一种提高刺梨蛋白抑菌活性和热稳定性的方法和应用与流程

1.本发明涉及天然产物领域，尤其涉及一种提高刺梨蛋白抑菌活性和热稳定性的方法和应用。


背景技术：

2.当前，细菌的耐药性已经成为当今无法忽视的一个重要课题。曾经一度使用的化学合成抗生素已无法满足目前医疗治疗目的，因此天然高效的抑菌成分已经成为研究开发的热点之一。
3.刺梨（roxburgh，rosa roxburghii tratt），又称缫丝花、刺蘑、山刺梨等，是中国特有的一种水果，果实呈扁球形或圆锥形，稀纺锤形，直径2~4厘米。表面黄褐色，密被针刺，有的并具褐色斑点。
4.刺梨中含有营养丰富，其中含有天然的蛋白成分具有一定的抑菌作用，这些刺梨天然蛋白表现出了替代抗生素作为新一代植物抑菌肽的重要前景，但是这种抑菌作用效果仍有待进一步加强。此外，由于植物来源蛋白质热稳定性较差，导致其无法达到抑菌药物的标准，严重限制了刺梨蛋白被开发作为植物抗菌材料的前景。


技术实现要素：

5.本发明是为了现有技术中的刺梨蛋白的抑菌活性较弱，同时其热稳定性较差的缺陷，提供了一种提高刺梨蛋白抑菌活性和热稳定性的方法和应用。
6.因此，本发明第一个目的在于提供了一种糖基化刺梨蛋白，包括刺梨蛋白，所述刺梨蛋白上糖基化反应连接有糖类化合物。
7.针对现有技术中的刺梨粗提物（刺梨汁）抑菌效果较差的缺陷，目前一些研究人员发现，通过将刺梨蛋白进行单独提取纯化能够有效提升其抑菌杀菌效果。但是，由于刺梨蛋白其热稳定性较差，导致其无法达到抑菌药物的标准。对此，本发明研究人员偶然发现，通过将刺梨中的刺梨蛋白进行糖基化修饰，从而将糖类化合物引入到至刺梨蛋白上后，能够有效提升刺梨蛋白的杀菌抑菌效果，同时随着糖基化改性的继续，使得其热稳定性能能够有效提升。相比未糖基化反应蛋白，糖基化刺梨蛋白的抑菌活性能够升高10~40%，最高抑菌活性超过85%，并且糖基化刺梨蛋白在75℃温度处理下仍保持有60%以上的抑菌活性。
8.作为优选，所述糖类化合物包括单糖、多糖或者单糖与多糖的复合物中的任意一种。
9.本发明对用于引入到刺梨蛋白上的糖类化合物没有明确的限制，经过研发人员发现，无论是单糖、多糖或者由单糖与多糖的复合物均可用以提升刺梨蛋白的热稳定性以及抑菌性能。
10.作为优选，所述糖类化合物包括葡萄糖、果糖、香菇多糖、海藻多糖、葡聚糖、番石榴多糖中的任意一种或多种的复合物。
11.本发明的第二个发明目的在于提供了一种提高刺梨蛋白抑菌活性和热稳定性的
方法，其包括以下步骤：（s.1）向刺梨汁中加入碱溶液，沉淀刺梨汁中的刺梨蛋白，并对刺梨蛋白进行透析处理；（s.2）对刺梨蛋白进行分级沉降，筛选抑菌活性最强的刺梨蛋白组分；（s.3）步骤（s.2）中的蛋白组分中加入糖类化合物，通过美拉德反应对刺梨蛋白进行糖基化修饰，得到上所述糖基化刺梨蛋白。
12.本发明发明者首先通过对刺梨进行榨汁处理后对刺梨汁中的刺梨蛋白进行提取，然后通过将刺梨蛋白进行分级沉降，从而能够得到不同分子量以及抑菌活性的刺梨蛋白，通过对其进行筛选后得到抑菌活性最高的刺梨蛋白。随后发明者通过在温和的美拉德反应下，利用糖基化反应对刺梨蛋白进行可控修饰，提高刺梨蛋白的热稳定性，以及抑菌能力。这一方法很好地克服了刺梨蛋白作为抑菌药物抑菌能力不强，并且热稳定性较差的缺点。使得刺梨蛋白具有广阔的应用前景和经济价值。
13.结果显示，通过筛选获取的刺梨抑菌蛋白在提取纯化后，其抑菌活性较相同浓度下的刺梨粗提取液显著提高，并且具有一定的热稳定性。在相同温度下，刺梨抑菌蛋白较刺梨粗提取液具有更高的抑菌活性。同时刺梨抑菌蛋白的抑菌活性较刺梨粗提取液其随着温度的升高，抑菌活性降低较为缓慢。同时，在通过美拉德反应的修饰后的修饰刺梨蛋白又较刺梨蛋白有更加出色的抑菌能力与热稳定性，总体表现也有一定幅度的提升。综上，以上技术有效提高了刺梨天然蛋白的抑菌活性与热稳定性，较好的抑菌活性与热稳定大大提高了刺梨蛋白作为植物抗菌肽替代传统抗生素的可能与前景。
14.作为优选，所述步骤（s.1）中加入碱溶液调节溶液ph 值为7.5~8.5。
15.进一步优选，在加入碱溶液后，还需要在室温下低速搅拌 0.5~3 h，随后通过3000~5000 r/min的速度离心30 min，从而得到刺梨蛋白。
16.进一步优选，在透析处理过程中可将刺梨蛋白加入到加原溶解液10%体积蒸馏水进行透析，透析时间24h，期间更换透析液多次。
17.作为优选，所述步骤（s.2）中使用浓度为10~80%的硫酸铵溶液对刺梨蛋白进行分级沉降。
18.作为优选，所述步骤（s.2）中分级沉降过程如下：用 1 mol /l naoh 溶液调 ph 至 8.0，室温下低速搅拌 2 h，4800 r/min 离心 20 min，残渣重复提取。
19.合并上清液用 1 mol /l hcl 调 ph 至 4.5，静置 30 min 后再次离心分离，弃上清液，收集沉淀水洗两次，并将沉淀加水完全溶解。
20.用1 mol /l naoh调ph至7.0，边搅拌边加入硫酸铵粉末，硫酸铵分级沉降，盐浓度10~80%完全溶解后放置4℃冰箱 4 h，然后离心。
21.分离得到的八种蛋白组分加原溶解液10%体积蒸馏水溶解并透析24 h，冷冻干燥，待用。
22.通过以上步骤，可以获取不同浓度的硫酸铵溶液盐析的刺梨天然蛋白。随后我们取相同体积的不同浓度的刺梨蛋白盐溶液进行抑菌活性实验，比较不同浓度的刺梨蛋白盐溶液的抑菌活性。
23.作为优选，所述步骤（s.3）中糖类化合物的添加量为刺梨蛋白质量的1~10%。
24.作为优选，所述步骤（s.3）中糖类化合物与刺梨蛋白反应过程中的反应温度为40~60℃，反应时间为0.5~48h，反应过程中控制湿度为60~85%。
25.本发明在糖类化合物与刺梨蛋白实现美拉德反应的过程中的反应条件温和，使得其能够在不破坏刺梨蛋白活性的条件下实现与糖类化合物的连接，从而有效提升糖基化刺梨蛋白的活性。
26.本发明的第三个目的在于提供了糖基化刺梨蛋白在食品、保健品或者药品中的应用。
27.本发明的第四个目的在于提供了所述糖基化刺梨蛋白在植物抗菌材料应用中的应用。
28.因此，本发明具有以下有益效果：（1）本发明通过在刺梨蛋白上糖基化反应连接糖类化合物，能够有效提升刺梨蛋白的抑菌表现，同时还能够使得其热稳定性能有效提升；（2）本发明中的提高刺梨蛋白抑菌活性和热稳定性的方法反应简单有效且条件温和；（3）本发明提供了一种糖基化刺梨蛋白替代传统抗生素的可能与前景，因而具有广阔的应用前景和经济价值。
附图说明
29.图1 为不同盐浓度刺梨蛋白的抑菌活性结果图。
30.图2 为sds-page蛋白电泳验证结果图。
31.图3 为不同刺梨蛋白糖基化修饰物的抑菌活性。
32.图4 为刺梨蛋白和糖基化刺梨蛋白热稳定性结果图。
具体实施方式
33.下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
34.【通过硫酸铵将刺梨天然蛋白成分沉淀分离】实施例1~8（1）将刺梨洗净后榨汁，多重过滤残渣得到清澈的刺梨提取液。
35.（2）用 1 mol /l naoh 溶液调刺梨提取液 ph 至 8.0，室温下低速搅拌 2 h，4800 r/min 离心 20 min，残渣重复提取。
36.（3）合并上清液用 1 mol /l hcl 调 ph 至 4.5，静置 30 min 后再次离心分离，弃上清液，收集沉淀水洗两次，并将沉淀加水完全溶解。
37.（4）用1 mol /l naoh调ph至7.0，边搅拌边加入硫酸铵粉末，硫酸铵分级沉降，盐浓度10~80%（即实施例1~8硫酸铵的浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）完全溶解后放置4℃冰箱 4 h，然后离心。
38.（5）分离得到的八种蛋白组分加原溶解液10%体积蒸馏水溶解并透析24 h，冷冻干燥，待用。
39.通过以上步骤，可以获取8种通过不同浓度的硫酸铵溶液盐析的刺梨天然蛋白。随后我们取相同体积的不同浓度的刺梨蛋白盐溶液进行抑菌活性实验，比较不同浓度的刺梨蛋白盐溶液的抑菌活性。
40.【刺梨蛋白的抑菌活性的测定】抑菌活性的测定过程如下：发明者以大肠埃希菌、肠沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株为研究对象。每株细菌在37℃营养肉汤中培养16h，然后将初始od
450
稀释至0.5左右。将20微升刺梨蛋白、各种修饰后的刺梨蛋白 [500 mg/ml放入ph7.4的磷酸盐缓冲盐水中]分别与100ml的菌悬液混合。以磷酸盐缓冲盐水代替样品作为对照。37℃孵育30min后，测得最终od值。
[0041]
结果如图1所示，通过硫酸铵沉淀分离制成的刺梨蛋白溶液的抑菌活性均大幅度高于未经处理的刺梨粗提取液，同时加入40%浓度的硫酸铵制成的40%-刺梨蛋白较其他浓度的刺梨蛋白盐溶液表现出最出色的抑菌活性，10%-刺梨蛋白溶液在各浓度的刺梨蛋白盐溶液中的抑菌活性相对最差。这说明可以通过硫酸铵蛋白沉淀技术再加上抑菌活性筛选试验，获取抑菌活性更好的刺梨蛋白盐溶液，证明了技术的有效性。
[0042]
【sds-page蛋白电泳验证刺梨蛋白盐分子量】（1）先配制分离胶，待分离胶凝固后，这个过程大约需要30 min。再配制浓缩胶，两层胶的体积比为3.5﹕2。
[0043]
（2）将硫酸铵40%浓度沉降得到的刺梨蛋白盐溶液在12000 rpm离心10 min后，过0.22 μm水系滤膜除菌，取上清18 μl放入ep管中，然后加入6 μl 4
×
loading dye混合均匀，沸水浴5 min，12000 rpm离心1 min。
[0044]
（3）将制备好的样品等体积加入点样孔。
[0045]
（4）首先调电压为50 v，待条带跑至刚过浓缩胶，刚刚分开时，这个过程大约需要50 min，调电压为100 v，大约需要220 min电泳结束，用银染的方法显色。
[0046]
（5）将tricine-sds-page胶放入孵育中，固定：在孵育盒中加30 ml固定液， 30 min后弃去固定液。加入30 ml双蒸水，水洗10 min，弃去。水洗步骤重复三次。
[0047]
致敏：在孵育盒中加30 ml致敏液，避光30 min后弃去致敏液。加入30 ml双蒸水，水洗10 min，弃去。水洗步骤重复三次。
[0048]
银染：在孵育盒中加30 ml银染液，避光银染30 min后弃去银染液。加入30 ml双蒸水，快速水洗10 s，倒掉水。水洗步骤重复三次。
[0049]
显色：把30 ml显色液和20 μl的甲醛混匀后加入孵育盒，置摇床上低速晃动，待目的条带出现；终止：目的条带出现后，加入1 ml终止液，防止胶被染糊。
[0050]
结果如图2所示，从图中显示可知，硫酸铵40%浓度沉降得到抑菌活性最强的蛋白组分其相对分子质量大约为23kda。
[0051]
【利用糖基化反应对刺梨蛋白进行修饰】实施例9~16
使用美拉德反应条件制备刺梨蛋白-多糖缀合物或刺梨蛋白-单糖缀合物。
[0052]
（1）将不同种类的单糖和多糖溶解在50毫米磷酸钠缓冲溶液(ph 7.0)中；（其中：实施例9~16所使用的糖的种类依次为：葡萄糖、果糖、香菇多糖、海藻多糖、葡聚糖、番石榴多糖、果糖与海藻多糖3:1形成的复合糖1和复合糖2）。
[0053]
（2）向上述糖溶液中加入硫酸铵40%浓度沉降得到的刺梨蛋白样品，使得糖类化合物的添加量为刺梨蛋白质量的5%，溶液在室温下在磁力搅拌器上搅拌2小时，以完全溶解混合物。
[0054]
（3）通过小心添加0.1 n盐酸或0.1 n氢氧化钠调节溶液的酸碱度至所需的酸碱度。
[0055]
（4）将溶液冷冻干燥，然后放入底部含有饱和kbr溶液的干燥器中，在45℃以及79%相对湿度条件下反应24h，每个实验进行三次，得到糖基化刺梨蛋白。
[0056]
【糖基化刺梨蛋白的抑菌活性的测定】发明者以大肠埃希菌、肠沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株为研究对象。每株细菌在37℃营养肉汤中培养16h，然后将初始od
450
稀释至0.5左右。将20微升刺梨蛋白、各种修饰后的刺梨蛋白 [500 mg/ml放入ph7.4的磷酸盐缓冲盐水中]分别与100ml的菌悬液混合。以磷酸盐缓冲盐水代替样品作为对照。37℃孵育30min后，测得最终od值。
[0057]
结果如图3所示，从图中显示，刺梨蛋白在温和的美拉德反应下，进行糖基化修饰后，刺梨蛋白较未进行修饰的刺梨蛋白抑菌活性有一定的提高。刺梨蛋白与不同的糖结合后产生的缀合物的抑菌活性随着结合的多糖类型不同而不同。同时，申请者发现，复合糖1-刺梨蛋白复合物的缀合物的抑菌活性表现最好，抑菌活性达到了百分之九十以上。这说明，通过糖基化修饰可以提高刺梨蛋白的抑菌活性。
[0058]
【刺梨蛋白耐热性的测定】（1）取大肠埃希菌、肠沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株为研究对象，每株细菌在37℃营养肉汤中培养16h，然后将初始od
450
稀释至0.5左右。
[0059]
（2）将20微升、浓度为500 mg/ml的刺梨蛋白、刺梨蛋白-海藻多糖果糖复合糖放入ph7.4的磷酸盐缓冲盐水中分别与100ml的菌悬液混合。
[0060]
（3）以磷酸盐缓冲盐水代替样品作为对照。
[0061]
（4）将两个样品分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃孵育30min后，测得最终od值。
[0062]
结果如图4所示显示，刺梨蛋白与复合糖1-刺梨蛋白复合物都的抑菌活性都随着温度的升高先增强在减弱，且刺梨蛋白和复合糖1-刺梨蛋白复合物都在45℃时达到最高的抑菌活性。同时复合糖1-刺梨蛋白复合物的抑菌活性随着温度的升高下降的幅度较刺梨蛋白的下降幅度较缓，可以表明复合糖1-刺梨蛋白复合物都的耐热性要优于刺梨蛋白。这说明，通过糖基化修饰可以提高刺梨蛋白的耐热性。
[0063]
实施例17使用美拉德反应条件制备刺梨蛋白-多糖缀合物或刺梨蛋白-单糖缀合物。
[0064]
（1）将果糖与海藻多糖3:1形成的复合糖1溶解在50毫米磷酸钠缓冲溶液(ph 7.0)中。
[0065]
（2）向上述糖溶液中加入硫酸铵40%浓度沉降得到的刺梨蛋白样品，使得糖类化合物的添加量为刺梨蛋白质量的1%，溶液在室温下在磁力搅拌器上搅拌2小时，以完全溶解混合物。
[0066]
（3）通过小心添加0.1 n盐酸或0.1 n氢氧化钠调节溶液的酸碱度至所需的酸碱度。
[0067]
（4）将溶液冷冻干燥，然后放入底部含有饱和kbr溶液的干燥器中，在40℃以及60%相对湿度条件下反应48h，每个实验进行三次，得到糖基化刺梨蛋白。
[0068]
实施例18使用美拉德反应条件制备刺梨蛋白-多糖缀合物或刺梨蛋白-单糖缀合物。
[0069]
（1）将果糖与海藻多糖3:1形成的复合糖1溶解在50毫米磷酸钠缓冲溶液(ph 7.0)中。
[0070]
（2）向上述糖溶液中加入硫酸铵40%浓度沉降得到的刺梨蛋白样品，使得糖类化合物的添加量为刺梨蛋白质量的1%，溶液在室温下在磁力搅拌器上搅拌2小时，以完全溶解混合物。
[0071]
（3）通过小心添加0.1 n盐酸或0.1 n氢氧化钠调节溶液的酸碱度至所需的酸碱度。
[0072]
（4）将溶液冷冻干燥，然后放入底部含有饱和kbr溶液的干燥器中，在60℃以及85%相对湿度条件下反应0.5h，每个实验进行三次，得到糖基化刺梨蛋白。
[0073]
综上所述，通过筛选获取的刺梨抑菌蛋白在提取纯化后，其抑菌活性较相同浓度下的刺梨粗提取液显著提高，并且具有一定的热稳定性。在相同温度下，刺梨抑菌蛋白较刺梨粗提取液具有更高的抑菌活性。同时刺梨抑菌蛋白的抑菌活性较刺梨粗提取液其随着温度的升高，抑菌活性降低较为缓慢。此外，在通过美拉德反应的修饰后的糖基化刺梨蛋白又较刺梨蛋白有更加出色的抑菌能力与热稳定性，总体表现也有一定幅度的提升。综上，以上技术有效提高了刺梨天然蛋白的抑菌活性与热稳定性，较好的抑菌活性与热稳定大大提高了刺梨蛋白作为植物抗菌肽替代传统抗生素的可能与前景。