用于提高针对液体样本的核酸提取量的方法与流程

1.本公开涉及微生物分子生物学检测技术领域，更具体涉及用于提高针对液体样本的核酸提取量的方法。


背景技术：

2.临床液体样本(比如脑脊液、肺泡灌洗液、血清等)从采样到寄送到医学检验所进行核酸检测通常采用干冰运输或者使用保存液，而大多保存液要求加入量大于等于液体样本体积(比如保存液用2倍体积，或者等体积)，因此样本中的核酸相当于被稀释了。而样本进行核酸提取时加入裂解液的体积也很大，通常裂解液和其他液体加入的体积超过了样本的体积(比如裂解液用5倍体积，或者加裂解液等体积，再加1至2倍体积异丙醇)。而手工核酸提取常用的1.5ml离心管，或者自动化提取仪使用的深孔板，要求样本 保存液(若使用) 裂解液 其他液体(比如异丙醇)的体积小于等于1ml，否则手工提取时操作不便，或者仪器对深孔板混匀过程会溢出液体。近几年发展的核酸提取扩增检测一体机，或称全自动核酸检测系统，要求在较小的空间完成核酸提取，这样，样本 保存液(若使用) 裂解液的体积要求更小(比如只能装0.2ml)。这种情况下，即使样本量足够，比如有5ml、10ml时，由于需要加入大量体积的裂解液，也只能用很少的样本体积。
3.然而，临床样本的使用量与其检测限直接相关。比如样本中某种细菌的浓度为500个/ml，使用1ml做提取，洗脱体积50微升，若提取效率80％，就能得到80拷贝/微升的核酸浓度。但由于容器体积有限，保存液 裂解液 其他液体又占据了大部分体积，比如保存液要求等体积，裂解液要求2倍体积时，实际使用样本就只有200微升，保存液为200微升，裂解液为400微升，才能满足总体积小于1ml；这时，洗脱体积50微升，若提取效率80％，只能得到16拷贝/微升的核酸浓度。
4.此外，保存液一般是放在保护管中，用户需要开盖加入样本混合。而保护管中的保护液在运输过程会颠倒，导致管壁甚至管盖有液滴。为了避免开盖时触碰液滴造成污染，开盖加样本前需要用适配保护管的离心机离心后再开盖，多一步离心的操作。这会导致运输困难和使用麻烦。并且，裂解液由于液体分装后不易运输储存，通常都是提供一整瓶，用户做核酸提取前需要每个样本一个孔的分装加样，这样样本数目多时使用不便，操作便利性明显下降。
5.因此，非常需要开发一种新的用于提高针对液体样本的核酸提取量的方法，以有效提高在一次核酸提取中能够使用的样本量并改善液体核酸提取试剂(例如裂解液或保存液)的运输效率和使用便利性。


技术实现要素：

6.通过将液体核酸提取试剂(例如裂解液或保存液)冻干，可以一方面在冻干时水分去除掉减少液体占用体积，另一方面，可以维持疏松多孔的形态，使得加入样本后能够迅速溶解，充分发挥原液体核酸提取试剂的作用，进而解决上述问题。
7.根据本公开的第一方面，提供制备冻干型核酸提取试剂的方法，其包括以下步骤：
8.对液体核酸提取试剂进行冻干处理，以获得所述冻干型核酸提取试剂。
9.根据本公开的第二方面，提供制备含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置的方法，其包括以下步骤：
10.将液体核酸提取试剂添加至核酸提取装置内的容器中；和
11.对所述核酸提取装置进行冻干处理，以获得所述含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置。
12.在一种实施方案中，所述液体核酸提取试剂为裂解液或保存液。
13.在一种优选实施方案中，所述液体核酸提取试剂不含除水以外的挥发性物质。
14.在一种实施方案中，所述除水以外的挥发性物质为挥发性醇和/或挥发性酸。
15.在一种实施方案中，所述挥发性醇选自下组中的至少一种：甘油、异丙醇和乙醇；和/或所述挥发性酸为醋酸。
16.在一种优选实施方案中，所述液体核酸提取试剂为裂解液，所述裂解液包含：
17.5m-7m离液盐；
18.10mm-100mm缓冲液；
19.任选地，(v/v)0.01％-1％去垢剂；和
20.0mm-100mm额外的盐。
21.在一种优选实施方案中，所述离液盐为5m-7m，优选7m盐酸胍；或
22.所述离液盐为3m-5m，优选5m异硫氰酸胍盐；或
23.所述离液盐为3m-5m盐酸胍和4m-6m尿素；或
24.所述离液盐为2m-5m异硫氰酸胍和4m-6m尿素。
25.在一种优选实施方案中，所述缓冲液选自下组中的至少一种：三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、磷酸和苯磺酸。
26.在一种优选实施方案中，所述去垢剂选自下组中的至少一种：np40、吐温-20和triton x-100，优选np40。
27.在一种优选实施方案中，所述额外的盐选自下组中的至少一种：氯化钠、氯化钾、磷酸钠和磷酸钾。
28.在一种优选实施方案中，所述核酸提取装置为深孔板或离心管。
29.根据本公开的第三方面，提供冻干型核酸提取试剂，其由根据本公开的第一方面所述的方法制备获得。
30.根据本公开的第四方面，提供试剂盒，其包含根据本公开的第三方面所述的冻干型核酸提取试剂。
31.根据本公开的第五方面，提供含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置，其包含：
32.容器；和
33.根据本公开的第三方面所述的冻干型核酸提取试剂；
34.其中，所述冻干型核酸提取试剂容纳于所述容器中。
35.根据本公开的第六方面，提供含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置，其由根据本公开的第二方面所述的方法制备获得。
36.根据本公开的第七方面，提供保存冻干型核酸提取试剂、试剂盒或含有冻干型核
3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
54.此外，本文中要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨在限定单数形式。
55.进一步地，在以下说明书中将提及大量的表述，这些表述被定义为具有下列含义。
[0056]“冻干”是指冷冻干燥，即把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使固态水直接升华出来。
[0057]“裂解液”是指用于使样本中的细胞组织快速裂解的溶液。
[0058]“保存液”是指用于使样本不发生变质的溶液。
[0059]
浓度单位“m”是指mol/l或摩尔/升。
[0060]
浓度单位“mm”是指mmol/l或毫摩尔/升。
[0061]
浓度单位“(v/v)”是指(体积/体积)。
[0062]
如前文所描述，现有技术中缺乏可以用于提高针对液体样本的核酸提取量的方法，以有效提高在一次核酸提取中能够使用的样本量并改善液体核酸提取试剂(裂解液或保存液)的运输效率和使用便利性。
[0063]
制备冻干型核酸提取试剂的方法
[0064]
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第一示例实施方案提出了制备冻干型核酸提取试剂的方法，其包括以下步骤：
[0065]
对液体核酸提取试剂进行冻干处理，以获得所述冻干型核酸提取试剂。
[0066]
制备含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置的方法
[0067]
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第二示例实施方案提出了制备含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置的方法，其包括以下步骤：
[0068]
将液体核酸提取试剂添加至核酸提取装置内的容器中；和
[0069]
对所述核酸提取装置进行冻干处理，以获得所述含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置。
[0070]
关于本公开的第一示例实施方案或第二示例实施方案中的液体核酸提取试剂，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些，例如可以为裂解液或保存液。优选地，液体核酸提取试剂不含除水以外的挥发性物质，以避免在冻干时这些除水以外的挥发性物质挥发，使得复溶后配方与原配方不同。例如，所述除水以外的挥发性物质可以为挥发性醇和/或挥发性酸。典型地，所述挥发性醇可以选自下组中的至少一种：甘油、异丙醇和乙醇；和/或所述挥发性酸为醋酸。
[0071]
关于裂解液，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些，但优选地，所述裂解液包含：
[0072]
5m-7m离液盐；
[0073]
10mm-100mm缓冲液；
[0074]
任选地，(v/v)0.01％-1％去垢剂；和
[0075]
0mm-100mm额外的盐。
[0076]
关于离液盐，其可以为5m-7m，优选7m盐酸胍；或
[0077]
所述离液盐为3m-5m，优选5m异硫氰酸胍盐；或
[0078]
所述离液盐为3m-5m盐酸胍和4m-6m尿素；或
[0079]
所述离液盐为2m-5m异硫氰酸胍和4m-6m尿素。
[0080]
上述摩尔浓度“m”以及体积浓度“(v/v)”均是相对于裂解液整体计算得出。例如，“5m-7m离液盐”是指离液盐相对于整个裂解液的浓度为5m-7m。
[0081]
关于缓冲液，其可以选自下组中的至少一种：三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、磷酸和苯磺酸，优选三羟甲基氨基甲烷。
[0082]
关于去垢剂，其可以选自下组中的至少一种：np40、吐温-20和triton x-100，优选np40。本发明人意外地发现，通过加入去垢剂，可以使得制备的冻干型核酸提取试剂强度更高，不易破碎，更有利于后续处理步骤。
[0083]
关于额外的盐，其可以选自下组中的至少一种：氯化钠、氯化钾、磷酸钠和磷酸钾。
[0084]
关于冻干处理，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些方法，例如使用冻干机进行冻干，冻干程序设置为低温预冻，然后低温保持状态下抽真空，然后真空保持逐步升温至室温，整个冻干过程时间大约20至30小时。
[0085]
关于本公开的第二示例实施方案中的核酸提取装置，其可以为深孔板或离心管。
[0086]
冻干型核酸提取试剂
[0087]
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第三示例实施方案提出了冻干型核酸提取试剂，其由根据本公开的第一示例实施方案所述的方法制备获得。
[0088]
试剂盒
[0089]
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第四示例实施方案提出了试剂盒，其包含根据本公开的第三示例实施方案所述的冻干型核酸提取试剂。
[0090]
含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置(第一核酸提取装置)
[0091]
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第五示例实施方案提出了含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置，其包含：
[0092]
容器；和
[0093]
根据本公开的第三示例实施方案所述的冻干型核酸提取试剂；
[0094]
其中，所述冻干型核酸提取试剂容纳于所述容器中。
[0095]
含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置(第二核酸提取装置)
[0096]
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第六示例实施方案提出了含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置，其由本公开的第二示例实施方案所述的方法制备获得。
[0097]
保存冻干型核酸提取试剂、试剂盒或含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置的方法
[0098]
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第七示例实施方案提出了保存冻干型核酸提取试剂、试剂盒或含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置的方法，其包括以下步骤：
[0099]
将根据本公开的第三示例实施方案所述的冻干型核酸提取试剂或根据本公开的第四示例实施方案所述的试剂盒或根据本公开的第五示例实施方案至第六示例实施方案之一所述的含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置置于惰性气体中，优选氮气中；或
[0100]
将根据本公开的第三示例实施方案所述的冻干型核酸提取试剂或根据本公开的第四示例实施方案所述的试剂盒或根据本公开的第五示例实施方案至第六示例实施方案之一所述的含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置置于真空环境中；和/或
[0101]
将根据本公开的第三示例实施方案所述的冻干型核酸提取试剂或根据本公开的第四示例实施方案所述的试剂盒或根据本公开的第五示例实施方案至第六示例实施方案之一所述的含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置置于0-40℃，优选置于0-10℃，更优选置于0-5℃下。
[0102]
也可以采用其它的保存方式或条件，只要保证冻干型核酸提取试剂的形态无坍塌即可。
[0103]
优选地，保存冻干型核酸提取试剂、试剂盒或含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置的方法，其包括以下步骤：
[0104]
将根据本公开的第三示例实施方案所述的冻干型核酸提取试剂或根据本公开的第四示例实施方案所述的试剂盒或根据本公开的第五示例实施方案至第六示例实施方案之一所述的含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置置于包装物，优选铝箔袋中，并通氮气封装。
[0105]
裂解液体样本的方法(第一裂解方法)
[0106]
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第八示例实施方案提出了裂解液体样本的方法，其包括以下步骤：
[0107]
使液体样本与根据本公开的第三示例实施方案所述的冻干型核酸提取试剂接触，以进行裂解，其中所述冻干型核酸提取试剂通过冻干裂解液获得。
[0108]
裂解液体样本的方法(第二裂解方法)
[0109]
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第九示例实施方案提出了裂解液体样本的方法，其包括以下步骤：
[0110]
在根据本公开的第五示例实施方案至第六示例实施方案之一所述的含有冻干型核酸提取试剂的核酸提取装置中，使液体样本与冻干型核酸提取试剂接触，以进行裂解，其中所述冻干型核酸提取试剂通过冻干裂解液获得。
[0111]
提取液体样本中核酸的方法
[0112]
为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第十示例实施方案提出了裂解液体样本的方法，其包括以下步骤：
[0113]
使用根据本公开的第八示例实施方案或第九示例实施方案的方法，以获得裂解产物；和
[0114]
对所述裂解产物进行核酸提取，以获得目标核酸。
[0115]
关于本公开的第八、第九和第十示例实施方案中的液体样本并无并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些，例如可以选自下组中的至少一种：脑脊液、肺泡灌洗液和血清。
[0116]
优选实施例
[0117]
下面进一步对本公开的优选实施例进行详细描述，以下的描述为示例性的，并非对本公开的限制，任何的其他类似情形也都落入本公开的保护范围之中。
[0118]
材料和设备
[0119]
实施下述实施例1及对比例1-2所采用的材料和设备如下：
[0120]
盐酸胍，购自上海生工有限公司(a100287)。
[0121]
异硫氰酸胍，购自上海生工有限公司(a610244)。
[0122]
三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(1m tris-hcl)，购自北京索莱宝科技有限公司(t1150)。
[0123]
np40，购自北京索莱宝科技有限公司(n8030)。
[0124]
纳米磁珠，购自友康生物科技有限公司(mkc002)。
[0125]
冻干机，购自四环科仪科技发展有限公司(lgj-20g)。
[0126]
实施例1裂解液冻干
[0127]
裂解液配方为7m盐酸胍，50mmtris-hcl，0.5％np40。配制10ml裂解液的过程如下:a.配制50mm tris-hcl：取1m tris-hcl 1ml加无核酶水19ml稀释20倍得到。b.配制裂解液10ml：称取6.69g(7m*10ml*分子量95.53g/mole)盐酸胍，加入np-40 50μl(0.5％v/v)，加入50mm tris-hcl溶解定容至10ml。每个1.5ml离心管分装1ml裂解液。放入冻干机冻干，冻干程序为：
[0128]
温度时间真空度-50℃降温大气压-50℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下-45℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下-40℃2h抽真空，真空度保持在50pa或之下-30℃2h抽真空，真空度保持在50pa或之下-20℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下-10℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下0℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下10℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下25℃4h抽真空，真空度保持在50pa或之下
[0129]
冻干结束后取出带有冻干裂解试剂的1.5ml离心管，装入铝箔袋中开盖，通入氮气后封装。
[0130]
使用时，打开铝箔袋，其中冻干品形态规则，无坍塌。加入1ml液体样本，混匀，可很方便地继续进行核酸提取。
[0131]
这样，原来用1.5ml离心管提取样本体积在0.5ml之下(裂解液体积至少大于等于样本体积)，现在可以提取1ml的样本。
[0132]
实施例2测试加入和不加入去垢剂对冻干形态和效果的影响
[0133]
两种裂解液用于冻干测试：
[0134]
a:5m异硫氰酸胍，50mm三羟甲基氨基甲烷，0.5％np40
[0135]
b：5m异硫氰酸胍，50mm三羟甲基氨基甲烷
[0136]
两种裂解液配制过程如下：
[0137]
1.配制50mm tris-hcl：取1m tris-hcl 1ml加无核酶水19ml稀释20倍得到。
[0138]
2.配制10ml裂解液a：称取5.9g(5m*10ml*分子量118.16g/mole)异硫氰酸胍，加入np-40 50μl(0.5％v/v)，加入50mm tris-hcl溶解定容至10ml。
[0139]
3.配制10ml裂解液b：称取5.9g(5m*10ml*分子量118.16g/mole)异硫氰酸胍，加入50mm tris-hcl溶解定容至10ml。
[0140]
以上裂解液配制好后分别分装100微升和300微升至冻干管内，分别标记a、b。放入冻干机，冻干程序为：
[0141]
温度时间真空度-50℃降温大气压-50℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下-45℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下-40℃2h抽真空，真空度保持在50pa或之下-30℃2h抽真空，真空度保持在50pa或之下-20℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下-10℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下0℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下10℃3h抽真空，真空度保持在50pa或之下25℃4h抽真空，真空度保持在50pa或之下
[0142]
冻干结束后取出，观察a、b形态：
[0143]
a的形态完整稍有水润感，整块冻干品可以拍打后脱离管壁；b的形态完整稍有干燥裂痕，冻干品拍打时容易破碎。
[0144]
分别加入样本测试a、b核酸提取效果，两者并无显著差异。
[0145]
实施例3使用冻干的裂解试剂(即冻干型核酸提取试剂)的核酸提取效果测试
[0146]
使用实施例2的冻干品a(100微升冻干)进行测试，在冻干的裂解试剂中加入100微升阴性脑脊液充分复溶，掺入1000拷贝的单纯疱疹病毒1型(hsv1)、1000拷贝的单纯疱疹病毒2型(hsv2)、1000拷贝的肠道病毒(ev)；对照组使用100微升阴性脑脊液，加入500微升裂解液(5m异硫氰酸胍，50mm三羟甲基氨基甲烷，0.5％np40)，掺入1000拷贝的单纯疱疹病毒1型(hsv1)、1000拷贝的单纯疱疹病毒2型(hsv2)、1000拷贝的肠道病毒(ev)。
[0147]
在上述实验组和对照组中再加入20微升纳米磁珠，室温颠倒充分混匀5分钟。用磁铁(磁力架)吸住磁珠，去掉澄清液体；加入清洗液500微升清洗，再次用磁铁(磁力架)吸住磁珠，去掉澄清液体；重复该清洗步骤1次。加洗脱液50微升，60度加热混匀5分钟，再用磁铁(磁力架)吸住磁珠，转移上清液体得到核酸。
[0148]
得到实验组和对照组的核酸，分别用hsv1、hsv2、ev的荧光定量探针法试剂盒检测核酸的提取效果：
[0149]
以下是ct值
[0150] hsv1hsv2ev实验组-重复133.09431.26832.901实验组-重复233.14431.12232.766对照组-重复133.68931.80932.886
对照组-重复233.53831.86532.625
[0151]
可以看出，实验组(冻干裂解试剂)和对照组(普通裂解液)效果相当。而实验组只需要占用100微升的体积，对照组需要占用100微升 600微升的体积。
[0152]
实施例4在核酸提取装置(深孔板)中进行核酸提取测试
[0153]
本发明的优选应用是在体积固定的核酸提取装置中进行核酸提取，本实施例选择自动化核酸提取平台的深孔板。深孔板每个孔体积是2ml，但由于磁力棒上下混匀时液面会上下运动，所以最大液体体积只能加入1ml。
[0154]
实验样本：脑脊液阳性样本(hsv1阳性)，该样本总共有5ml。
[0155]
实验设置共3个方案：方案1——1ml冻干裂解试剂，可加入1ml样本体积；方案2——裂解液:样本体积＝5:1的核酸提取方法，该方案最多可加入0.166ml样本，0.833ml裂解液；方案3——裂解液:样本体积＝1：1，但磁珠结合需要在同一孔补1至2倍体积异丙醇，即该方案最多可以加样本0.33ml，裂解液0.33ml，异丙醇0.33ml。其中方案3是一款商业化核酸提取试剂盒，市面上大多数核酸提取试剂盒也是类似方法。方案2是已测试提取效果很好的方案。方案1是本发明使用冻干裂解试剂的方案。
[0156]
在深孔板加入试剂的方式如下：
[0157][0158]
核酸提取过程按照一般自动核酸提取仪程序进行，本次实验使用程序如下：
[0159][0160]
核酸提取完成后，使用荧光定量pcr检测三种方案提取得到的核酸的ct值：
[0161] hsv1 ct值方案127.641方案230.072方案329.216
[0162]
可以看出，结果与预期一致，由于方案1能够提取更大的样本体积，得到的核酸的
浓度就会更高，荧光定量pcr检测的ct值也会更早。
[0163]
综上，本公开的用于提高针对液体样本的核酸提取量的方法，可有效提高在一次核酸提取中能够使用的样本量，以改进荧光定量pcr检测的灵敏性，并改善了裂解的使用便利性，取得了明显的有益技术效果。
[0164]
前述的示例仅是说明性的，用于解释本公开的特征的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求并不被说明本技术的特征的示例的选择限制。如在权利要求中使用的，术语“包括”和其语意上的变体在逻辑上也包括不同和变化的用语，例如但不限于“基本组成为”或“组成为”。当需要时，提供了一些数值范围，而这些范围也包括了在其之间的子范围。这些范围中的变化也对于本领域技术人员也是自明的，且不应被认为被捐献给公众，而这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的权利要求覆盖。而且在科技上的进步将形成由于语言表达的不准确的原因而未被目前考虑的可能的等同物或子替换，且这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的权利要求覆盖。