一种MOFs固载酶及其制备方法和应用与流程

一种mofs固载酶及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种mofs固载酶及其制备方法和应用，属于材料与生物工程交叉技术领域。


背景技术：

2.近几年来，由于红霉素产量的不断增加，红霉素菌渣的含量也不断增加，对人类的危害也日益增加，首先就是菌渣中过剩的营养物质会使微生物过度繁殖，其次就是会导致耐药性微生物的富集，改变原有的环境的菌群结构，所以迫切需要更多安全的方法来处理抗生素菌渣。目前红霉素菌渣处理方法大致有:焚烧处理、厌氧消化技术处理、饲料化处理、肥料化处理、菌渣提纯、能源化处理，这些处理方法往往处理成本高，同时也产生另外的环境问题。而生物法处理红霉素菌渣有着处理成本低，无二次污染等优点。
3.目前，大多生物处理研究集中在红霉素降解菌的筛选和分离，而对红霉素降解酶的研究较少。红霉素通常由内酯环、红霉糖和氧氨基糖组成。在红霉素降解过程中，内酯环的水解是由红霉素酯酶催化的，酶催化起着关键作用，红霉素酯酶活性是直接关系到红霉素降解效率的因素。而现有红霉素降解酶ereb可以在温和的条件下有效地降解红霉素，但是由于酶的不可回收导致应用成本较高，从而限制了其推广应用。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种mofs固载酶及其制备方法和应用，mofs固载酶具有显著的稳定性和可回收性，可以有效降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体，有利于在产业化中的放大应用。
5.为解决上述技术问题，本发明提供一种mofs固载酶的制备方法，包括：将等量的红霉素降解酶与mofs材料溶解于tris
‑
hcl，调整 ph为6.0～8.0，25～35℃搅拌2～3小时，冷冻干燥得到mofs固载酶ereb@cu
‑
btc。
6.优选地，所述mofs为cu
‑
btc。
7.优选地，所述红霉素降解酶为ereb酶。
8.优选地，所述冷冻干燥温度为
‑
65~
‑
45℃。
9.优选地，采用hcl和tris调整溶液 ph为6.0～8.0。
10.优选地，所述mofs材料的具体制备方法为：将三水合硝酸铜、冰醋酸、三甲胺溶于乙醇中用磁力搅拌机室温搅拌1个小时；将均苯三甲酸加入到上述溶液中，用磁力搅拌机30℃搅拌1个小时，所述三水合硝酸铜、冰醋酸、三甲胺、均苯三甲酸的摩尔比为3：3：1：1；加入反应釜，85℃加热24小时；将上述产物离心回收固定，并用乙醇洗涤3次；将上述产物用乙醇30℃处理12小时；将上述产物
‑
65~
‑
45℃冷冻干燥得到最终产物。
11.本发明还提供上述的方法制备得到的mofs固载酶。
12.本发明还提供上述的mofs固载酶在降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体中的应用。
13.本发明所达到的有益效果：金属有机框架（metal
‑
organic frameworks，mofs）具有比表面积大、孔隙率可调、功能性可设计、稳定性好等特点，作为酶固定化的基质材料有着非常好的前景。mofs固定化酶具有显著的稳定性和可回收性，可以有效降解含红霉素的菌渣、污水、环境中的水体，有利于在产业化中的放大应用。
附图说明
14.图1是制备得到的cu
‑
btc材料；图2是ereb@cu
‑
btc在不同温度下的酶活；图3是ereb@cu
‑
btc在不同ph下的酶活；图4是ereb@cu
‑
btc应用在红霉素发酵菌渣中的降解率；图5是ereb@cu
‑
btc应用在含红霉素水体中的降解率。
具体实施方式
15.下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
16.实施例1本发明提供一种mofs固载酶的制备方法，包括以下步骤：1.制备cu
‑
btc材料在室温下将cu(no3)2
·
3h2o(0.435g，1.8mmol)、冰醋酸(0.62ml，10.8mmol)、三甲胺0.50ml溶于12ml乙醇中。室温搅拌1h后，将h3btc(0.210g，1.0mmol)加入深蓝色溶液中。将混合物再搅拌2小时，形成均匀的溶液。然后将混合物转移到内衬特氟龙的高压釜中。将混合物在85℃下加热24小时。通过离心回收固体，用乙醇洗涤三次。最后，将产物用30℃的乙醇处理12h。
‑
65~
‑
45℃冷冻干燥，得到了cu
‑
btc产物（如图1）。
17.2.ereb酶的固定化等量的红霉素降解酶ereb酶与mofs材料溶解于tris
‑
hcl，采用hcl和tris调整溶液ph为8.0，30℃搅拌2h，
‑
65~
‑
45℃冷冻干燥得到最终产物ereb@cu
‑
btc。
18.实施例2mofs固载酶酶活的测定：1.不同温度下的酶活向100ml的超纯水中加入1ml浓度为10g/l的红霉素甲醇溶液，配置成100mg/l的红霉素溶液；然后加入0.1g已制备的ereb@cu
‑
btc，分别置于25、35、45、55、65℃水浴摇床中反应10分钟；测定上述不同温度下的酶活（如图2）。
19.由图2可知，ereb@cu
‑
btc的最适反应温度在55℃。
20.2.不同ph条件下的酶活分别向100ml的na2hpo4
‑
nah2po4缓冲液（ph=7、7.5、8）、tris
‑
hcl（ph=8、8.5、9）、
gly
‑
naoh（ph=9、9.5、10）中加入1ml浓度为10g/l的红霉素甲醇溶液，配置成100mg/l的不同ph的红霉素溶液；然后加入0.1g已制备的ereb@cu
‑
btc，置于55℃水浴摇床中反应10分钟；测定上述不同ph下的酶活（如图3）。
21.由图3可知，ereb@cu
‑
btc的最适反应ph在8.0，且tris
‑
hcl更优。
22.实施例3ereb@cu
‑
btc在菌渣里的应用：取100ml红霉素菌渣，经测定红霉素浓度为650mg/l左右；然后加入0.65g已制备的ereb@cu
‑
btc，置于常温常压下反应30min。搅拌促进催化，15min降解率达到80%（如图4），离心收集ereb@cu
‑
btc，重复以上步骤再次利用回收率达70%。
23.对照组为在相同体系中加入等量的未负载的ereb酶。
24.由图4可知，ereb@cu
‑
btc在菌渣中15分钟左右降解率大于80%，效果较好，且与游离的酶相比降解效率与速率更优。
25.实施例4ereb@cu
‑
btc在含红霉素废水里的应用：取100ml的药厂污水，经测定红霉素浓度为350mg/l左右；然后加入0.35g已制备的ereb@cu
‑
btc，置于常温常压下反应30min，搅拌促进催化，20min降解率达到80%（如图5），离心收集ereb@cu
‑
btc，回收率达85%。
26.对照组为在相同体系中加入等量的未负载的ereb酶，且与游离的酶相比降解效率与速率更优。
27.由图5可知，ereb@cu
‑
btc在水体中降解效果不如在菌渣中，在25分钟时达到83%。
28.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。