peg-n3。
8.所述的grgdg为炔丙基甘氨酸修饰的grgdg多肽。
9.一种peg-rgd多肽水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)通过固相合成法制备炔丙基甘氨酸修饰的grgdg多肽序列：取二氯树脂于固相合成管中，加入二氯甲烷浸泡，依次加入炔丙基甘氨酸(g)、天冬氨酸(d)、甘氨酸(g)、精氨
酸(r)、炔丙基甘氨酸(g)，延长肽链，直至获得最终产物grgdg多肽，将产物进行分离纯化，冻干备用；
11.(2)制备peg-rgd多肽水凝胶薄片：将4-arm-peg-n3和grgrg多肽通过click反应在铜离子和抗坏血酸的催化下，反应生成peg-rgd多肽水凝胶，两者混合后迅速转移至聚四氟乙烯模具中，制备peg-rgd多肽水凝胶薄片；
12.(3)将制备的peg-rgd多肽水凝胶薄片浸泡在edta溶液中，除去铜离子，进行真空冷冻干燥，备用。
13.所述的步骤(2)中4-arm-peg-n3和grgdg的物质的量配比为1:2-1:3。
14.一种所述的peg-rgd多肽水凝胶材料在制备三维细胞培养的支架材料上的应用。
15.本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于细胞三维培养的peg-rgd多肽水凝胶材料及其制备方法与应用，用亲水性聚合物peg和生物活性多肽grgdg进行化学交联，制备了无色、透明的高分子水凝胶，并用于人角膜上皮细胞(hcec)的封装和三维细胞培养。通过实验发现，增加rgd与peg的交联比例，更加有利于hcec细胞的粘附与增殖。由亲水性聚合物peg和生物活性多肽rgd交联形成的peg-rgd水凝胶制作过程简单、生物相容性良好、可以作为人角膜上皮细胞培养的三维支架。
附图说明
16.图1为4-arm-peg-n3和grgdg多肽通过click反应生成的peg水凝胶的结构式；
17.图2为制备的peg-rgd多肽水凝胶的图片；
18.图3为通过固相合成法合成的grgdg多肽的核磁图谱；
19.图4为grgdg多肽的质谱图谱；
20.图5为4-arm-peg-n3和s1、s2、s3水凝胶的红外光谱图(s1、s2、s3水凝胶反应配比分别为1:2,1:2.5和1:3，)；
21.图6为s1、s2、s3水凝胶的流变学特性图；
22.图7为4-arm-peg-n3和grgdg多肽反应配比为1:2的水凝胶的扫描电镜图；
23.图8为4-arm-peg-n3和grgdg多肽反应配比为1:2.5的水凝胶的扫描电镜图；
24.图9为4-arm-peg-n3和grgdg多肽反应配比为1:3的水凝胶的扫描电镜图；
25.图10为包载hcec细胞的s1水凝胶培养72小时后的细胞死活染色图；
26.图11为包载hcec细胞的s2水凝胶培养72小时后的细胞死活染色图；
27.图12为包载hcec细胞的s3水凝胶培养72小时后的细胞死活染色图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1：
30.(1)控制4-arm-peg-n3和grgdg的反应配比为1:2，称取25mg(5μmol)peg，和5.36mg grgdg(10μmol)溶于86.94μl去离子水中，超声溶解。
31.(2)在步骤(1)所得反应物中分别加入事先配制好的催化剂溶液cuso4·
5h2o(0.2mg/μl)和抗坏血酸(0.2mg/μl)12.5μl和22μl，反应物的质量体积分数控制在25％。涡旋混匀后，将反应混合液转移至聚四氟乙烯模具中，并放置于37℃孵育箱中反应30分钟左右，直至成胶完成。
32.(3)待水凝胶稳定后，将步骤(2)所得的水凝胶薄片放到edta的饱和水溶液中，除去水凝胶中的铜离子，浸泡48小时，期间每隔2-3小时更换去离子水，浸泡后用去离子水洗涤干净。
33.(4)浸泡之后的水凝胶薄片呈透明无色状，将其冷冻干燥，备用。
34.实施例2：
35.(1)控制4-arm-peg-n3和grgdg的反应配比为1:2.5，称取25mg(5μmol)peg和6.7mggrgdg(12.5μmol)溶于92.3μl去离子水中，超声溶解。
36.(2)在步骤(1)所得反应物中分别加入事先配制好的催化剂溶液cuso4·
5h2o(0.2mg/μl)和抗坏血酸(0.2mg/μl)12.5μl和22μl，反应物的质量体积分数控制在25％。涡旋混匀后，将反应混合液转移至聚四氟乙烯模具中，并放置于37℃孵育箱中反应30分钟左右，直至成胶完成。
37.(3)待水凝胶稳定后，将步骤(2)所得的水凝胶薄片放到edta的饱和水溶液中，除去水凝胶中的铜离子，浸泡48小时，期间每隔2-3小时更换去离子水，浸泡后用去离子水洗涤干净。
38.(4)浸泡之后的水凝胶薄片呈透明无色状，将其冷冻干燥，备用。
39.实施例3：
40.(1)控制4-arm-peg-n3和grgdg的反应配比为1:3，称取25mg(5μmol)peg和8.04mggrgdg(15μmol)溶于97.66μl去离子水中，超声溶解。
41.(2)在步骤(1)所得反应物中分别加入事先配制好的催化剂溶液cuso4·
5h2o(0.2mg/μl)和抗坏血酸(0.2mg/μl)12.5μl和22μl，反应物的质量体积分数控制在25％。涡旋混匀后，将反应混合液转移至聚四氟乙烯模具中，并放置于37℃孵育箱中反应30分钟左右，直至成胶完成。
42.(3)待水凝胶稳定后，将步骤(2)所得的水凝胶薄片放到edta的饱和水溶液中，除去水凝胶中的铜离子，浸泡48小时，期间每隔2-3小时更换去离子水，浸泡后用去离子水洗涤干净。
43.(4)浸泡之后的水凝胶薄片呈透明无色状，将其冷冻干燥，备用。
44.本发明制备方法的优点：现有的运用光聚合反应来制备peg水凝胶的方法，由于自由基反应的存在，光聚合常常会导致材料的结构难以控制。通过铜催化的点击反应来制备水凝胶，反应条件简单温和、反应快速高效、高选择性，是一种能很好的实现化学可控的制备方法。
45.对比例1：
46.(1)控制4-arm-peg-n3和grgdg的反应配比为1:1.5，称取5μmol peg和grgdg7.5μmol溶于去离子水中，超声溶解。
47.(2)在步骤(1)所得反应物中分别加入事先配制好的催化剂溶液cuso4·
5h2o(0.2mg/μl)和抗坏血酸(0.2mg/μl)12.5μl和22μl，反应物的质量体积分数控制在25％。涡
旋混匀后，将反应混合液转移至聚四氟乙烯模具中，并放置于37℃孵育箱中反应30分钟左右，直至成胶完成。
48.结果：当4-arm-peg-n3和grgdg的反应配比为1:1.5时，由于炔丙基的数量少于叠氮基，二者未完全交联，形成的网络不够致密，水凝胶不够稳定，放置久了容易崩解。
49.对比例2：
50.(1)控制4-arm-peg-n3和grgdg的反应配比为1:4，称取5μmol peg和grgdg20μmol溶于去离子水中，超声溶解。
51.(2)在步骤(1)所得反应物中分别加入事先配制好的催化剂溶液cuso4·
5h2o(0.2mg/μl)和抗坏血酸(0.2mg/μl)12.5μl和22μl，反应物的质量体积分数控制在25％。涡旋混匀后，将反应混合液转移至聚四氟乙烯模具中，并放置于37℃孵育箱中反应30分钟左右，直至成胶完成。
52.结果：当4-arm-peg-n3和grgdg的反应配比为1:4时，4-arm-peg-n3和grgdg的反应配比为1：4时，形成的网络结构更加致密，水凝胶强度太大，用于细胞的培养时不利于细胞的扩散和增殖。
53.各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
54.以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。