基于F12基因甲基化的肝癌早期检测的制作方法

基于f12基因甲基化的肝癌早期检测
技术领域
1.本发明涉及一种基于f12基因甲基化的肝癌检测方法，以及相应的用于肝癌检测的试剂盒，可用于肝癌的筛查。


背景技术：

2.原发性肝细胞癌(hcc)是我国发病率第5、死亡率第2的恶性肿瘤。近5年中国大陆地区原发性肝癌平均年发病例数为42.3万例，占全球42.5％。原发性肝癌的病理类型包括肝细胞癌(hcc)、胆管细胞癌(icc)和hcc-icc混合型肝癌，其中hcc占85-90％。肝癌严重威胁我国人民的生命健康，我国肝癌的五年总生存率目前只有14.1％。一个重要原因在于我国肝癌的早期确诊率低，超过70％的患者在确诊时已经为中晚期，错过最佳的治疗时期。而对于单个肿瘤直径小于3-5cm的小肝癌，利用手术和放化疗联合治疗后，患者的5年生存率可超过60％。所以肝癌的早筛早诊对于提高患者生存率和治疗效果非常重要。
3.肝癌有明确的病因及危险因素。在我国，乙型肝炎病毒(hbv)感染、丙型肝炎病毒(hcv)感染、酒精性肝病(ald)、非酒精性脂肪肝病(nafld)、黄曲霉素暴露和糖尿病等都是肝癌的病因，另外肝癌家族史、吸烟和药物性肝脏损伤也是肝癌的危险因素。而各种原因导致的肝硬化是原发性肝癌发生的主要危险因素，例如hbv相关肝硬化患者的肝癌年发生率达3％～6％。根据我国原发性肝癌诊疗指南，对于男性35岁以上、女性45岁以上的肝癌高危人群，应定期进行筛查。
4.目前在临床领域，肝癌的筛查手段主要是超声影像检查和血清甲胎蛋白(afp)，指南建议肝癌高危人群应每6个月进行一次腹部超声和血清afp检测。但afp检测对早期肝癌的灵敏度低(低于50％)，而超声影像检测十分受限于技师的经验和仪器性能等因素，其对于早期肝癌的灵敏度同样较低。近年来，随着液体活检技术的发展，一些新型肝癌标志物如游离dna(cfdna)、微小rna(mirna)陆续被开发，并被证明在肝癌诊断中具有一定的应用价值。
5.血浆cfdna包含一系列来源于身体不同组织的片段化细胞dna，这些dna往往通过细胞外分泌、细胞凋亡或细胞坏死进入血液。以往的研究表明，不同的组织具有不同的dna甲基化特征，因此可以通过一些组织特异性甲基化标记位点或区域进行cfdna组织溯源。sun等利用二代测序进行不同组织来源dna的定量分析，并将该技术应用于不同临床场景的应用，如孕妇的产前诊断、癌症诊断和器官移植后监测等(sun,k.,p.jiang,k.c.a.chan等,2015.plasma dnatissue mapping by genome-wide methylation sequencing for noninvasive prenatal,cancer,and transplantation assessments.proc.natl.acad.sci.u.s.a.112:e5503
–
e5512)。但利用二代测序进行cfdna组织溯源的步骤繁琐、成本高昂，不利于技术转化，而荧光定量pcr方法可以解决上述问题。lehmann-werman等利用荧光定量pcr检测若干组织特异性甲基化标记进行不同组织来源cfdna的定量评估，并将该技术应用于临床的疾病预警(lehmann-werman,r.,d.neiman,h.zemmour等,2016.identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating dna.
proc.natl.acad.sci.u.s.a.113:e1826
–
e1834.)。liu等利用实验室自建的mcta-seq二代测序技术及对应的生信分析方法，对健康人、肝炎、肝癌等人群的血浆样本进行了不同组织来源cfdna定量分析，发现肝癌患者的肝组织来源cfdna含量显著高于健康人、肝炎患者和肝硬化患者的水平(liu x.,ren j.,luo n.等,(2019).comprehensive dnamethylation analysis of tissue of origin of plasma cell-free dnaby methylated cpg tandem amplification and sequencing(mcta-seq).clin.epigenet.11:93.)。


技术实现要素：

6.具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的技术问题。
7.1.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含核酸甲基化检测试剂，所述核酸甲基化检测试剂检测的甲基化基因包含f12(coagulation factor xii)基因。
8.2.根据项1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸甲基化检测试剂为血浆游离核酸甲基化检测试剂，且所述f12基因是由f12基因产生的血浆游离核酸。
9.3.根据项1或2所述的试剂盒，其特征在于，在对甲基化基因进行检测之前，将核酸进行亚硫酸盐转化。
10.4.根据项1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述f12基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与seq id no:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
11.5.根据项1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述f12基因甲基化检测试剂包含至少一个正向引物，至少一个反向引物，和/或至少一个探针。
12.6.根据项5所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一个探针包含选自含seq id no:3,13-15任一个的探针。
13.7.根据项5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一个正向引物和/或至少一个反向引物包含选自含seq id no:1-2,7-12任一个的引物。
14.8.根据项1-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述f12基因甲基化检测试剂包含选自含seq id no:7-9任一个的正向引物，选自含seq id no:10-12任一个的反向引物，和/或选自含seq id no:13-15任一个的探针。
15.9.根据项1-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述f12基因甲基化检测试剂包含引物探针组合1：含seq id no:7的正向引物，含seq id no:10的反向引物，和含seq id no:13的探针。
16.10.根据项1-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述f12基因甲基化检测试剂包含引物探针组合2：含seq id no:8的正向引物，含seq id no:11的反向引物，和含seq id no:14的探针。
17.11.根据项1-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述f12基因甲基化检测试剂包含引物探针组合3：含seq id no:9的正向引物，含seq id no:12的反向引物，和含seq id no:15的探针。
18.12.根据项1-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述f12基因甲基化检测试剂包含引物探针组合4：含seq id no:1的正向引物，含seq id no:2的反向引物，和含seq id no:3的探针。
19.13.根据项2-12任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述血浆游离核酸为血浆游离dna。
20.14.根据项1-13任一项所述的试剂盒，其特征在于，用b2m基因作为内参基因。
21.15.根据项1-14任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述肝癌为早期肝癌。
22.16.根据项2-15任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包含游离核酸提取试剂，所述游离核酸提取试剂通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。
23.17.一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包含对样本中f12基因甲基化的检测。
24.18.根据项17所述的方法，其特征在于，所述样本中的f12基因是由f12基因产生的血浆游离核酸。
25.19.根据项17或18所述的方法，其特征在于，所述方法包含在甲基化检测之前对核酸进行亚硫酸盐转化。
26.20.根据项17-19任一项所述的方法，其特征在于，所述方法检测的甲基化序列区段包含与seq id no:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
27.21.根据项17-20任一项所述的方法，其特征在于，所述f12基因甲基化检测试剂包含至少一个正向引物，至少一个反向引物，和/或至少一个探针。
28.22.根据项21所述的方法，其特征在于，所述至少一个探针包含选自含seq id no:3,13-15任一个的探针。
29.23.根据项21或22所述的方法，其特征在于，所述至少一个正向引物和/或至少一个反向引物包含选自含seq id no:1-2,7-12任一个的引物。
30.24.根据项17-23任一项所述的方法，其特征在于，所述对样本中f12基因甲基化的检测包含用选自含seq id no:7-9任一个的正向引物，选自含seq id no:10-12任一个的反向引物，和/或选自含seq id no:13-15任一个的探针进行pcr检测。
31.25.根据项17-24任一项所述的方法，其特征在于，所述对样本中f12基因甲基化的检测包含用引物探针组合1：含seq id no:7的正向引物，含seq id no:10的反向引物，和含seq id no:13的探针进行pcr检测。
32.26.根据项17-24任一项所述的方法，其特征在于，所述对样本中f12基因甲基化的检测包含用引物探针组合2：含seq id no:8的正向引物，含seq id no:11的反向引物，和含seq id no:14的探针进行pcr检测。
33.27.根据项17-24任一项所述的方法，其特征在于，所述对样本中f12基因甲基化的检测包含用引物探针组合3：含seq id no:9的正向引物，含seq id no:12的反向引物，和含seq id no:15的探针进行pcr检测。
34.28.根据项17-23任一项所述的方法，其特征在于，所述对样本中f12基因甲基化的检测包含用引物探针组合4：含seq id no:1的正向引物，含seq id no:2的反向引物，和含seq id no:3的探针进行pcr检测。
35.29.根据项18-28任一项所述的方法，其特征在于，所述血浆游离核酸为血浆游离dna。
36.30.根据项17-29任一项所述的方法，其特征在于，用b2m基因作为内参基因。
37.31.根据项17-30任一项所述的方法，其特征在于，所述肝癌为早期肝癌。
38.32.根据项17-31任一项所述的方法，其特征在于，在甲基化检测pcr步骤后，对样本的ct值进行统计。如果ct≤阈值，则样本为为肝癌阳性；如果ct》阈值，则样本为肝癌阴性。
39.33.根据项32所述的方法，其特征在于，所述样本为血浆样本，针对引物探针组合1，所述阈值为34.25-38.25，优选地，所述阈值为35.25-37.25，更优选地，所述阈值为36.25；针对引物探针组合2，所述阈值为33.14-37.14，优选地，所述阈值为34.14-36.14，更优选地，所述阈值为35.14；针对引物探针组合3，所述阈值为34.40-38.40，优选地，所述阈值为35.40-37.40，更优选地，所述阈值为36.40。
附图说明
40.图1为实施例1中f12靶标序列在hepg2、huh-7、ht-29和heh-2四种细胞dna的甲基化测序峰图。
41.图2为实施例2中利用本发明的f12三组引物探针检测6种不同器官来源组织样本所得ct值统计图。
42.图3为实施例3中本发明的三组f12引物探针检测体系的灵敏度扩增曲线。
43.图4为实施例4中利用f12三组引物探针检测400例临床血浆样本所得roc曲线图。
44.发明详述
45.本发明的目的：为解决现有早期肝癌诊断技术中存在的灵敏度低的不足之处，本发明提供了一种f12(凝血因子xii,coagulation factor xii)基因甲基化区域检测产品，以及f12甲基化区域在制备肝癌筛查及诊断试剂或试剂盒中的应用。在一些实施例中，其产品包含用于检测f12基因甲基化区域的引物、探针、检测试剂及试剂盒。在一些实施例中，通过从血浆样本中提取、转化dna，并利用荧光定量pcr技术检测f12基因甲基化水平，从而判断待检个体是否患有肝癌。本方法安全、无创，且具有较高的灵敏度和特异性，能够有效地用于肝癌早期诊断。
46.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
47.本发明提供了一种用于早期肝癌诊断的核酸标志物，包括f12目标序列甲基化程度。
48.在一些实施例中，f12基因的甲基化序列如下：
49.seq id no.4:gttgtgcctaccctmcgaactggtggccccagcmcggccacctggcagagmcgtggtctmcggagggtmcgmcgmcggmcgcmcgcttggcaggcacacmcggctgaamcgtaaggmcgacaggagmcgmcgcagctgcmcgtcmcgcatcctcctgaaggmcgcaacagagctaaccmcgggmcggagaggagmcgtgaggmcggggamcgcmcggggccccaagctctcttccmcgtcccmcgmcggggmcgcccccamcgcacccaggtmcgtgctggtagctgamcgggmcgagaaggcctmcgtg
50.m
cg表示cpg岛的c可以发生或发生了甲基化修饰。
51.在一些实施例中，f12基因甲基化序列包含与seq id no:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
52.在一些实施例中，用于f12甲基化标记检测的引物包括f12正向引物和反向引物。
53.在一些实施例中，f12正向引物包括以下的一个或多个序列：
54.seq id no.7：ttggtagagcgtggtttcgg
55.seq id no.8：cgtttggtaggtatatcggttg
56.seq id no.9：ggacgtcggggttttaagtt
57.在一些实施例中，f12反向引物包括以下的一个或多个序列：
58.seq id no.10：cgccttacgttcaaccgata
59.seq id no.11：cgccttcaaaaaaatacgaacgac
60.seq id no.12：gtcaactaccaacacgacct
61.在一些实施例中，f12探针包括以下的一个或多个序列：
62.seq id no.13：5’rox-tcgcgcggcgtcgtttg-3’bhq2
63.seq id no.14：5’rox-acgtaaggcgataggagcgcgta-3’bhq2
64.seq id no.15：5’rox-ttttcgttttcgcggggcgtttt-3’bhq2
65.在一些实施例中，所述的内参基因为b2m。在一些实施例中，用于内参基因检测的引物包括b2m正向引物和b2m反向引物。
66.在一些实施例中，b2m正向引物包括：
67.seq id no.16：gtaggtttgggtaattttaaatagtgga
68.在一些实施例中，b2m反向引物包括：
69.seq id no.17：ttctttcaaaatatcatcccccaat
70.在一些实施例中，b2m探针包括：
71.seq id no.18：ttcctacaaatcttcccccaaacacc
72.在一些实施例中，上述任一所述探针5’端均携带荧光基团，3’端均携带淬灭基团。在一些实施例中，所述荧光基团可为rox或cy5基团，对应的淬灭基团为bhq1标记或bhq2标记。
73.根据本发明的另一方面，本发明提供了用于检测f12甲基化水平的试剂盒。
74.在一些实施例中，本发明所述的f12甲基化检测试剂盒包括dna聚合酶、mgcl2、dntp、聚合酶缓冲液、f12甲基化检测引物、f12甲基化检测探针。在一些实施例中，所述检测试剂还包括内参b2m检测引物、内参b2m检测探针、阳性质控品和阴性质控品。在一些实施例中，所述的检测试剂还包括dna亚硫酸氢盐转化试剂。
75.在一些实施例中，进行一次甲基化标记检测反应时，dna聚合酶的终浓度为1-2u/反应，聚合酶缓冲液的终浓度为1-2x/反应，mgcl2的终浓度为2-4mm，dntp的终浓度为0.1-0.5mm，f12基因检测引物的终浓度为0.1-0.6μm、f12基因检测探针的终浓度为0.05-0.3μm、b2m基因检测引物的终浓度为0.1-0.6μm，b2m基因检测探针的终浓度为0.05-0.3μm。
76.本发明的检测试剂盒所检测的样本可选自组织、全血、血浆、血清、尿液和粪便。作为优选的实施方式，所述的样本选自组织、全血、血浆和血清；更优选地，所述样本选自全血或血浆。
77.另一方面，本发明还提供了一种针对f12甲基化区域的检测方法，在一些实施例中，所述使用方法包括以下步骤：
78.(1)提取临床样本的dna。样本若为组织，则使用组织dna提取试剂盒进行基因组dna提取；样本若为血浆，则使用血浆游离dna提取试剂盒进行cfdna提取。
79.(2)使用dna转化试剂盒对提取的组织dna或血浆cfdna进行亚硫酸氢盐转化及纯化，得到转化后的dna。
80.(3)以完成步骤(2)的组织dna或血浆cfdna为模板，利用上述f12甲基化检测试剂或试剂盒对内参b2m和靶标f12进行荧光定量pcr检测，并获得内参和靶标对应的ct值，若内参或靶标检测结果为undetermined，则ct值记为45。
81.(4)结果分析及判定：先判断检测结果是否有效，若内参b2m的ct值≥35则结果无效，应重新检测；若内参b2m的ct值≤35则结果有效，可进行下一步的阴阳性判断。之后统计靶标f12的ct值。如果ct≤阈值，则结果为甲基化阳性，即已检测的组织或血浆为肝癌阳性样本；如果ct》阈值，则结果为甲基化阴性，即已检测的组织或血浆为肝癌阴性样本。
82.在一些实施例中，所述肝癌包括早期肝癌。
83.在一些实施例中，肝癌分期采用巴塞罗那肝癌临床分期系统(barcelona clinic liver cancer(bclc)，见下方表a)。在一些实施例中，所述早期肝癌包括巴塞罗那分期的a期。在一些实施例中，所述早期肝癌包括巴塞罗那分期的0期和a期。
84.表a：巴塞罗那肝癌临床分期
[0085][0086]
在一些实施例中，肝癌分期采用中国肝癌的分期方案(china liver cancer staging，cnlc)，包括：cnlcia期、ib期、ⅱa期、ⅱb期、iiia期、iiib期、ⅳ期，具体如下：
[0087]
cnlcia期：体力活动状态(performance status，ps)评分0～2分，肝功能child-pugh a/b级，单个肿瘤、直径≤5cm，无血管侵犯和肝外转移。
[0088]
cnlcib期：ps 0～2分，肝功能child-pugh a/b级，单个肿瘤、直径＞5cm，或2～3个肿瘤、最大直径≤3cm，无血管侵犯和肝外转移。
[0089]
cnlcⅱa期：ps 0～2分，肝功能child-pugh a/b级，2～3个肿瘤、最大直径＞3cm，无血管侵犯和肝外转移。
[0090]
cnlcⅱb期：ps 0～2分，肝功能child-pugh a/b级，肿瘤数目≥4个、肿瘤直径不论，无血管侵犯和肝外转移。
[0091]
cnlciiia期：ps 0～2分，肝功能child-pugh a/b级，肿瘤情况不论、有血管侵犯而无肝外转移。
[0092]
cnlciiib期：ps 0～2分，肝功能child-pugh a/b级，肿瘤情况不论、血管侵犯不论、有肝外转移。
[0093]
cnlcⅳ期：ps 3～4，或肝功能child-pugh c级，肿瘤情况不论、血管侵犯不论、肝外转移不论。
[0094]
在一些实施例中，所述早期肝癌包括中国肝癌分期(cnlc)的ia期。在一些实施例中，所述早期肝癌包括中国肝癌分期(cnlc)的ib期。在一些实施例中，所述早期肝癌包括中国肝癌分期(cnlc)的ia期和ib期。
[0095]
在一些实施例中，所述试剂盒包含游离核酸提取试剂。在一些实施例中，所述游离核酸提取试剂通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。
[0096]
在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离dna。在一些实施例中，所述试剂盒包含dna亚硫酸盐转化试剂。在一些实施例中，所述dna亚硫酸盐转化试剂用于将血浆cfdna进行亚硫酸盐转化，用于后续的甲基化标记基因检测。在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离rna。
[0097]
在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化f12的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化f12的单位浓度/含量比正常样本中的甲基化f12高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
[0098]
在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化f12的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化f12的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本中的甲基化f12高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
[0099]
本发明的优点包括但不限于：本发明利用针对f12基因甲基化的检测试剂盒，可有效应用于肝癌的早期筛查和诊断。该试剂盒及其对应的检测方法具有较高的分析灵敏度和分析特异性，能够准确检出低至0.05ng的f12甲基化阳性基因组dna，且检测10ng l的f12甲基化阴性基因组dna也不出现假阳性结果。本发明可从待检个体的少量外周血样本中进行dna甲基化检测，该检测方法无创，不会给待检者带来痛苦。对于临床性能，f12基因甲基化标记在血浆样本中能达到78.5-83.5％的灵敏度和79-83％的特异性，其性能高于常规的afp血清学检测。另外，本发明通过实时荧光定量pcr技术进行甲基化标记检测，该方法及对应的检测试剂盒能准确且便捷地完成肝癌诊断，相比起二代测序技术，本发明的检测流程可在一天内完成，这可有效缩短检测周期，并且降低成本。总之，本发明具有重要的应用价值和商业价值。
具体实施例
[0100]
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体介绍。具体实施例不代表对本发明保护范围的限制，其他人根据本发明理念所作出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
[0101]
实施例1：f12在不同细胞系dna中的甲基化水平比较
[0102]
本发明的发明人基于tcga、geo数据库中不同癌种的癌旁组织与健康人群全血甲基化芯片数据分析结果，筛选出肝(癌旁)组织特异性高甲基化的f12作为肝组织特异性甲基化候选标记。由于甲基化芯片主要检测某一段包含若干cpg岛的序列在样本中的平均甲基化水平，为确定适合设计检测引物探针的甲基化位点，发明人采用甲基化一代测序方法对上述靶标基因的目标cpg位点逐一进行甲基化水平验证。
[0103]
根据甲基化芯片分析结果，设计f12候选区域的扩增及测序引物，具体引物信息如下：
[0104]
f12扩增引物及测序引物包括：
[0105]
seq id no.1f12引物f：atttttgtttttagtagttgtgtttatttt
[0106]
seq id no.2f12引物r：aaaacaaaaaacttccccaaaac
[0107]
seq id no.3f12测序引物：gaattggtggttttagt
[0108]
样本信息：
[0109]
8种培养好的细胞系，分别为hepg2(人肝癌细胞系)、huh-7(人肝癌细胞系)、ht-29(人结肠癌细胞系)、ags(人胃癌细胞系)、pc-3(人前列腺癌细胞系)、t24(人膀胱癌细胞系)、heh-2(人胚胎心肌细胞)和jurkat(人t细胞白血病细胞)。
[0110]
实验过程：
[0111]
(1)收集培养好的悬浮细胞(每株约1x 106细胞)，用1x pbs溶液洗涤一遍。采用天根的tianamp genomic dna kit(货号dp304)提取细胞基因组dna。
[0112]
(2)将提取的细胞gdna溶液用nanodrop分光光度计检测浓度，确保每份gdna样本浓度不低于20ng/μl。
[0113]
(3)采用zymo research的ez dna methylation-gold
tm kit(货号d5005)对提取的细胞gdna进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份样本用于转化的量在200-500mg之间。
[0114]
(4)将takara epitaq
tm hs(货号r110)和引物等pcr试剂从-20℃取出，室温解冻。根据表1配制pcr反应体系，轻轻吹打混匀。
[0115]
表1配液体系
[0116]
序号组分体积/反应终浓度110x epitaq pcr缓冲液2.5μl1x225mm mgcl22.5 μl2.5mm3dntp混合物(各2.5mm)3μl各0.3mm4引物f(10μm)1μl0.4μm5引物r(10μm)1μl0.4μm6epitaq
tm hs(5u/μl)0.2μl1u/反应7超纯水12.8μl/8亚硫酸氢盐处理后的dna2μl/9总共25μl/
[0117]
(5)向每个pcr管中加入23μl混好的pcr反应液，然后加入2μl亚硫酸氢盐处理后的dna，混匀后按照表2的反应程序进行扩增。
[0118]
表2 pcr反应过程
[0119][0120][0121]
(6)将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下含有f12目的产物的胶块，送至测序公司进行一代测序验证。
[0122]
结果分析：
[0123]
根据一代测序结果对应的测序峰图，分别估算测序区域里各cpg位点在不同细胞dna中的甲基化水平，并对各位点的甲基化水平(高或低)进行定量分析。f12目标区域在不同细胞甲基化测序的峰图如图1所示。部分位点测序分析结果如表3所示。
[0124]
表3 f12在不同细胞dna中的sanger测序结果
[0125][0126]
从结果推断，f12靶标区域仅在肝组织来源的细胞系出现高甲基化，而在其它组织和器官来源的细胞系中均出现低甲基化，故f12具有组织特异性甲基化的特征，具有作为组织特异性甲基化标志物的潜能。
[0127]
实施例2：f12甲基化的组织特异性研究
[0128]
由于实施例1中选用的细胞系大多为癌细胞，相比与未发生癌变的细胞，癌细胞本身可能在基因组部分区域已经发生异常甲基化。所以本发明实验过程中针对f12基因启动子区序列中发现的若干cpg位点，设计了3对引物探针组合进行后续荧光定量pcr验证。验证的对象为不同器官来源的组织dna样本。表4列出了本发明实验过程中选用的f12基因目的区域。
[0129]
表4 f12基因目的区域的序列
[0130][0131]
所述f12正向引物包括：
[0132]
seq id no.7f12-f1：ttggtagagcgtggtttcgg
[0133]
seq id no.8f12-f2：cgtttggtaggtatatcggttg
[0134]
seq id no.9f12-f3：ggacgtcggggttttaagtt
[0135]
所述f12反向引物包括：
[0136]
seq id no.10f12-r1：cgccttacgttcaaccgata
[0137]
seq id no.11f12-r2：cgccttcaaaaaaatacgaacgac
[0138]
seq id no.12f12-r3：gtcaactaccaacacgacct
[0139]
所述f12探针包括：
[0140]
seq id no.13f12-p1：5’rox-tcgcgcggcgtcgtttg-3’bhq2
[0141]
seq id no.14f12-p2：5’rox-acgtaaggcgataggagcgcgta-3’bhq2
[0142]
seq id no.15f12-p3：5’rox-ttttcgttttcgcggggcgtttt-3’bhq2
[0143]
引物探针组合1：正向引物序列：seq id no.7；反向引物序列：seq id no.10；探针序列：seq id no.13。
[0144]
引物探针组合2：正向引物序列：seq id no.8；反向引物序列：seq id no.11；探针序列：seq id no.14。
[0145]
引物探针组合3：正向引物序列：seq id no.9；反向引物序列：seq id no.12；探针
序列：seq id no.15。
[0146]
另外，对于pcr内部质控，用b2m基因作为内参，并针对其对应的亚硫酸氢盐转化后目的序列设计内控引物探针。内控检测引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本dna检测结果出现明显的s形扩增曲线，而非模板体系(如水对照)检测结果扩增曲线不起峰。
[0147]
b2m内参基因的检测引物和探针分别为：
[0148]
seq id no.16b2m-f：gtaggtttgggtaattttaaatagtgga
[0149]
seq id no.17b2m-r：ttctttcaaaatatcatcccccaat
[0150]
seq id no.18b2m-p：5’cy5-ttcctacaaatcttcccccaaacacc-3’bhq2
[0151]
样本信息：
[0152]
来自不同器官的组织或细胞共48例。其中肝组织8例，均为手术切除的癌旁组织；胃组织8例，均为用于活检的胃粘膜；结肠组织8例，均为手术切除的肠息肉；子宫颈组织8例，均为手术切除的宫颈癌旁组织；肺组织8例，均为手术切除的肺结节；血液细胞8例，均为血液离心后分离的白细胞。
[0153]
实验过程：
[0154]
(1)收集不同器官来源的组织样本，采用天根的tianamp genomic dna kit(货号dp304)提取组织样本gdna。
[0155]
(2)将提取的组织gdna溶液用nanodrop分光光度计检测浓度，并用1x te溶液稀释至10ng/μl。
[0156]
(3)取20μl稀释后的gdna溶液，采用zymo research的dna转化试剂盒(ez dna methylation-gold
tm kit，货号d5005)对提取的gdna进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份转化的dna用20μl洗脱液洗脱。
[0157]
(4)利用荧光定量pcr检测转化后组织dna中f12甲基化水平。配制pcr检测反应体系，反应体系成分及含量如表5所示。
[0158]
表5组织dna甲基化定量pcr配液体系
[0159]
序号组分体积/反应终浓度110x pcr缓冲液2μl1x250mm mgcl21 μl2.5mm3dntp混合物(10mm)0.4 μl0.2mm4b2m正向引物(10μm)0.6μl0.3μm5b2m反向引物(10μm)0.6μl0.3μm6b2m探针(10μm)0.2μl0.1μm7f12正向引物(10μm)0.6μl0.3μm8f12反向引物(10μm)0.6μl0.3μm9f12探针(10μm)0.3μl0.15μm10taq酶(5u/μl)0.2μl1u/反应11超纯水11.5μl/12亚硫酸氢盐处理后的dna2μl/ 总共20μl/
[0160]
荧光定量pcr扩增反应条件如表6所示。
[0161]
表6 pcr反应过程
[0162][0163]
(5)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，rox通道的阈值线设为50000，cy5通道的阈值线设为20000，得到内参基因和靶基因的ct值。
[0164]
结果分析：
[0165]
首先进行样本pcr结果有效性判定，若样本内参b2m对应的cy5通道有明显的扩增曲线且ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参b2m对应的cy5通道无扩增曲线有扩增曲线且ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的48例组织样本，其内参b2m对应的cy5通道均有明显的扩增曲线，且ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
[0166]
使用本发明的三组f12引物探针对，检测6种组织dna的ct值散点图如图2所示。结果显示，f12甲基化靶标在肝组织dna中检测的ct值均小于35，而其它组织dna检测的f12靶标ct值均大于35，其中血液、胃、子宫颈、肺组织样本大部分未检出f12靶标，说明f12靶标区域在肝组织dna中高甲基化，在其它组织dna中未发生甲基化或者甲基化水平非常低。
[0167]
实施例3f12甲基化靶标的分析灵敏度验证
[0168]
血浆中含有少量的游离dna(cfdna)，这些cfdna来源于机体中不同组织，它们通过细胞凋亡、细胞坏死或细胞外分泌作用释放到血液中。健康人的cfdna在人体内的浓度约为10ng/ml，其肝组织来源的cfdna约占总cfdna的1-2％。由于cfdna半衰期短(0.5-2h)，容易发生降解，故需要确保f12甲基化靶标的检出限小于1％。本发明人通过下列实验评估三组f12引物探针组合在10ng阴性模板dna背景下，对f12阳性靶标的最低检出限。
[0169]
各基因检测引物探针如下：
[0170]
f12正向引物包括：
[0171]
seq id no.7f12-f1：ttggtagagcgtggtttcgg
[0172]
seq id no.8f12-f2：cgtttggtaggtatatcggttg
[0173]
seq id no.9f12-f3：ggacgtcggggttttaagtt
[0174]
f12反向引物包括：
[0175]
seq id no.10f12-r1：cgccttacgttcaaccgata
[0176]
seq id no.11f12-r2：cgccttcaaaaaaatacgaacgac
[0177]
seq id no.12f12-r3：gtcaactaccaacacgacct
[0178]
f12探针包括：
[0179]
seq id no.13f12-p1：5’rox-tcgcgcggcgtcgtttg-3’bhq2
[0180]
seq id no.14f12-p2：5’rox-acgtaaggcgataggagcgcgta-3’bhq2
[0181]
seq id no.15f12-p3：5’rox-ttttcgttttcgcggggcgtttt-3’bhq2
[0182]
引物探针组合1：正向引物序列：seq id no.7；反向引物序列：seq id no.10；探针序列：seq id no.13。
[0183]
引物探针组合2：正向引物序列：seq id no.8；反向引物序列：seq id no.11；探针序列：seq id no.14。
[0184]
引物探针组合3：正向引物序列：seq id no.9；反向引物序列：seq id no.12；探针序列：seq id no.15。
[0185]
另外，对于pcr内部质控，用b2m基因作为内参，并针对其对应的亚硫酸氢盐转化后目的序列设计内控引物探针。内控检测引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本dna检测结果出现明显的s形扩增曲线，而非模板体系(如水对照)检测结果扩增曲线不起峰。
[0186]
b2m内参基因的检测引物和探针分别为：
[0187]
seq id no.16b2m-f：gtaggtttgggtaattttaaatagtgga
[0188]
seq id no.17b2m-r：ttctttcaaaatatcatcccccaat
[0189]
seq id no.18b2m-p：5’cy5-ttcctacaaatcttcccccaaacacc-3’bhq2
[0190]
实验过程：
[0191]
(1)取一支人白细胞dna和一支huh-7肝癌细胞系dna，其中白细胞dna经鉴定为f12靶标甲基化阴性，huh-7肝癌细胞系dna经鉴定为f12靶标甲基化阳性。将两支dna分别稀释到10ng/μl。
[0192]
(2)以白细胞dna作为阴性背景，huh-7肝癌细胞系dna作为阳性模板，配制4种比例的阳性对照品。4种阳性对照品的dna总浓度均为2ng/μl，而含f12甲基化阳性dna的比例分别为5％、1％、0.5％、0.25，分别命名为5％pc、1％pc、0.5％pc和0.25％pc。
[0193]
(3)上述不同比例的阳性对照品均分装为20μl/管，随后用zymo research的dna转化试剂盒(ez dna methylation-gold
tm kit，货号d5005)对提取的gdna进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份转化的dna用20μl洗脱液洗脱。
[0194]
(4)利用荧光定量pcr检测不同比例阳性对照品的f12甲基化水平，每种比例的阳性对照品均做12个复孔。反应体系成分及含量如表7所示。
[0195]
表7f12甲基化定量pcr配液体系
[0196]
[0197][0198]
荧光定量pcr扩增反应条件如表6所示。
[0199]
(5)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，rox通道的阈值线设为50000，cy5通道的阈值线设为20000，得到内参基因和靶基因的ct值。
[0200]
结果分析：
[0201]
首先进行样本pcr结果有效性判定，若样本内参b2m对应的cy5通道有明显的扩增曲线且ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参b2m对应的cy5通道无扩增曲线有扩增曲线且ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的不同比例阴阳性对照品，其内参b2m对应的cy5通道均有明显的扩增曲线，且ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
[0202]
使用本发明的三组f12引物探针对，检测5％pc、1％pc、0.5％pc和0.25％pc四种阳性对照品的荧光曲线示意图如图3所示。具体的阳性检出比例如表8所示。
[0203]
表8不同阳性对照品的f12甲基化靶标阳性检出比例
[0204]
模板引物探针组合1引物探针组合2引物探针组合35％pc12/1212/1212/121％pc12/1212/1212/120.5％pc11/1211/1212/120.25％pc9/127/129/12
[0205]
结果显示，三组f12甲基化靶标检测引物探针组合能检出全部的5％pc和1％pc模板，而0.5％pc模板的检测结果中，每组未检出的反应孔也不超过一个。这说明f12三组引物探针组合对靶标的阳性检出限均在1％之内，符合cfdna样本检测的分析性能要求。
[0206]
实施例4：f12在血浆cfdna中的检测
[0207]
肝癌患者的血液可能含有更多来源于肝组织的cfdna，这是因为一方面，肝癌细胞的增殖、凋亡与坏死较正常细胞更为频繁；另一方面，癌变会导致肝部出现一定损伤，导致一些来源于正常肝细胞的dna也释放到血液中。因此f12的组织特异甲基化标记区域具有肝癌诊断的潜能，可通过血浆分离、cfdna提取、转化和pcr扩增，进而对肝组织来源的cfdna进行定量分析，实现肝癌早筛早诊。
[0208]
为了验证血浆cfdna中f12甲基化标记能用于早期肝癌检测，本发明人通过下列实验评估f12甲基化标记在肝癌与非肝癌临床血浆样本中的检测效果。
[0209]
各基因检测引物探针如下：
[0210]
f12正向引物包括：
[0211]
seq id no.7f12-f1：ttggtagagcgtggtttcgg
[0212]
seq id no.8f12-f2：cgtttggtaggtatatcggttg
[0213]
seq id no.9f12-f3：ggacgtcggggttttaagtt
[0214]
f12反向引物包括：
[0215]
seq id no.10f12-r1：cgccttacgttcaaccgata
[0216]
seq id no.11f12-r2：cgccttcaaaaaaatacgaacgac
[0217]
seq id no.12f12-r3：gtcaactaccaacacgacct
[0218]
f12探针包括：
[0219]
seq id no.13f12-p1：5’rox-tcgcgcggcgtcgtttg-3’bhq2
[0220]
seq id no.14f12-p2：5’rox-acgtaaggcgataggagcgcgta-3’bhq2
[0221]
seq id no.15f12-p3：5’rox-ttttcgttttcgcggggcgtttt-3’bhq2
[0222]
引物探针组合1：正向引物序列：seq id no.7；反向引物序列：seq id no.10；探针序列：seq id no.13。
[0223]
引物探针组合2：正向引物序列：seq id no.8；反向引物序列：seq id no.11；探针序列：seq id no.14。
[0224]
引物探针组合3：正向引物序列：seq id no.9；反向引物序列：seq id no.12；探针序列：seq id no.15。
[0225]
另外，对于pcr内部质控，用b2m基因作为内参，并针对其对应的亚硫酸氢盐转化后目的序列设计内控引物探针。内控检测引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本dna检测结果出现明显的s形扩增曲线，而非模板体系(如水对照)检测结果扩增曲线不起峰。
[0226]
b2m内参基因的检测引物和探针分别为：
[0227]
seq id no.16b2m-f：gtaggtttgggtaattttaaatagtgga
[0228]
seq id no.17b2m-r：ttctttcaaaatatcatcccccaat
[0229]
seq id no.18b2m-p：5’cy5-ttcctacaaatcttcccccaaacacc-3’bhq2样本信息：
[0230]
400例血浆样本，包括200例肝癌患者样本和200例非肝癌对照样本，200例对照组样本中包含健康人样本30例，乙肝患者样本100例，肝硬化患者70例。
[0231]
实验过程：
[0232]
(1)收集肝癌患者及对照人群的血浆样本，使用天根的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(货号dp710)提取血浆游离dna(每例血浆样本取1ml用于cfdna提取)。
[0233]
(2)使用zymo research的dna转化试剂盒(ez dna methylation-gold
tm kit，货号d5005)对提取的游离dna进行亚硫酸氢盐转化及纯化，得到转化后的cfdna。
[0234]
(3)利用荧光定量pcr检测转化后cfdna中f12甲基化水平。配制pcr检测反应体系，反应体系成分及含量如表9所示。
[0235]
表9cfdna甲基化定量pcr配液体系
[0236]
序号组分体积/反应终浓度110x pcr缓冲液3μl1x250mm mgcl21.5 μl2.5mm3dntp混合物(10mm)0.6 μl0.2mm4b2m正向引物(10μm)0.9μl0.3μm5b2m反向引物(10μm)0.9μl0.3μm6b2m探针(10μm)0.3μl0.1μm7f12正向引物(10μm)0.9μl0.3μm8f12反向引物(10μm)0.9μl0.3μm
9f12探针(10μm)0.45μl0.15μm10taq酶(5u/μl)0.3μl1u/反应11超纯水15.35μl/12转化后的cfdna5μl/ 总共30μl/
[0237]
荧光定量pcr扩增反应条件如表6所示。
[0238]
(4)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，rox通道的阈值线设为50000，cy5通道的阈值线设为20000，得到内参基因和靶基因的ct值。
[0239]
结果判定：
[0240]
首先进行样本pcr结果有效性判定，若样本内参b2m对应的cy5通道有明显的扩增曲线且ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参b2m对应的cy5通道无扩增曲线有扩增曲线且ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的400例血浆样本，其内参b2m对应的cy5通道均有明显的扩增曲线，且ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
[0241]
利用roc曲线对3组f12引物探针组合的400例血样本检测结果进行分析，其中ct值为检验变量，病理结果为状态变量，计算出的约登指数(灵敏度 特异性-1)最大值对应的ct即为cutoff值。若样本ct≤cutoff值则结果为甲基化阳性；反之，若样本ct》cutoff值则结果为甲基化阴性。
[0242]
三组f12甲基化检测引物探针区分肝癌患者与对照人群血浆样本的性能(auc值、灵敏度、特异性、cutoff值)分析如表10和图4所示：
[0243]
表10血浆样本检测性能对比
[0244]
性能引物探针组合1引物探针组合2引物探针组合3auc值0.8800.9040.864cutoff值(ct)36.2535.1436.40灵敏度83.5％84.0％78.5％特异性79.0％80.0％83.0％约登指数0.6250.6400.615
[0245]
400例肝癌患者/对照人群血浆样本的检测结果显示，在特异性约79-83％的情况下，f12甲基化标记的检测灵敏度在78.5-84％之间。其对肝癌的检测灵敏度高于现行的afp血清学检测方法。故本发明的f12甲基化检测产品可作为一种补充技术用于肝癌的早期筛查和辅助诊断。
[0246]
综合实施例1-4，本发明通过检测f12基因启动子区的一段dna序列甲基化水平，可有效鉴别血浆中来源于肝组织的cfdna。利用其组织溯源和定量分析性能，f12甲基化标记及其对应的检测试剂盒、检测方法既能单独应用，也能与其它核酸靶标与蛋白靶标联合地应用与肝癌高危人群的筛查与辅助诊断。
[0247]
尽管在本技术中已经将权利要求阐述为特征的特定组合，但应该理解的是，本公开的范围还包括本文明确或隐含地公开的任何新颖特征或任何新颖特征组合或其任何概括，无论它是否涉及与任何权利要求中目前要求保护的相同的发明，并且无论它是否减轻了与本发明相同的技术问题中的任何一个或全部问题。申请人在此提供通知，在本技术或
由此衍生的任何进一步申请的审查期间，新的权利要求可以被制定为这样的特征和/或特征的组合。
[0248]
尽管已经示出和描述了一些实施例，但是本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的原理的情况下可以对这些实施例进行改变，本发明的范围在权利要求中限定。
[0249]
本领域技术人员会理解，在不脱离本发明的全部范围和精神的情况下，可对本技术描述的部件、方法、步骤、结构、运动、配合进行修改(添加和/或去除)，本发明的范围和精神涵盖这样的修改以及其任何和全部等同物。