检测肾上腺高血压的基因检测panel及其用途的制作方法

1.本发明属于生物检测领域，具体地，涉及肾上腺高血压的基因检测panel。


背景技术：

2.高血压根据发病原因可分为原发性高血压和继发性高血压。原发性高血压 是指病因不明确的高血压；继发性高血压是指病因明确的高血压，即由其他器 官或系统的疾病(原发病)所导致的高血压，又称为症状性高血压。继发性高 血压的发病率大约占高血压的总体发病率的10％～20％，肾上腺性高血压是继 发性高血压中常见的类型，约占继发性高血压的20％以上，肾上腺性高血压是 指由各种原因导致肾上腺相关激素分泌增加从而引起血压升高，包括原发性醛 固酮增多症(原醛症)、库欣综合征和嗜铬细胞瘤和副神经节瘤等。与原发性 高血压相比，肾上腺性高血压具有起病年轻、伴有激素分泌异常，常伴有高血 压以外的其他损害、高血压多为顽固性、并发症多，致死率与致残率较高、确 诊后可通过手术或药物得到根治或有效治疗的特点。
3.目前肾上腺性高血压的诊断仍主要依靠临床表现、生化检查，以及影像学 检查等，缺点是临床表现不典型、生化指标检出率低，且易受外界因素干扰等 而导致误诊或漏诊。例如常见的肾上腺性高血压原醛症，目前不少医生(甚至 专科医生)尚停留在根据“高血压伴低血钾”的线索来筛查原醛症的“初级水平”。 据研究报道，仅少部分原醛症患者存在低钾血症，醛固酮腺瘤患者约50％表现 有低钾血症，而特发性醛固酮增多症的患者中仅17％表现有低钾血症。因此， 低钾血症对于原醛症的诊断价值有限，敏感性非常低。
4.研究表明，肾上腺性高血压发生与基因突变存在密切的关系，已有不少基 因明确与其发生发展相关。这些与肾上腺性高血压发生发展相关的基因突变多 数分布于整个编码区，没有明显的突变热点，胚系突变和体细胞突变均与疾病 的发生相关，并且体细胞突变的占比不低，如醛固酮瘤的kcnj5基因体细胞突 变率为50％～60％，亚洲国家醛固酮瘤的kcnj5突变率高达65％～80％。
5.因此，本领域需求一种基因检测产品，其联合临床表征与目前的筛查手段 相结合的方式，以提高诊断的效率，让更多的患者更早的接受相应的治疗，提 高患者的生活质量，弥补目前临床诊断不足的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，第一方面，本发明提供了一种肾上腺高血压的基因检测panel， 其包括：
7.kcnj5、cacna1d、atp1a1、atp2b3、ctnnb1、clcn2、cyp11b2、 cacna1h中的至少两个；
8.sdha、sdhb、sdhc、sdhd、sdhaf2、fh、vhl、epas1、csde1、 maml3、ret、nf1、max、tmem127、hras、egln1、egln2、kif1b、 dlst、fgfr1、idh1、h3f3a、mdh2、aco1、slc25a11、got2中的至少 两个；以及
9.usp8、gnas、rasd1、prkar1a、aip、cables1、men1、cdkn1b、 tsc1、tsc2、rb1、tp53、prkaca、apc、armc5、gipr、mc2r、pde11a、 prkacb、pde8b、znrf3、cdkn2a、cdk4、mdm2、daxx、atrx、cdkn1c、 wtx、crebbp、ep300中的至少两个。
10.研究表明，与原醛症的发生相关的常见基因包括atp1a、atp2b3、 cacna1d、cacna1h、ctnnb1、prkaca等数十个。嗜铬细胞瘤和副神 经节瘤(pheochromocytoma and paraganglioma，ppgl)是目前已知的遗传度最 高的神经内分泌肿瘤。目前认为，ppgl的发生与致病基因的突变有关，约70％ 的ppgl患者可检测到明确的致病基因，其中40％的患者存在胚系突变。目前 研究发现了至少30个与ppgl发生有关的致病基因。库欣综合征(cushing’s disease)是又称皮质醇增多症，是由各种病因导致的高皮质醇血症，作用于靶器 官，引起的以向心性肥胖、高血压、糖代谢异常、低钾血症和骨质疏松为典型 表现的一种综合征。目前研究发现了至少30个与库欣综合征发生有关的致病基 因，包括usp8、gnas、rasd1、prkar1a、aip、cables1、men1、ret、 cdkn1b、tsc1、tsc2、rb1、tp53、nf1、vhl、prkaca、apc、armc5、 gipr等，这些基因主要是通过影响皮质醇的的过量分泌从而导致疾病的发生。 选取特异有效基因集合对疾病的辅助诊断非常关键，漏选会降低检测敏感度， 多选则会增加成本和操作难度。本专利发明通过查询大量疾病数据库和文献研 究中关于肾上腺高血压相关疾病研究记录，包括omim、clinvar、disease、 genereviews，选取有充分证据可以导致肾上腺性高血压的基因/变异，这些证 据包括基因、蛋白功能研究、家系遗传性研究、人群变异分析等。最终选取了 本发明使用的64个肾上腺性高血压的相关基因的各种组合，其对应基因名称列 举如上(所述基因的相关信息可参见在线《人类孟德尔遗传》(omim,onlinemendelian inheritance in man)数据库https://www.omim.org/)。使用这些基因 的组合能够最大限度的增加灵敏度并降低成本和操作难度。
11.使用上述本发明的基因检测panel，结合生物学和生物信息学的相关手段， 可以对潜在的致病性突变进行筛选，从而可以结合临床筛查手段和临床表型提 高对原发性醛固酮增多症、库欣综合征(皮质醇增多症)，以及嗜铬细胞瘤和 副神经节瘤的诊断的效率，弥补目前临床诊断不足的问题。同时灵敏度高，成 本和操作难度低。
12.其中，kcnj5、cacna1d、atp1a1、atp2b3、ctnnb1、clcn2、cyp11b2、 cacna1h为原发性醛固酮增多症相关基因；sdha、sdhb、sdhc、sdhd、 sdhaf2、fh、vhl、epas1、csde1、maml3、ret、nf1、max、tmem127、 hras、egln1、egln2、kif1b、dlst、fgfr1、idh1、h3f3a、mdh2、aco1、slc25a11、got2为嗜铬细胞瘤和副神经节瘤相关基因；以及usp8、 gnas、rasd1、prkar1a、aip、cables1、men1、cdkn1b、tsc1、tsc2、 rb1、tp53、prkaca、apc、armc5、gipr、mc2r、pde11a、prkacb、 pde8b、znrf3、cdkn2a、cdk4、mdm2、daxx、atrx、cdkn1c、 wtx、crebbp、ep300为皮质醇增多症相关基因。
13.更进一步地，本发明提供了一种肾上腺高血压的基因检测panel，其包括：
14.kcnj5、cacna1d、atp1a1、atp2b3、ctnnb1、clcn2、cyp11b2、 cacna1h中的至少三个；
15.sdha、sdhb、sdhc、sdhd、sdhaf2、fh、vhl、epas1、csde1、 maml3、ret、nf1、max、tmem127、hras、egln1、egln2、kif1b、 dlst、fgfr1、idh1、h3f3a、mdh2、aco1、slc25a11、got2中的至少 三个；以及
16.usp8、gnas、rasd1、prkar1a、aip、cables1、men1、cdkn1b、 tsc1、tsc2、rb1、tp53、
prkaca、apc、armc5、gipr、mc2r、pde11a、 prkacb、pde8b、znrf3、cdkn2a、cdk4、mdm2、daxx、atrx、cdkn1c、 wtx、crebbp、ep300中的至少三个。
17.更进一步地，本发明提供了一种肾上腺高血压的基因检测panel，其包括：
18.kcnj5、cacna1d、atp1a1、atp2b3、ctnnb1、clcn2、cyp11b2、 cacna1h中的至少五个；
19.sdha、sdhb、sdhc、sdhd、sdhaf2、fh、vhl、epas1、csde1、 maml3、ret、nf1、max、tmem127、hras、egln1、egln2、kif1b、 dlst、fgfr1、idh1、h3f3a、mdh2、aco1、slc25a11、got2中的至少 五个；以及
20.usp8、gnas、rasd1、prkar1a、aip、cables1、men1、cdkn1b、 tsc1、tsc2、rb1、tp53、prkaca、apc、armc5、gipr、mc2r、pde11a、 prkacb、pde8b、znrf3、cdkn2a、cdk4、mdm2、daxx、atrx、cdkn1c、 wtx、crebbp、ep300中的至少五个。
21.使用上述本发明的基因检测panel，其检测的灵敏度更高，漏检率更低。
22.更进一步地，本发明提供了一种肾上腺高血压的基因检测panel，其包括：
23.kcnj5、cacna1d、atp1a1、atp2b3、ctnnb1、clcn2、cyp11b2、 cacna1h；
24.sdha、sdhb、sdhc、sdhd、sdhaf2、fh、vhl、epas1、csde1、 maml3、ret、nf1、max、tmem127、hras、egln1、egln2、kif1b、 dlst、fgfr1、idh1、h3f3a、mdh2、aco1、slc25a11、got2；以及
25.usp8、gnas、rasd1、prkar1a、aip、cables1、men1、cdkn1b、 tsc1、tsc2、rb1、tp53、prkaca、apc、armc5、gipr、mc2r、pde11a、 prkacb、pde8b、znrf3、cdkn2a、cdk4、mdm2、daxx、atrx、cdkn1c、 wtx、crebbp、ep300。
26.使用上述本发明的基因检测panel，能够最大程度的提升检测的灵敏度和覆 盖范围，使得漏检率更低。
27.第二方面，本发明提供了一种肾上腺高血压的基因检测panel，其包括：
28.kcnj5、sdhb、prkaca；和
29.cacna1d、atp1a1、atp2b3、ctnnb1、clcn2、cyp11b2、cacna1h 中的至少两个；和
30.sdha、sdhc、sdhd、sdhaf2、fh、vhl、epas1、csde1、maml3、 ret、nf1、max、tmem127、hras、egln1、egln2、kif1b、dlst、 fgfr1、idh1、h3f3a、mdh2、aco1、slc25a11、got2中的至少两个； 以及
31.usp8、gnas、rasd1、prkar1a、aip、cables1、men1、cdkn1b、 tsc1、tsc2、rb1、tp53、apc、armc5、gipr、mc2r、pde11a、prkacb、 pde8b、znrf3、cdkn2a、cdk4、mdm2、daxx、atrx、cdkn1c、 wtx、crebbp、ep300中的至少两个。
32.进一步地，本发明提供了一种肾上腺高血压的基因检测panel，其包括：
33.kcnj5、sdhb、prkaca；和
34.cacna1d、atp1a1、atp2b3、ctnnb1、clcn2、cyp11b2、cacna1h 中的至少三个；和
35.sdha、sdhc、sdhd、sdhaf2、fh、vhl、epas1、csde1、maml3、 ret、nf1、max、tmem127、hras、egln1、egln2、kif1b、dlst、 fgfr1、idh1、h3f3a、mdh2、aco1、slc25a11、got2中的至少三个； 以及
36.usp8、gnas、rasd1、prkar1a、aip、cables1、men1、cdkn1b、 tsc1、tsc2、rb1、tp53、apc、armc5、gipr、mc2r、pde11a、prkacb、 pde8b、znrf3、cdkn2a、cdk4、mdm2、daxx、atrx、
cdkn1c、 wtx、crebbp、ep300中的至少三个。
37.更进一步地，本发明提供了一种肾上腺高血压的基因检测panel，其包括：
38.kcnj5、sdhb、prkaca；和
39.cacna1d、atp1a1、atp2b3、ctnnb1、clcn2、cyp11b2、cacna1h 中的至少五个；和
40.sdha、sdhc、sdhd、sdhaf2、fh、vhl、epas1、csde1、maml3、 ret、nf1、max、tmem127、hras、egln1、egln2、kif1b、dlst、 fgfr1、idh1、h3f3a、mdh2、aco1、slc25a11、got2中的至少五个； 以及
41.usp8、gnas、rasd1、prkar1a、aip、cables1、men1、cdkn1b、 tsc1、tsc2、rb1、tp53、apc、armc5、gipr、mc2r、pde11a、prkacb、 pde8b、znrf3、cdkn2a、cdk4、mdm2、daxx、atrx、cdkn1c、 wtx、crebbp、ep300中的至少五个。
42.使用上述本发明的基因检测panel，其检测的灵敏度更高，漏检率更低。
43.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第一基因检测 panel，其包括：
44.kcnj5、cacna1d；
45.sdhb、sdhd；以及
46.prkaca、apc。
47.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第二基因检测 panel，其包括：
48.kcnj5、clcn2；
49.sdhb、tmem127；以及
50.prkaca、cdkn1b。
51.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第三基因检测 panel，其包括：
52.cacna1d、clcn2；
53.sdhd、tmem127；以及
54.apc、cdkn1b。
55.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第四基因检测 panel，其包括：
56.kcnj5、cacna1d、atp1a1；
57.sdha、sdhb、sdhd；以及
58.prkaca、apc、armc5。
59.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第五基因检测 panel，其包括：
60.kcnj5、clcn2、cyp11b2；
61.sdhd、vhl、epas1；以及
62.prkaca、apc、cdkn1b。
63.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第六基因检测 panel，其包括：
64.cyp11b2、clcn2、cyp11b2；
65.sdhb、dlst、fgfr1；以及
66.daxx、apc、cdkn1b。
67.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第七基因检测 panel，其包括：
68.kcnj5、atp2b3、ctnnb1；
69.sdhd、sdhaf2、fh；以及
70.prkar1a、rb1、tp53。
71.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第八基因检测 panel，其包括：
72.kcnj5、cacna1d、atp1a1、atp2b3、ctnnb1；
73.sdha、sdhb、sdhc、sdhd、sdhaf2；以及
74.prkar1a、rb1、tp53、prkaca、apc。
75.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第九基因检测 panel，其包括：
76.kcnj5、cacna1d、atp1a1、clcn2、ctnnb1；
77.sdha、sdhb、kif1b、dlst、fgfr1；以及
78.prkar1a、usp8、gnas、prkaca、apc。
79.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第十基因检测 panel，其包括：
80.kcnj5、cacna1d、cacna1h、clcn2、atp2b3；
81.sdha、sdhb、tmem127、hras、egln1；以及
82.prkar1a、cdkn1b、gnas、prkaca、pde11a。
83.在一个具体的实施方案中，本发明提供了肾上腺高血压的第十一基因检测 panel，其包括：
84.kcnj5、cacna1d、atp1a1、atp2b3、ctnnb1、clcn2、cyp11b2、 cacna1h；
85.sdha、sdhb、sdhc、sdhd、sdhaf2、fh、vhl、epas1、csde1、 maml3、ret、nf1、max、tmem127、hras、egln1、egln2、kif1b、 dlst、fgfr1、idh1、h3f3a、mdh2、aco1、slc25a11、got2；以及
86.usp8、gnas、rasd1、prkar1a、aip、cables1、men1、cdkn1b、 tsc1、tsc2、rb1、tp53、prkaca、apc、armc5、gipr、mc2r、pde11a、 prkacb、pde8b、znrf3、cdkn2a、cdk4、mdm2、daxx、atrx、cdkn1c、 wtx、crebbp、ep300。
87.另一方面，本发明还提供上述基因panel在辅助诊断肾上腺高血压患者病 因的装置中的应用。
88.又一方面，本发明还提供上述基因panel在辅助诊断肾上腺高血压患者病 因的试剂中的应用。
89.又一方面，本发明提供了如上所述用途所制备的试剂。
90.进一步地，所述试剂为基因芯片、检测突变的pcr引物和探针、高通量测 序所用试剂。
91.在一些具体的实施方案中，基因芯片包括针对上述panel的捕获探针。进 一步地，
对应设计捕获探针的区域如表1所示。
92.在一些具体的实施方案中，高通量测序所用试剂包括nextseq 500 midoutput kit v2.5或nextseq 500 mid output kit v2。
93.又一方面，本发明提供了一种辅助诊断肾上腺高血压患者病因的装置，其 包括：
94.检测模块，包括检测如上所述的基因panel的试剂；
95.数据处理模块，包括处理所述检测模块获得的数据，并与参考序列进行比 对，获得序列比对结果；以及
96.筛选模块，包括对所述序列比对结果进行注释并筛选潜在突变基因。
97.所述参考序列为所提及的上述基因在参考基因组(hg19)上的序列。
98.又一方面，本发明一种基因突变的筛选方法，包括针对测试对象利用上述 的基因panel通过检测并结合生物信息学分析进行数据处理和基因突变筛选。
99.在一个具体的实施方案中，一种基因突变的筛选方法，包括针对测试对象 利用上述的基因panel通过高通量测序并结合生物信息学分析进行数据处理和 基因突变筛选。
100.在一个具体的实施方案中，一种基因突变的筛选方法，包括针对测试对象 利用上述的基因panel通过芯片捕获并结合生物信息学分析进行数据处理和基 因突变筛选。
101.在一个具体的实施方案中，一种基因突变的筛选方法，包括针对测试对象 利用上述的基因panel通过pcr筛选并结合生物信息学分析进行数据处理和基 因突变筛选。
102.在一些具体的实施方案中，数据处理和基因突变筛选包括测序数据下机后， 将通过对数据进行质控，比对、比对预处理及重比对，单核苷酸突变(snvs) calling、短插入/缺失(indels)突变calling、融合、拷贝数变异(cnvs)、结 果过滤及注释得到检测结果。得到的初步突变结果将根据变异(snv、indel、 cnv、融合)与疾病之间的关系，结合受检者临床表型、家族史和具体研究文 献，依据acmg/amp指南把变异分成5类：致病、疑似致病、意义未明、疑 似良性、良性。通过以上筛选步骤得到受检者基因突变信息。
附图说明
103.图1为本发明检测方法的流程图。
具体实施方式
104.本发明的检测方法流程如图1所示，而下文将结合具体实施方案和实施例， 具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技 术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发 明。
105.实施例1、待测样本处理
106.1.1、样本提取
107.使用商品化试剂盒qiaamp dna ffpe tissue kit，按照说明书进行提取。
108.1.2、dna样本质量要求
109.提取后的dna使用dsdna hs assay kit定量，dna总量应不少于 0.2μg；使用nanodrop检测纯度，od260/280应不低于1.8。
110.注：提取后的样本dna，如不立即进行后续实验，可在-20℃以下保存12 个月。
111.2、文库构建
112.2.1、dna打断
113.a、dna投入量为0.1μg～0.5μg，选择破碎片段大小为150bp～300bp。
114.b、使用新芝超声破碎仪超声打断。推荐打断条件如下：
115.超声打断总时间40min，功率40％，打断模式：超声5s，停5s。
116.2.2、片段化纯化
117.a、ampurexp磁珠在使用前充分漩涡震荡混匀。
118.b、加入样品体积0.6倍的核酸纯化试剂，用移液器上下混匀10次。
119.c、室温下静置5min后，置于磁力分离架上5min，直至上清澄清。
120.d、小心吸取上清转移至含有0.9倍的核酸纯化试剂，用移液器上下混匀 10次。
121.e、室温下静置5min后，置于磁力分离架上5min，直至上清澄清。小心移 去上清。
122.f、置于磁力分离架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温静置30sec， 吸弃上清。
123.g、重复步骤d，并尽量去除所有残留乙醇溶液。
124.h、离心管留于磁力架上室温开盖5min干燥，使乙醇全部挥发。
125.i、加入43μl无酶水，使用移液器上下混匀10次。室温孵育5min。
126.j、置于1.5ml磁力架上5min，取41μl dna溶液进入下一步文库构建实 验。
127.2.3、末端修复加a
128.a、在0.2ml pcr管中，如下配制文库混合液1。
129.组分加样量(μl)片段化dna4110
×
t4 pnk缓冲液5dntp mix(25mm)0.7t4 dna聚合酶1.2t4 pnk1.2klenow fragment0.7taq dna连接酶0.2总体积50
130.b、使用移液器上下吹吸将液体混匀，快速离心收集液体。
131.c、将文库混合液1置于pcr热循环仪中按照以下条件进行孵育。
132.2.4加接头
133.a、孵育完成后按下表向装有混合液1的反应管中加入试剂盒内相应组分 试剂，完成混合液2配制(配置过程于冰上完成)。
134.组分加样量(μl)2
×
rapid连接酶缓冲液40adapter(10μm)6t4 dna连接酶4总体积50
135.b、使用移液器上下吹吸将液体混匀，快速离心收集液体。将反应管置于 pcr仪上，20℃孵育20min。
136.2.5、adaptor连接产物纯化
137.a、ampurexp磁珠在使用前充分漩涡震荡混匀。
138.b、连接反应完成后，立即加入连接反应体积0.8倍的核酸纯化试剂。使用 移液器上下混匀10次。
139.c、室温下静置5min后，置于磁力分离架上5min，直至上清澄清。小心移 去上清。
140.d、置于磁力分离架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温静置30sec， 吸弃上清。
141.e、重复步骤d，并尽量去除所有残留乙醇溶液。
142.f、离心管留于磁力架上室温开盖5min干燥，保证所有乙醇全部挥发。
143.g、加入22.5μl无酶水，使用适宜量程的移液器上下混匀10次。室温孵 育5min。
144.h、置于磁力架上5min，取20μl dna溶液进入pcr扩增。
145.2.6、pcr扩增
146.a、如下加入试剂，配制混合液3(配置过程于冰上完成)：
[0147][0148]
b、使用移液器上下吹吸将液体混匀，短暂离心收集液体。
[0149]
c、将配制好的混合液3置于pcr仪，按以下反应程序扩增：
[0150][0151]
2.7、pcr产物纯化
[0152]
a、ampurexp磁珠在使用前充分漩涡震荡混匀。
[0153]
b、连接反应完成后，立即加入连接反应体积0.8倍的核酸纯化试剂。使用 移液器上下混匀10次。
[0154]
c、室温下静置5min后，置于磁力分离架上5min，直至上清澄清。小心移 去上清。
[0155]
d、置于磁力分离架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温静置30sec， 吸弃上清。
[0156]
e、重复步骤d，并尽量去除所有残留乙醇溶液。
[0157]
f、离心管留于磁力架上室温开盖5min干燥，保证所有乙醇全部挥发。
[0158]
g、加入32.5μl无酶水，使用适宜量程的移液器上下混匀10次。室温孵 育5min。
[0159]
h、置于磁力架上5min，取30μl dna溶液进入下一步文库富集。取1μl 使用dsdna hs assay kit进行dna定量。
[0160]
实施例2、捕获探针合成
[0161]
据上述筛选出的目的基因总计64个基因，进行panel设计。设计区域为各 基因外显子区。探针设计使用twist提供的设计网站，依据上述要求提交设计。 将设计得到的探针进行比对分析，针对覆盖度低的基因增加探针覆盖度，使得 覆盖度达到99.9％以上。最终调整完成的目标区域大小为161kb，目标区域覆 盖度为100％，设计完成的最终探针包交于twist进行合成，合成的探针待捕获 使用。设计捕获探针的区域如表1所示。
[0162]
表1基因目标区域
[0163]
[0164]
[0165]
[0166]
[0167]
[0168]
[0169]
[0170]
[0171][0172]
实施例3、杂交捕获
[0173]
3.1、文库杂交
[0174]
a、文库池常包含多个不同样本文库，根据文库dna浓度计算文库池进入 量，混合获得文库池。文库池dna总量为1.5μg。
[0175]
b、文库池dna混合方案，根据下列公式计算每个样本文库加入体积
[0176]
v＝x/c
[0177]
说明：当n＝1～3时，x(ng)＝500；当n＝4～8时；x(ng)＝1500/n。
[0178]
n为样本数量，c为dna定量浓度，v为样本杂交体积。
[0179]
根据上表计算计算每个样本的文库富集进入量，从而混合各样本得到文库 池。
[0180]
c、文库池按下表加入试剂，于1.5ml离心管中配制混合液4。
[0181]
组分加样量(μl)twist probe panel4μniversal blockers8blocker solution5
[0182]
d、使用移液器上下吹吸将液体混匀，短暂离心收集液体。
[0183]
e、使用可控温真空干燥仪，建议设置干燥温度60℃，打开管盖，直至混 合液4干燥完全。
[0184]
f、另取0.2ml pcr管，按下表加入试剂盒内相应组分，配制混合液5：
[0185][0186]
g、将50μl混合液5加入到干燥后混合液4的反应管中，室温静置10min。 使用移液器上下吹吸10次，完全溶解dna后，转移至新的pcr管中。
[0187]
h、pcr管置于pcr仪并设定程序：95℃加热10分钟，60℃，加热4小 时。
[0188]
3.2、文库捕获和清洗
[0189]
a、捕获磁珠和纯化磁珠提前拿出来室温平衡30min；410μl fast washbuffer预热66℃，700μl wash buffer2预热48℃。
[0190]
b、100μl捕获磁珠加入0.2ml pcr管，漩涡震荡15s，短暂离心，上磁 力架，澄清后，缓慢吸弃上清，不要有残留，也不要吸到磁珠。
[0191]
c、加入200μl fast binding bμffer，拿下磁力架，震荡混匀10s，再放到 磁力架上，澄清后，缓慢吸弃上清，不要有残留，也不要吸到磁珠。
[0192]
d、重复c两遍。
[0193]
e、将含200μl binding buffer的链霉素磁珠快速加入到放置在pcr仪中 的杂交产物(保持温度60℃)中，移液器吹打混匀，不要漩涡。室温孵育15min， 在垂直混匀仪上保持轻微摇动。孵育完后放置在磁力架上1min，澄清后，吸弃 上清。
[0194]
f、加入200μl的66℃fast wash buffer漩涡震荡10s，稍加离心，直接 pcr仪上66℃孵育5min，放到磁力架1min，澄清后，缓慢吸弃上清，不要有 残留，也不要吸到磁珠。
[0195]
g、加入200μl的66℃fast wash buffer漩涡震荡10s，稍加离心，直接 pcr仪上66℃孵育5min后，吹打混匀，转入新的0.2ml pcr管中，放到磁力 架1min，澄清，缓慢吸弃上清，不要有残留，也不要吸到磁珠。
[0196]
h、加入200μl的48℃wash buffer2漩涡震荡10s，稍加离心，直接pcr 仪上66℃孵育5min后，放到磁力架1min，澄清后，缓慢吸弃上清，不要有残 留，也不要吸到磁珠。
[0197]
i、重复h两遍。
[0198]
j、加入21μl的超纯水震荡混匀，重悬磁珠备用(注意必须带磁珠进行 pcr)。
[0199]
k、如下配制反应液至0.2ml pcr管。
[0200][0201]
将重悬磁珠22.5μl(体积若不够补水至22.5μl)加入有反应液的0.2mlpcr管，震荡混匀，短暂离心，放入pcr仪器中，反应程序如下：98℃45s； 98℃15s，60℃30s，72℃30s，14循环；72℃2min，4℃。
[0202]
3.3、pcr反应后纯化
[0203]
a、将上一步产物转入1.5ml离心管中，加入90μl(1.8
×
)twist beads， 吹打混匀，静置5min，上磁力架，澄清后，去掉上清，不可吸到磁珠。
[0204]
b、加入200μl 80％乙醇漂洗磁珠，在磁力架上旋转0.2ml pcr管两次， 小心移除上清，不可吸到磁珠。
[0205]
c、加入200μl 80％乙醇漂洗磁珠，在磁力架上吹吸乙醇，使磁珠更聚集， 小心移除上清，不可吸到磁珠。
[0206]
d、放置于金属浴中37℃烘干至磁珠表面无明显反光，加入34μl h2o洗 脱，吹打混匀，静置3min，上磁力架上；
[0207]
e、待溶液澄清后转移33μl上清至新的1.5ml的离心管中(核对样本编 号，做好唯一性标记)，震荡混匀，取1μl qb定量，记录浓度，样本-20℃保 存。
[0208]
4、测序
[0209]
4.1、文库预处理
[0210]
4.1.1、准备变性试剂：取200μl1n文库变性液浓储，加800μl无酶水配 置成0.2n文库变性液，涡旋混匀，短暂离心，室温放置备用。
[0211]
4.1.2、文库变性：取5μl文库(4nm)至低吸附管管底，再加入5μl 0.2n 文库变性液，吹打混匀。关闭管盖室温孵育5min，之后立即置于冰上。
[0212]
4.1.3、文库稀释：变性后的10μl文库中加入990μl冰上预冷的稀释缓冲 液，混匀后快速离心，置于冰上备用。
[0213]
4.2、上样
[0214]
4.2.1、使用洁净的1ml枪头刺穿load samples(装入样品)孔的封箔，将 1300μl已制备文库注入load samples(装入样品)孔中。避免接触封箔。
[0215]
4.2.2、加载样品后检查孔中是否有气泡，如果有气泡在工作台轻轻敲打试 剂盒以释放气泡。
[0216]
4.2.3、将加载好样品的测序试剂盒使用nextseq cn500测序仪进行测序。
[0217]
5、数据分析
[0218]
测序数据下机后，对数据进行生物信息学分析，检测基因上的突变。具体 步骤如下：
[0219]
5.1、数据质控：采用fastq(v2)对每个样本文库每个lane的fastq数据文 件进行去接头、去低质量(如包含过多的
‘
n’)reads过滤，得到高质量的cleanreads，并生成过滤统计(包括接头统计、数据过滤前后q20、q30、gc含量、 碱基质量分布等)。
[0220]
5.2、比对：使用比对软件bwa-mem2(v2.0)将clean reads比对到人类参 考基因组grch37上，得到reads在基因组上的比对信息文件bam。
[0221]
5.3、比对预处理及重比对：包括使用in-house scripts对bam结果进行过 滤(去除多比对位置的reads记录)、picard tools(v1.92)对bam进行基因 组位置排序、gatk对bam进行重比对、samtools(v1.9)对同一个文库样本 不同lane的bam文件进行合并、picardtools对合并后的bam文件做目标区 域捕获芯片的覆盖度、深度、捕获效率、均一性，可比对序列和碱基的数量等 统计。
[0222]
5.4、单核苷酸突变(snvs)calling：采用samtools对最终的bam生成 mpileup文件，并采用in-house scripts对snvs进行calling。大致原理为：通过 对每一个位点的碱基型进行扫描，得到碱基分布表，再通过过滤条件，找出可 疑的突变；采用annovar对突变结果注释。
[0223]
5.5、短插入/缺失(indels)突变calling：采用in-house scripts对bam文 件中的每一个记录进行扫描，找到所有可疑的缺失和插入；采用annovar对 突变结果注释。
[0224]
5.6、融合：采用in-house scripts对bam进行过滤(过滤掉完全比对的条 目)，再从原始fastq reads文件里提取fusion fq reads，采用fusionscan软件对 以上reads做融合分析。
[0225]
5.7、拷贝数变异(cnvs)：通过in-house scripts对每个位点的深度统计， 并对背景库做矫正后得到每个区段的相对拷贝数。
[0226]
5.8、结果过滤及注释：通过建立的背景库、突变特征等对以上原始snvs、 indels、fusion、cnvs结果做过滤，得到最终突变结果；如果有对照gdna样 本，会对结果做“体细胞”或“遗传(杂合/纯合)”注释。
[0227]
6、结果解读
[0228]
结果解读主要是解释变异(snv、indel、cnv、融合)与疾病之间的关系， 依据acmg/amp指南把变异分成5类：致病、疑似致病、意义未明、疑似良 性、良性，通过使用内部软件结合人工实现。其中人工处理包括结合受检者临 床表型、家族史和具体研究文献对变异证据进行调整。
[0229]
具体如下：
[0230]
6.1、加载数据库：加载疾病数据库和自定义数据库。
[0231]
6.2、收集变异信息：对输入的变异信息逐个读取基本变异信息、人群变异 频率数据、疾病变异数据、变异功能预测数据以及变异保守性等其他数据信息。
[0232]
6.3、处理解读证据：
[0233]
i)使用收集的变异信息，依次判断每个变异是否满足致病性或者良性证据。 其中致病性证据包括：极强致病的(pvs)、强致病的(ps)、中等致病的(pm)、弱 致病的(pp)，良性证据包括：独立良性(ba)、强良性的(bs)、弱良性的(bp)。ii) 组合变异证据，根据acmg/amp
组合规则给每个变异分类：致病、疑似致病、 意义未明、疑似良性、良性。
[0234]
实施例4、本发明基因panel检测临床样本
[0235]
本发明所使用的的基因panel，如下表2所示。
[0236]
表2、本发明所使用的基因panel
[0237][0238][0239]
使用如上所述的方法，用本发明所提及的11个基因panel对35例临床样 本进行检
测之后进行临床诊断。其临床检测结果如表3所示，而基因panel检 测结果如下表4所示。
[0240]
表3、临床检测结果
[0241]
样本编号相关疾病3原发性醛固酮增多症4皮质醇增多症6原发性醛固酮增多症9原发性醛固酮增多症14皮质醇增多症12原发性醛固酮增多症15原发性醛固酮增多症18原发性醛固酮增多症22皮质醇增多症24嗜铬细胞瘤和副神经节瘤28嗜铬细胞瘤和副神经节瘤33嗜铬细胞瘤和副神经节瘤
[0242]
表4、基因panel检测结果
[0243]
[0244][0245]
从上表可以看出，本发明所涉及的基因检测panel均能够在一定程度上辅 助检测相关临床疾病，为医生的及时诊断提供方向，其灵敏度高，漏检率低， 时间短，成本和操作难度低。
[0246]
实施例5、本发明基因panel灵敏度检测
[0247]
选取三个不同突变的标准品，以初始dna投入量为0.1μg进行dna打断 后平行测试3批次0.5％、1％、2％、3％、4％、5％突变频率的标准品，每批次 每个浓度的标准品测试10次，取10次测试的突变频率的平均值，具体数据如 下表5所示。结果显示：不同检测限待测位点均能稳定检出，待检位点总体与 梯度存在线性关系，在投入量为0.1μg的条件下，突变检测下限(分析灵敏度) 为0.5％，表明该检测方法灵敏度高。
[0248]
表5、灵敏度检测
[0249]