一种深海微生物分离培养装置与培养方法与流程

1.本发明涉及微生物培养技术领域，特别是涉及一种深海微生物分离培养装置与培养方法。


背景技术：

2.海洋中蕴藏着巨大的微生物资源,并以其广阔的应用前景,吸引了世界各国大量财力和物力的投入。海洋环境比较特殊,具有寡营养、低温、低氧和高压的特点，这些特殊环境导致了海洋微生物种类的多样性和特殊性,如抗逆性(耐盐、耐高压、耐寒等)，生物降解特性(对石油等有机污染物及重金属离子的降解)和其他优良的生物特性(杀虫、杀菌)。
3.常规的微生物固体平板分离方法主要包括涂布平板法、接种划线法，需要复杂的消毒、接种、划线流程，难以进行自动筛选，需要专业的操作人员。此外，海洋环境中的微生物一般存在高压环境下，在分离过程中，需要释压后才可以进行单菌落划线分离，这样的技术制约了海洋特殊环境微生物培养工程的发展，也进一步限制了我们对海洋微生物的认识。
4.对于此，现有技术公开了一种深海微生物培养舱，包括：直线轴承、拉簧、压力补偿腔、固定顶板、深海电机组件、固定底板、软管和培养舱本体；该方案通过深海电机组件转动顶开培养舱本体的端盖，在完全开放的状态下进行微生物富集培养，在布放和回收过程中，关闭培养舱本体的端盖实现微生物培养舱体密封。其虽然可实现深海原位状态的微生物富集培养，但并未将海洋微生物进行分离培养，无法有效提高培养的成功率。


技术实现要素：

5.本发明为了解决以上至少一种技术缺陷，提供一种深海微生物分离培养装置与培养方法，在高压环境下实现自动化划线分离工艺，有效的提高纯培养的效率，为分离培养高效的海洋特殊微生物菌提供重要的基础手段。
6.为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
7.一种深海微生物分离培养装置，包括分离培养器、控制采集系统、压力控制系统、温度控制系统、进样管道和注液单元；所述分离培养器包括底座、上盖和螺杆；底座与上盖螺纹连接；在底座内壁表面设置有内螺纹，内螺纹的形状为“u”型；所述螺杆外表面设置有与内螺纹配合连接的外螺纹，外螺纹的形状类似“l”型；所述底座、螺杆之间通过内螺纹和外螺纹连接后，内螺纹与外螺纹之间具有一定的空隙，用于装入固体培养基；所述进样管道设置在上盖上，用于向分离培养器内投入培养菌液样品；所述注液单元与进样管道连接，用于向进样管道注入微生物菌液；所述压力控制系统、温度控制系统分别与分离培养器连接，用于保证分离培养器内部压力、温度与深海微生物培养的环境一致；所述压力控制系统的控制端、压力控制系统的采集端、温度控制系统的控制端、温度控制系统的采集端、进样管道的控制端和注液单元的控制端与控制采集系统电性连接。
8.当固体培养基凝固后，取出螺杆，关闭上盖，开启压力控制系统、温度控制系统保
证分离培养器内部温度和压力与微生物生长的环境一致；由注液单元向进样管道注入微生物菌液，进样管道向分离培养器的内螺纹内投入培养菌液样品，样品在重力作用下沿着内螺纹向下滑动，在移动过程中，其携带的微生物菌液将逐步递减，实现了对微生物的分离；分离后的微生物在固体培养基上生长，实现了微生物的分离培养。
9.上述方案中，通过重力作用使得样品在内螺纹中向下滑动，可以在海洋原位环境条件下，实现环境采样富集的微生物菌液的自动划线分离，改善现有平板划线分离培养需要压力释放的难点，有效的提高了微生物固体分离培养的效率，为分离培养高效的海洋特殊微生物菌提供重要的基础手段。
10.分离培养器是本方案的核心，在原位高压环境下，可以直接实现菌群的分离过程；同时可以不依赖专业人员利用接种环进行接种划线操作，避免接种环消毒过程不标准引入杂菌，或者接种环温度不合适，导致挑选菌种死亡，带来划线生长过程失败的问题。
11.上述方案中，控制采集系统包括中央控制系统、计算机等，实现富集的海洋微生物在高压环境分离和培养过程中各项环境数据信息变化、以及实时采集、处理、存储和图像输出等功能。
12.其中，在所述内螺纹一侧的侧壁上设置有垫片，垫片位于内螺纹一侧的中部，用于在内螺纹与螺杆上的外螺纹相互配对时，保证内螺纹与外螺纹之间具有一定的空隙，用于装入固体培养基。
13.其中，所述压力控制系统包括储气罐、调压阀、空压机、增压泵、注气管道、压力传感器和注气阀门；所述空压机、增压泵、储气罐和调压阀通过注气管道依次连接，最后注气管道通过注气阀门与所述上盖连接；所述压力传感器探头设置在所述分离培养器内部，其信号输出端与所述控制采集系统电性连接；所述调压阀控制端、空压机控制端、增压泵控制端、注气阀门控制端与所述控制采集系统电性连接。
14.其中，所述温度控制系统包括水浴装置和温度传感器；所述水浴装置包裹在所述分离培养器外壁，其控制端与所述控制采集系统电性连接；所述温度传感器探头设置在所述分离培养器内部，其信号输出端与所述控制采集系统电性连接。
15.上述方案中，压力传感器和温度传感器的设置用于监控培养过程中，分离培养器的环境参数变化，便于实时进行调整，保障培养环境的稳定。
16.其中，所述进样管道包括掷样阀门、管道主体、投样阀门和携样小球；所述管道主体固定设置在所述在上盖上，与内螺纹连通；所述掷样阀门固定设置在上盖外部的管道主体上；所述投样阀门固定设置在掷样阀门和上盖外部的管道主体之间；掷样阀门控制端、投样阀门控制端均与所述控制采集系统电性连接；其中：先打开掷样阀门，向管道主体投入携样小球后关闭掷样阀门；开启注液单元向管道主体内注入微生物菌液，使得携样小球浸没在微生物菌液中；然后开启投样阀门，使得携样小球掉落到分离培养器的内螺纹内，携样小球在重力作用下沿着内螺纹向下滑动，在移动过程中，其携带的微生物菌液将逐步递减，实现了对微生物的分离。
17.其中，所述注液单元包括微生物培养釜、微注泵和注液管道；所述微生物培养釜通过注液管道与所述管道主体连接，微注泵设置在所述注液管道上；所述微注泵的控制端与所述控制采集系统电性连接；微生物培养釜用于培养深海微生物并产出微生物菌液，所述微注泵将微生物菌液泵入所述管道主体中。
18.本方案还提出一种深海微生物分离培养方法，应用上述一种深海微生物分离培养装置实现，具体包括以下步骤：
19.s1：对深海微生物分离培养装置进行清洗灭菌，并装入固体培养基；
20.s2：根据深海微生物培养的环境压力值确定分离培养器内的压力值，开启注气阀门，用压力控制系统往分离培养器注入微生物培养所需的气体或惰性气体，直至分离培养器中的压力值与微生物培养的压力值一致；
21.s3：根据深海微生物培养的环境温度值确定分离培养器内的温度值，开启温度控制系统使分离培养器内具有与微生物培养环境一致的温度；
22.s4：由注液单元向进样管道注入微生物菌液，进样管道向分离培养器的内螺纹内投入培养菌液样品，样品在重力作用下沿着内螺纹向下滑动，在移动过程中，其携带的微生物菌液将逐步递减，实现了对微生物的分离；
23.s5：分离后的微生物在固体培养基上生长，实现了微生物的分离培养。
24.其中，步骤s1中，所述对深海微生物分离培养装置进行清洗灭菌的过程具体为：清洗分离培养器，打开上盖、底座和螺杆，上盖用75％酒精擦拭；底座装入75％酒精，待酒精消毒结束并回收底座内的75％酒精，再置于紫外下灭菌15min。
25.其中，步骤s1中，所述装入固体培养基的过程具体为：
26.s11：待灭菌结束，将螺杆按照逆时针方向旋转到底座的内部，再加入事先灭菌完成的固体培养基，然后合上上盖；
27.s12：待到固体培养基凝固时，打开上盖，固定住螺杆，通过握住底座侧壁进行旋转，将螺杆旋转拿出，最后再合上上盖，完成装入固体培养基的过程。
28.其中，步骤s4具体包括以下步骤：
29.s41：打开掷样阀门，向管道主体投入携样小球后关闭掷样阀门；
30.s42：开启微注泵将微生物培养釜内的微生物菌液泵入管道主体中，使得携样小球浸没在微生物菌液中；
31.s43：开启投样阀门，使得携样小球掉落到分离培养器的内螺纹内，携样小球在重力作用下沿着内螺纹向下滑动，在移动过程中，其携带的微生物菌液将逐步递减，实现了对微生物的分离。
32.本方案主要涉及一种深海微生物分离培养装置与培养方法，在高压环境条件下，提出了自动划线分离培养装置与自动化分离培养工艺。本方案克服海洋特殊菌种需要释压后才能分离的难点，且该装置不需要专业操作人员即可实现自动操作划线，利用小球携带菌液移动自动划线实现微生物的生长分离，减少人力成本，提高工程菌的筛选与利用效率。
33.本方案相对于现有的固体平板分离培养技术，不需要专业人员利用接种环灭菌后挑取菌液进行划线接种，只需要注入少量菌液便可实现自动划线，完成分离工作，提高操作人员的普适性；本方案相对于现有海洋特殊菌种在筛选过程中，需要释压才可分离进行的难点，实现了在保压过程完成单菌落的分离工作，提高难培养微生物的筛选效率，提高有特殊功能的工程菌的筛选和培育效率。
34.与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
35.本发明提出了一种深海微生物分离培养装置及培养方法，通过重力作用使得样品在内螺纹中向下滑动，可以在海洋原位环境条件下，实现环境采样富集的微生物菌液的自
动划线分离，改善现有平板划线分离培养需要压力释放的难点，有效的提高了微生物固体分离培养的效率，为分离培养高效的海洋特殊微生物菌提供重要的基础手段。
附图说明
36.图1为本发明所述深海微生物分离培养装置的结构示意图；
37.图2为本发明所述控制采集系统电路模块连接示意图；
38.图3为本发明所述深海微生物分离培养方法的流程示意图；
39.图4为本发明一实施例中螺杆的结构示意图；
40.其中：1、分离培养器；11、底座；12、上盖；13、螺杆；131、手柄；2、控制采集系统；3、压力控制系统；31、储气罐；32、调压阀；33、空压机；34、增压泵；35、注气管道；36、压力传感器；37、注气阀门；4、温度控制系统；41、水浴装置；42、温度传感器；5、进样管道；51、掷样阀门；52、管道主体；53、投样阀门；54、携样小球；6、注液单元；61、微生物培养釜；62、微注泵；63、注液管道。
具体实施方式
41.附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；
42.本实施例为完整的使用示例，内容较丰富
43.为了更好说明本实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；
44.对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。
45.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
46.实施例1
47.如图1、图2、图4所示，提供一种深海微生物分离培养装置，包括分离培养器1、控制采集系统2、压力控制系统3、温度控制系统4、进样管道5和注液单元6；其中：所述分离培养器1包括底座11、上盖12和螺杆13；底座11与上盖12螺纹连接；在底座11内壁表明设置有内螺纹，内螺纹的形状为“u”型；所述螺杆13外表面设置有与内螺纹11配合连接的外螺纹，外螺纹的形状类似“l”型；所述底座11、螺杆13之间通过内螺纹和外螺纹连接后，内螺纹与外螺纹之间具有一定的空隙，用于装入固体培养基；所述进样管道5设置在上盖12上，用于向分离培养器1内投入培养菌液样品；所述注液单元6与进样管道5连接，用于向进样管道5注入微生物菌液；所述压力控制系统3、温度控制系统4分别与分离培养器1连接，用于保证分离培养器1内部压力、温度与深海微生物培养的环境一致；
48.所述压力控制系统3的控制端、压力控制系统3的采集端、温度控制系统4的控制端、温度控制系统4的采集端、进样管道5的控制端和注液单元6的控制端与控制采集系统2电性连接；
49.当固体培养基凝固后，取出螺杆13，关闭上盖12，开启压力控制系统3、温度控制系统4保证分离培养器1内部温度和压力与微生物生长的环境一致；由注液单元6向进样管道5注入微生物菌液，进样管道5向分离培养器1的内螺纹内投入培养菌液样品，样品在重力作用下沿着内螺纹向下滑动，在移动过程中，其携带的微生物菌液将逐步递减，实现了对微生
物的分离；分离后的微生物在固体培养基上生长，实现了微生物的分离培养。
50.在具体实施过程中，通过重力作用使得样品在内螺纹中向下滑动，可以在海洋原位环境条件下，实现环境采样富集的微生物菌液的自动划线分离，改善现有平板划线分离培养需要压力释放的难点，有效的提高了微生物固体分离培养的效率，为分离培养高效的海洋特殊微生物菌提供重要的基础手段。
51.分离培养器1是本方案的核心，在原位高压环境下，可以直接实现菌群的分离过程；同时可以不依赖专业人员利用接种环进行接种划线操作，避免接种环消毒过程不标准引入杂菌，或者接种环温度不合适，导致挑选菌种死亡，带来划线生长过程失败的问题。
52.在具体实施过程中，控制采集系统2包括中央控制系统、计算机等，实现富集的海洋微生物在高压环境分离和培养过程中各项环境数据信息变化、以及实时采集、处理、存储和图像输出等功能。
53.更具体的，在所述内螺纹一侧的侧壁上设置有垫片，垫片位于内螺纹一侧的中部，用于在内螺纹与螺杆上的外螺纹相互配对时，保证内螺纹与外螺纹之间具有一定的空隙，用于装入固体培养基。
54.更具体的，所述压力控制系统3包括储气罐31、调压阀32、空压机33、增压泵34、注气管道35、压力传感器36和注气阀门37；所述空压机33、增压泵34、储气罐31和调压阀32通过注气管道35依次连接，最后注气管道35通过注气阀门37与所述上盖12连接；所述压力传感器36探头设置在所述分离培养器1内部，其信号输出端与所述控制采集系统2电性连接；所述调压阀32控制端、空压机33控制端、增压泵34控制端、注气阀门37控制端与所述控制采集系统2电性连接。
55.更具体的，所述温度控制系统4包括水浴装置41和温度传感器42；所述水浴装置41包裹在所述分离培养器1外壁，其控制端与所述控制采集系统2电性连接；所述温度传感器42探头设置在所述分离培养器1内部，其信号输出端与所述控制采集系统2电性连接。
56.在具体实施过程中，压力传感器36和温度传感器42的设置用于监控培养过程中，分离培养器1的环境参数变化，便于实时进行调整，保障培养环境的稳定。
57.更具体的，所述进样管道5包括掷样阀门51、管道主体52、投样阀门53和携样小球54；所述管道主体52固定设置在所述在上盖12上；所述掷样阀门51固定设置在上盖12外部的管道主体52上，所述投样阀门53固定设置在掷样阀门51和上盖12外部的管道主体52上；掷样阀门51控制端、投样阀门53控制端均与所述控制采集系统2电性连接；其中：先打开掷样阀门51，向管道主体52投入携样小球54后关闭掷样阀门51；开启注液单元6向管道主体52内注入微生物菌液，使得携样小球54浸没在微生物菌液中；然后开启投样阀门53，使得携样小球54掉落到分离培养器1的内螺纹内，携样小球54在重力作用下沿着内螺纹向下滑动，在移动过程中，其携带的微生物菌液将逐步递减，实现了对微生物的分离。
58.更具体的，所述注液单元6包括微生物培养釜61、微注泵62和注液管道63；所述微生物培养釜61通过注液管道63与所述管道主体52连接，微注泵62设置在所述注液管道63上；所述微注泵62的控制端与所述控制采集系统2电性连接；微生物培养釜61用于培养深海微生物并产出微生物菌液，所述微注泵(62)将微生物菌液泵入所述管道主体52中。
59.在实施例在具体实施过程中，通过重力作用使得样品在内螺纹中向下滑动，可以在海洋原位环境条件下，实现环境采样富集的微生物菌液的自动划线分离，改善现有平板
划线分离培养需要压力释放的难点，有效的提高了微生物固体分离培养的效率，为分离培养高效的海洋特殊微生物菌提供重要的基础手段。
60.实施例2
61.更具体的，在实施例1的基础上，如图3所示，本实施例提出一种深海微生物分离培养方法，应用一种深海微生物分离培养装置实现，具体包括以下步骤：
62.s1：对深海微生物分离培养装置进行清洗灭菌，并装入固体培养基；
63.s2：根据深海微生物培养的环境压力值确定分离培养器1内的压力值，开启注气阀门37，用压力控制系统3往分离培养器1注入微生物培养所需的气体或惰性气体，直至分离培养器1中的压力值与微生物培养的压力值一致；
64.s3：根据深海微生物培养的环境温度值确定分离培养器1内的温度值，开启温度控制系统4使分离培养器1内具有与微生物培养环境一致的温度；
65.s4：由注液单元6向进样管道5注入微生物菌液，进样管道5向分离培养器1的内螺纹内投入培养菌液样品，样品在重力作用下沿着内螺纹向下滑动，在移动过程中，其携带的微生物菌液将逐步递减，实现了对微生物的分离；
66.s5：分离后的微生物在固体培养基上生长，实现了微生物的分离培养。
67.更具体的，在步骤s1中，所述对深海微生物分离培养装置进行清洗灭菌的过程具体为：清洗分离培养器1，打开上盖12、底座11和螺杆13，上盖12用75％酒精擦拭；底座11装入75％酒精，待酒精消毒结束并回收底座内的75％酒精，再置于紫外下灭菌15min。
68.更具体的，在步骤s1中，所述装入固体培养基的过程具体为：
69.s11：待灭菌结束，将螺杆13按照逆时针方向旋转到底座11的内部，再加入事先灭菌完成的固体培养基，然后合上上盖12；
70.s12：待到固体培养基凝固时，打开上盖12，固定住螺杆13，通过握住底座11侧壁进行旋转，将螺杆13旋转拿出，最后再合上上盖12，完成装入固体培养基的过程。
71.更具体的，步骤s4具体包括以下步骤：
72.s41：打开掷样阀门51，向管道主体52投入携样小球54后关闭掷样阀门51；
73.s42：开启微注泵62将微生物培养釜61内的微生物菌液泵入管道主体52中，使得携样小球54浸没在微生物菌液中；
74.s43：开启投样阀门53，使得携样小球54掉落到分离培养器1的内螺纹内，携样小球54在重力作用下沿着内螺纹向下滑动，在移动过程中，其携带的微生物菌液将逐步递减，实现了对微生物的分离。
75.本实施例主要涉及一种深海微生物分离培养装置，在高压环境条件下，提出了自动划线分离培养装置与自动化分离培养工艺。本实施例克服海洋特殊菌种需要释压后才能分离的难点，且该方法不需要专业操作人员即可实现自动操作划线，利用小球携带菌液移动自动划线实现微生物的生长分离，减少人力成本，提高工程菌的筛选与利用效率。
76.本实施例相对于现有的固体平板分离培养技术，不需要专业人员利用接种环灭菌后挑取菌液进行划线接种，只需要注入少量菌液便可实现自动划线，完成分离工作，提高操作人员的普适性；本实施例相对于现有海洋特殊菌种在筛选过程中，需要释压才可分离进行的难点，实现了在保压过程完成单菌落的分离工作，提高难培养微生物的筛选效率，提高有特殊功能的工程菌的筛选和培育效率。
77.实施例3
78.为了进一步说明本方案的技术实现过程和技术效果，本实施例提供一种深海嗜甲烷菌分离培养装置与技术。分离培养器1是本实施例的核心，在原位高压环境下，可以直接实现菌群的分离过程；同时可以不依赖专业人员利用接种环进行接种划线操作，避免接种环消毒过程不标准引入杂菌，或者接种环温度不合适，导致挑选菌种死亡，带来划线生长过程失败的问题。
79.本实施例涉及的分离培养器1是由上盖12和底座11组成，上盖12和底座11之间通过螺纹连接。上盖12的左侧设置有进样管道5，进样管道5上设置掷样阀门51和投样阀门53，掷样阀门51、投样阀门53和管道主体52的直径均稍大于携样小球54的直径，携样小球54位于进样管道5内，通过掷样阀门51、投样阀门53控制其在进样管道5内的位置。携样小球54上的菌液来源于微注泵62注入的微生物菌液。上盖12的左侧设置有与压力控制系统3连接的进气管道，根据培养微生物类型的特异性，选择甲烷气体。上盖12的前方设置有温度传感器42和压力传感器36，主要用于监控培养过程中分离培养器1的环境参数变化。底座11的内部设置有内螺纹，内螺纹为“u”型，与底座11的内壁焊接相连，内螺纹一侧的侧壁设置有垫片，垫片位于内螺纹的一侧的中部位置，该垫片主要作用为当该内螺纹与螺杆13上的外螺纹相互配对时，内螺纹与螺杆上的外螺纹之间具有一定的空隙，该空隙用于装固体培养基。分离培养器1和各个管道内的压力，均通过压力控制系统3控制并补充相应的压力。
80.本发明涉及的压力控制系统3主要是用于分离培养器1内注入气体增压，包括储气罐31、调压阀32、空压机33和增压泵34组成。本实施例涉及的控制采集系统2包括中央控制系统、计算机等，实现富集的海洋微生物在高压环境分离和培养过程中各项环境数据信息变化、以及实时采集、处理、存储和图像输出等功能。
81.本实施例涉及的一种深海嗜甲烷菌分离培养装置与技术，主要是在分离培养器内构建与微生物在海洋环境中生活一样的高压环境。首先清洗分离培养器1，打开上盖12、底座11和螺杆13，上盖12用75％酒精擦拭、底座11装入75％酒精，待酒精消毒结束并回收底座11内的75％酒精，再置于紫外下灭菌15min。待灭菌结束，将螺杆13按照逆时针方向旋转到底座11的内部，再加入事先灭菌完成的固体培养基，最后合上上盖12。当固体培养基完全凝固时，打开上盖12，一只手握住螺杆13顶部的手柄131、一只手握住底座11的侧壁，将螺杆13旋转拿出，最后再合上上盖12。然后根据微生物富集釜61内的压力值确定分离培养器1内的压力值，通过打开注气阀门37，用压力控制系统3往分离培养器1内注入甲烷气体，使分离培养器1内的压力值与微生物富集釜61一致。然后，根据微生物富集釜61内的温度值确定分离培养器1内的温度值，通过将分离培养器1置于水浴装置41的水浴环境内获得与微生物富集釜61内一致的温度。然后，打开进样管道5上的掷样阀门51，将灭菌后的携样小球54置于进样管道5内，再关闭掷样阀门51，此时的携样小球54进入投样阀门53的上方。然后，将含微生物的少量菌液从微生物富集釜61通过微注泵62注入到投样阀门53的上方内，使得携样小球54完全被菌液包裹。通过控制投样阀门53的开启，使携样小球54掉落在内螺纹上面的固体培养基上，并在重力的作用下在固体培养基的表面按照一定轨迹划线，最后分离的微生物将按照划线轨迹生长，实现单个菌落的分离。培养一定周期后，即可开始进行单菌落的分离培养工作。在整个挑选和培养过程中，保持分离培养器1内的压力、温度值与微生物最初所在的微生物富集釜61内的压力、温度环境一致，使得微生物在原位高压情况内实现分离。
82.本实施例提出了一种深海微生物分离培养装置及培养方法，通过重力作用使得携样小球54在内螺纹中向下滑动，可以在海洋原位环境条件下，实现环境采样富集的微生物菌液的自动划线分离，改善现有平板划线分离培养需要压力释放的难点，有效的提高了微生物固体分离培养的效率，为分离培养高效的海洋特殊微生物菌提供重要的基础手段。
83.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。