一种抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体及其用途的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体及其用途。


背景技术：

2.醋酸氟孕酮（flurogestone acetate，简称fga，cas号为2529-45-5）分子式为c
23h31
fo5，无气味结晶，熔点267.5℃，是一种人工合成的甾体类药物。醋酸氟孕酮在临床上主要用作孕激素药物，用于动物尤其是羊的生育调节，同时兼具糖皮质激素药物活性，具有提高饲料转化率、促进畜禽生长的功能。醋酸氟孕酮进入动物体后，大部分可以代谢排出体外，一小部分会以原药或代谢残留物留在动物的组织中。排泄物中所含的激素会造成环境污染，动物组织被人类食用后，对人类造成伤害。
3.国内外严格限制醋酸氟孕酮的使用，欧盟规定绵阳及山羊奶中醋酸氟孕酮的最高残留量为1μg/kg，肌肉、脂肪、肝脏、肾脏中的最高残留限量为0.5μg/kg。目前醋酸氟孕酮检测多采用高效液相色谱法（hplc）、液相色谱与质谱联用法（lcms）、气质联用法（gc-ms）等。仪器法进行定量分析具有较低的检测限，但是仪器操作复杂，费用昂贵，无法达到现场规模快速检测的要求。


技术实现要素：

4.为此，本发明提供一种抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体及其用途。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明是实施例提供抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或抗原结合部分含有vh的重链可变区和v
l
轻链可变区，所述vh和v
l
均由抗原决定簇互补区和框架区组成；所述vh的cdr1的氨基酸序列如seq id no.1 的第50-56位所示；所述vh的cdr2的氨基酸序列如seq id no.1 的第76-92位所示；所述vh的cdr3的氨基酸序列如seq id no.1 的第125-134位所示；所述v
l
的cdr1的氨基酸序列如seq id no.2 的第60-76位所示；所述v
l
的cdr2的氨基酸序列如seq id no.2 的第92-98位所示；所述v
l
的cdr3的氨基酸序列如seq id no.2 的第131-138位所示。
6.本发明的一个实施例中，所述框架区来源于小鼠。
7.本发明的一个实施例中，所述vh的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述v
l
的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明的一个实施例中，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。
9.本发明的一个实施例中，所述抗体为如下任一种：（a）由上述任一所述的vh和上述任一所述的v
l
连接得到的单链抗体；（b）含有（a）所述单链抗体的融合抗体；（c）含有上述任一所述的vh和上述任一所述的v
l
的完整抗体；
（d）由杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。
10.本发明实施例还提供与上述所述的单克隆抗体或其抗原结合部分相关的生物材料，所述生物材料为如下任一种：（1）编码上述任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子；（2）含（1）所述核酸分子的表达盒；（3）含（1）所述核酸分子的重组载体；（4）含（2）所述表达盒的重组载体；（5）含（1）所述核酸分子的转基因动物细胞系；（6）含（1）所述核酸分子的微生物。
11.本发明的一个实施例中，上述（1）所述的核酸分子为编码上述任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的基因。
12.本发明的一个实施例中，所述基因为如下（a）或（b）所述的dna分子：（a）所述vh的cdr1的编码序列如seq id no.3的第148-168位所示，所述vh的cdr2的编码序列如seq id no.3的第226-276位所示，所述vh的cdr3的编码序列如seq id no.3的第373-402位所示，所述v
l
的cdr1的编码序列如seq id no.4的第178-228位所示，所述v
l
的cdr2的编码序列如seq id no.4的第274-294位所示，所述v
l
的cdr3的编码序列如seq id no.4的第391-414位所示；（b）与（a）限定的dna分子具有90%以上的同一性且编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分的dna。
13.本发明实施例还提供所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，或上述所述的生物材料在制备检测醋酸氟孕酮试剂或试剂盒中的应用。
14.本发明具有如下优点：本发明提供一种对醋酸氟孕酮具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体，为间接竞争elisa试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
15.试验证明：本发明的抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高等特点，可作为酶联免疫检测和胶体金免疫检测的原料。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
17.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
18.图1为本发明实施例提供的抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体轻链基因序列同源性比对图；
图2为本发明实施例提供的抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体轻链氨基酸序列同源性比对图；图3为本发明实施例提供的抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体重链基因序列同源性比对图；图4为本发明实施例提供的抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体重链氨基酸序列同源性比对图；图5为本发明实施例提供的采用间接竞争elisa方法检测抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体灵敏度和特异性的rida soft四参数法r2曲线图；图6为本发明实施例提供的采用间接竞争elisa方法检测抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体灵敏度和特异性的rida soft四参数法ic
50
曲线图；图7为本发明实施例提供的检测醋酸氟孕酮试纸条的结构示意图；图中：100-样品吸收垫；200-结合物释放垫；300-硝酸纤维素膜；310-检测线；320-质控线；400-吸水垫；500-底板。
具体实施方式
19.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1、抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体的制备本实施例提供一种抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：1、初次免疫将醋酸氟孕酮人工抗原弗氏完全佐剂乳化乳化（1:1），皮下注射6周龄的balb/c小鼠（购自北京维通利华试验动物技术有限公司），免疫剂量为500μg/只；从首次免疫开始，每4周加强免疫一次，共加强免疫2次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法与剂量同首次免疫；第2次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时，进行1次冲击免疫，即腹腔注射免疫原溶液0.5ml，三天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性孔。
21.利用有限稀释法对阳性孔进行克隆，得到并建立稳定分泌醋酸氟孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
22.2、单克隆抗体的制备细胞复苏：取出醋酸氟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
23.制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.8 ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞8
×
105个/只，10天后采集腹水。
24.用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体。
25.实施例2、抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体特异性及亚类鉴定1、醋酸氟孕酮单克隆抗体灵敏度和特异性检测采用间接竞争elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性，结果见下表1所示。以醋酸
氟孕酮各浓度（0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1 ng/ml）横坐标，以醋酸氟孕酮各浓度对应的od
450nm
值为纵坐标，使用rida soft四参数法绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（ic
50
），如图5和图6所示。
26.结果表明，使用四参数法拟合标准曲线，曲线r2=0.9999，使用splinen拟合，ic
50
=0.343ng/ml，方法检出限为0.1ng/ml；使用igg亚类检测试剂盒（美国sigma公司）检测醋酸氟孕酮单克隆抗体的亚类，结果显示醋酸氟孕酮单克隆抗体为igg
1（κ）
。
27.2、抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体轻链和重链可变区基因克隆（1）杂交瘤细胞培养及总rna提取用rpmi 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳培养杂交瘤细胞1
×
107。培养细胞总rna提取试剂盒试剂盒（购自天根）提取细胞总rna。
28.（2）cdna第一链的合成takara翻转录试剂盒（日本）合成cdna。
29.（3）基因扩增设计lambda链，kappa链，heavy链下游引物及上游通用引物。
30.引物：f:aagcagtggtatcaacgcagar
κ
:aacattgatgtctttggggtagaar
λ
:aatcgtacacaccagtgtgtgggrh:agggatccagagttccaggt以cdna第一链为模板进行pcr，反应体系50 μl。
31.pcr反应体系：模板 3μl，dntps 1μl，上下游引物（10 μm）各2.5μl，5
×
pcr buffer 10 μl，ddh2o 30.5 μl，taq酶（5 μ/μl） 0.5 μl。
32.pcr反应条件为：98℃ 30s；98℃ 15s，64℃-58℃ 30s，每次下降0.5℃，直到58℃，循环10次；72℃ 30s；98℃ 15s，56℃ 30s，72℃30s，循环15次；72℃ 7min。
33.（4）pcr扩增产物的克隆和筛选pcr产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用pcr产物回收试剂盒（北京天根）回收抗体kappa链，lambda链和heavy链片段，用plb零背景快速克隆试剂盒（北京天根）将该片段插入plb载体中，转化至dh5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆测序。
34.pcr产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示lambda链未见条带，heavy链核苷酸序列如seq id no.3所示，kappa链核苷酸序列如seq id no.4。
35.其中，vh的cdr1的编码序列如seq id no.3的第148-168位所示，vh的cdr2的编码序
列如seq id no.3的第226-276位所示，vh的cdr3的编码序列如seq id no.3的第373-402位所示，v
l
的cdr1的编码序列如seq id no.4的第178-228位所示，v
l
的cdr2的编码序列如seq id no.4的第274-294位所示，v
l
的cdr3的编码序列如seq id no.4的第391-414位所示。
36.（5）可变区氨基酸序列及同源性分析在ncbi数据库中进行比对分析，分析结果表明单克隆抗体轻链可变区基因与小鼠免疫球蛋白轻链可变区（sequence id:af321956.1）同源性最高，同源性为331/335，同源性百分比为99%，如图1所示。
37.抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列与小鼠mcg142167（sequence id:edk98900.1）同源性最高，同源性为120/122，同源性百分比为99%，如图2所示。
38.抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白重链可变区（sequence id:aj851868.3）同源性最高，同源性为296/326，同源性百分比为91%，如图3所示。
39.抗醋酸氟孕酮的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列与小鼠免疫球蛋白重链（sequence id:aao21964.1）同源性最高，同源性为112/124，同源性百分比为90%，如图4所示。编码醋酸氟孕酮单克隆抗体的轻链和重链可变区的基因序列和氨基酸序列同源性分析结果表明，未发现与本发明相同的序列。将轻链可变区和重链可变区序列，在https://www.novopro.cn/tools/cdr.html分析，得出其cdr区。
40.醋酸氟孕酮单克隆抗体重链氨基酸序列如seq id no.1所示，kappa链的氨基酸序列如seq id no.2所示。
41.其中，vh的cdr1的氨基酸序列如seq id no.1 的第50-56位所示；vh的cdr2的氨基酸序列如seq id no.1 的第76-92位所示；vh的cdr3的氨基酸序列如seq id no.1 的第125-134位所示。
[0042]vl
的cdr1的氨基酸序列如seq id no.2 的第60-76位所示；v
l
的cdr2的氨基酸序列如seq id no.2 的第92-98位所示；v
l
的cdr3的氨基酸序列如seq id no.2 的第131-138位所示。
[0043]
实施例3、醋酸氟孕酮胶体金检测试剂盒的制备如图7所示，本实施例提供醋酸氟孕酮胶体金检测试剂盒，该醋酸氟孕酮胶体金检测试剂盒包括检测试纸条，该检测试纸条是由底板500、样品吸收垫100、结合物释放垫200、硝酸纤维素膜300、吸水垫400、卡壳组成；其中， 样品吸收垫100、结合物释放垫200、硝酸纤维素膜300、吸水垫400依次按顺序粘贴在ps底板500上；结合物释放垫200从起始端有1/4区域被样品吸收垫100覆盖，结合物释放垫200的末端与硝酸纤维素膜300的始端连接，硝酸纤维素膜300的末端与吸水垫400的始端相连，样品吸收垫100的始端与ps底板500的始端对齐，吸水垫400的末端与ps底板500的末端对齐。
[0044]
硝酸纤维素膜300上有检测线310和质控线320，检测线t和质控线c均呈与试纸条的长相垂直的条状带；检测线310位于靠近结合物释放垫200的末端的一侧；质控线320位于远离结合物释放垫200的末端的一侧。将试纸条用机器切成4.05 mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。
[0045]
该醋酸氟孕酮胶体金检测试纸条的制备方法主要包括以下步骤：1)制备具有醋酸氟孕酮人工抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线的硝酸
纤维素膜；2)制备喷涂有胶体金标记的醋酸氟孕酮单克隆抗体的结合物释放垫；3)将样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上。
[0046]
4）装入卡壳中。
[0047]
试纸卡检测限的界定：使用完全不含有醋酸氟孕酮的羊奶为阴性样本，配制待测样本1（醋酸氟孕酮0.1 ppb），待测样本2（醋酸氟孕酮0.05 ppb），待测样本3（醋酸氟孕酮0 ppb）。用微量移液器吸取100
ꢀµ
l待测样本溶液于卡壳孔中，室温反应10分钟后即可判读结果，不超过20分钟。
[0048]
结果判定：阴性(－)：c线和t线均显色，t线显色远比c线强，表示样本中不含醋酸氟孕酮或远低于检出限。
[0049]
阳性(＋)：c线显色；t线显色与c线相同、t线显色比c线弱或者t线不显色，均表示样本醋酸氟孕酮浓度等于或高于检出限。
[0050]
无效：未出现c线，表明不正确的操作过程或试纸卡已变质失效。
[0051]
结果显示：待测样本1（醋酸氟孕酮0.1 ppb）为阳性，待测样本2（醋酸氟孕酮0.05 ppb）为阴性，待测样本3（醋酸氟孕酮0 ppb）为阴性。此结果表明试纸卡检测限为0.1 ppb。
[0052]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。