一种提高谷氨酸发酵速率的工艺的制作方法

ml/l，kh2po42.5 g/l，mgso4·
7h2o1.2 g/l，kcl1 g/l，mnso410 mg/l，feso410 mg/l，苏氨酸 1g/l，甜菜碱1 g/l，柠檬酸锌200mg/l，vh3 mg/l，v
b1
0.5 mg/l。
10.所述全营养培养基为：玉米浆干粉30 g/l，豆粕水解液30 ml/l，kh2po42.5 g/l，mgso4·
7h2o1.2 g/l，kcl1 g/l，柠檬酸锌200mg/l，mnso410 mg/l，feso410 mg/l，甲硫氨酸0.5 g/l，vh3 mg/l，v
b1
0.5 mg/l，辅酶q
10 0.1 mg/l。
11.所述发酵培养基和全营养培养基的体积比例为1:3；所述豆粕水解液的制备方法为：质量分数为20％的豆粕溶液在90℃下预热处理10min后，在温度40℃、ph3的条件下酶解3h，灭酶。
12.所述酶解使用的酶是酸性蛋白酶，添加量20000u/g，以干豆粕计。
13.本发明的有益效果主要包括：1.通过在发酵不仅流加菌种所需的碳源和氮源，而且在连续放料的同时，连续流加全营养培养基，并使流加培养基的速度与连续放料速度保持一致，以达到补充发酵罐中菌体所需的各类营养成分，延长菌体对数增长期，恒定发酵后期秏糖速率，保持培养基体积恒定，避免造成培养基浓度波动，影响菌体的生长情况的目的。
14.2.全营养流加主要是选择适当的全营养培养在合适的时间进行营养的补加，通过补加的营养来弥补菌体因生长代谢而消耗的营养物质，使得菌体一直处于适宜的生活环境中，从而提高菌体活力，防止菌体衰老，进而使得代谢流充分地流向谷氨酸，避免杂酸的产生；采取全营养流加的同时可以与营养分割发酵工艺进行结合，从而降低初始发酵培养基浓度，解除初期培养基营养过丰富，导致营养中毒，抑制菌体生长，同时防止过高的渗透压对菌体的抑制。
15.3.全营养培养基中通过添加柠檬酸锌和辅酶q
10
能够加强菌体细胞代谢，促进蛋白的合成，提高菌体细胞内关键酶的活力，有利于维持菌体细胞活力，进而提高谷氨酸产率。
附图说明
16.图1：不同分割比例对于菌体量的影响；图2：不同分割比例对于l-谷氨酸产量的影响；图3：不同开始流加时间对于菌体量的影响；图4：不同开始流加时间对于l-谷氨酸产量的影响；图5：不同流加浓度对于菌体量的影响；图6：不同流加浓度对于l-谷氨酸产量的影响；图7：不同持续流加时间对于菌体量的影响；图8：不同持续流加时间对于l-谷氨酸产量的影响；图9：两种不同发酵方式对于菌体量的影响；图10：两种不同发酵方式对于l-谷氨酸产量的影响。
具体实施方式
17.本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发
明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
18.实施例11.不同营养分割比例对于谷氨酸发酵的影响为了探究出谷氨酸发酵培养基的最适分割比例，本研究将谷氨酸发酵培养基按100:0（a）、75:25（b）、50:50（c）、25:75（d）四种比例的方式分割为基底培养基和流加培养基，进行谷氨酸发酵实验，结果如图1和2所示。
19.从图1中可以看出，策略a 的最大菌体量为47.3，随着基底培养基浓度的逐渐下降，菌体量增长速率明显加快，最大菌体量也随之增高，其中，策略b、策略c 和策略d 的最大菌体量分别为48.3、50.4、52.3，相较于策略a 分别提高了2.1%、6.5%、10.6%。
20.由图2分析可得，策略a 的l-谷氨酸最终产量为205 g/l，采用营养分割策略后，策略b、c、d 的l-谷氨酸最终产量分别为219 g/l、230 g/l、242 g/l，分别提高了6.8%、12.2%、18%。
21.综合上述结果，分析可得采用营养分割后，随着基底培养基浓度的降低，培养基中的富营养抑制和高渗透压抑制被解除，菌体活力明显上升，菌体量增长速率加快，同时当基底培养基中的营养物质被逐渐消耗后，流加培养基能及时补充菌体所需的营养物质，使得菌体一直处于最适的营养环境中，提高菌体的生长和发酵性能。
22.2.本研究以温度敏感型菌株为供试菌株，采用营养分割耦联全营养流加的方式，通过对全营养流加的时间，浓度及持续流加时间进行了探究，从而提高菌体的产酸能力，进一步提高谷氨酸产量。
23.开始流加时间对于谷氨酸发酵的影响本研究分别从发酵开始后的0 h（延滞期）、2 h（对数生长期）、10 h（稳定期）和18 h（衰亡期）开始流加体积分数为30%的流加培养基，通过对其菌体量和l-谷氨酸产量进行测定，从而明确不同的起始流加时间对于菌体生长和l-谷氨酸产量的影响，结果如图3 和图4 所示。a、b、c、d、e 表示0、2、10、18 h 开始流加和不流加发酵的od600 值。由图3可知，策略e 为不流加发酵，最大菌体量为51，菌体量在20 h 开始出现明显下降。采用全营养流加策略后，策略a、b、c、d 的最大菌体量分别达到了60、62.2、52.9、51.3，与策略e 相比分别提高了17.6%、22.0%、3.7%、1.2%；菌体量出现明显下降时间分别为24、24、22、20 h，分别向后推迟了4、4、2、0 h。
24.从图4（ a、b、c、d、e 表示0、2、10、18 h 开始流加和不流加发酵的l-谷氨酸产量）中可以看出策略e 的l-谷氨酸产量为189 g/l。采用全营养流加后，策略a、b、c、d 的谷氨酸产量分别为218、238、207、197g/l，提升了15.3%、25.9%、9.5%、4.2%。经过分析可知，0 h 开始流加和2 h 开始流加在菌体的对数生长期时，及时补充菌体消耗的必须营养物质，使得菌体一直处于最适生长状态，菌体生长速度加快；8 h 开始流加和20 h 开始流加因为在对数生长期没有流加，营养物质大量消耗，因此菌体生长缓慢。发酵后期，流加的全营养培养基补充了菌体代谢所需的必须营养物质，进而使得菌体活力得到增强，产酸时间延长，菌体下降速率减缓。选择合适的时间开始流加才能对菌体的增长和l-谷氨酸产量起到积极作用，因此，选择在2 h 开始流加全营养培养基。
25.流加浓度对于谷氨酸发酵的影响为了探究全营养培养基的流加浓度对于菌体发酵性能的影响，分别按全营养培养基体积分数的20%、40%、60%、80%、100%配制流加液，通过发酵罐自带的蠕动泵以0.1 r/min 的流加速度进行流加，保证流加浓度的稳定，从而确定最佳的流加浓度，结果如图5 和图6所示。a、b、c、d、e、f 表示流加浓度为20%、40%、60%、80%、100%和不流加发酵的od600 值。从图5中可以看出，策略f 为不流加发酵，最大菌体量为42，发酵结束的菌体量为32，菌体量下降幅度为10。采用全营养流加发酵时，随着流加浓度的增加，菌体量和菌体增长速率先升高后下降，策略a、b、c、d、e 最大菌体量分别为43.1、48.7、54.1、50.5、45.7，较策略f 分别增加了2.6%、16.0%、28.8%、8.8%；发酵结束的菌体量为34、42.1、50、46、38.4，菌体量下降幅度分别为9.1、6.6、4.1、4.5、7.3，较策略f 降低了9%、34%、59%、55%、27%。
26.由图6 （a、b、c、d、e、f 表示流加浓度为20%、40%、60%、80%、100%和不流加发酵的l-谷氨酸产量）可知，策略f的l-谷氨酸产量为216g/l，采用流加策略后，策略a、b、c、d、e 的l-谷氨酸产量分别为233、263、286、251、227 g/l，分别提高了7.8%、21.7%、32.4%、16.2%、5.1%。
27.由上述结果可知，随着流加体积分数的提高，菌体量和l-谷氨酸产量菌出现先提高后下降的现象，这是因为随着流加体积分数的提高，补充的营养物质逐渐能够弥补发酵液中营养物质的消耗，从而提高菌体活力，大幅度缓解了菌体的衰亡速率，当流加的体积分数超过60%时，底物抑制现象反而使得菌体内部各种酶的活力下降，从而使得菌体自身活力下降，这时，全营养流加对于菌体的活力提升反而不明显了。因此，综上所述，应选择60%的流加体积分数作为最佳流加的体积分数。
28.流加时长对于谷氨酸发酵的影响本研究从2 h 开始，用发酵罐自带的蠕动泵以0.1 r/min 的恒定流速流加体积分数为60%的全营养培养基，分别采取持续流加8、16、24、30 h 和不流加的方法，从而探究最佳持续流加时间。图7和图8为持续流加8、16、24、30 h 和不流加时，对发酵过程中菌体量及l-谷氨酸产量的测定结果。a、b、c、d、e 分别为流加8、16、24、30 h 和不流加的od600 值。
29.如图7所示，随着流加时长的改变，不同策略之间菌体量差异较大，策略e 为不流加发酵，最大菌体量为51，发酵后期菌体量为38，较最大菌体量下降幅度为13；不同流加策略a、b、c、d 的最大菌体量分别为63.1、66.8、67、67.3，较策略e 分别提高了23.9%、30.9%、31.3%、31.9%；发酵后期的菌体量分别为53.5、58.5、61.5、62，下降幅度分别为9.7、8.3、5.5、5.3，较策略e 分别降低了25.4%、36.2%、57.6%、59.2%。
30.图8（a、b、c、d、e 分别为流加8、16、24、30 h 和不流加的l-谷氨酸产量）所示为流加时长对于l-谷氨酸产量的影响，从图中可以看出，随着流加时长的增加，l-谷氨酸产量及l-谷氨酸生产速率逐渐提高，策略e，即不流加发酵，最终l-谷氨酸产量为216 g/l，策略a、b、c、d 的l-谷氨酸产量分别为253、276、292、294 g/l，分别提高了17.1%、27.7%、35.2%、36.1%。
31.通过分析发现，流加8h 时，全营养流加对于菌体活力的提升仅能维持在对数增长期，对于后续的稳定期的延长及菌体衰老死亡的缓解并不能起到作用；持续流加16 h 时，稳定期出现延长，但衰亡期的od600 的下降速率与不流加发酵相
比并没有明显下降；持续流加24 h 和30 h 结果差距不明显，说明当流加超过24h 后，全营养流加对于菌体发酵性能的提升效果大幅度下降，继续流加反而导致成本的增加，因此基本确定流加24 h 即可停止流加。
32.基于最优条件下的发酵验证依据上述实验所得的最佳流加发酵条件为2 h 开始流加，持续流加24 h 体积分数为60%的全营养流加培养基，在此优化条件下进行三批次的5l 发酵罐发酵验证，结果如图9 和图10 所示。a、b 分别为流加发酵和不流加发酵的od600 值。由图9可知，采用全营养流加策略后，2-8 h 菌体增长速度加快，最大菌体量为66，相较于不流加发酵的53，提高了26.4%；菌体量出现明显下降的时间由原来的20 h 推迟到了24 h；流加发酵菌体量下降幅度为8，较不流加发酵的10，降低了20%。表明了全营养流加通过补充菌体消耗的必需营养物质，确实起了加快菌体生长、维持菌体活力和缓解菌体衰老死亡的积极的作用。
33.由图10 （a、b 分别为流加发酵和不流加发酵的l-谷氨酸产量）可知，全营养流加发酵l-谷氨酸增长速率高于不流加发酵，主要是由于全营养流加发酵通过及时补加菌体生长代谢所消耗的营养物质，使得菌体活力提高，生长速度加快，同时由于菌体生长速度加快，菌体量更快的达到了转型菌体量，转型得以提前，此时菌体镜检发现此时部分菌体已经开始拉长、膨大转变为产酸型菌株，菌体的产酸速率也比不流加发酵要高。最终，流加发酵的l-谷氨酸产量为292 g/l，相较于不流加发酵的216 g/l，提高了35.1%。
34.全营养流加发酵对谷氨酸代谢流及副产物的影响前期研究工作表明6-磷酸葡萄糖、丙酮酸和异柠檬酸是温度敏感型谷氨酸棒杆菌合成l-谷氨酸代谢网络的关键节点。当emp 途径的流量超过tca 循环的代谢能力时,丙酮酸的进一步代谢受阻,故通过其它途径进行代谢,进而导致乳酸、l-丙氨酸等副产物的生成,造成碳架的浪费。因此,在发酵生产l-谷氨酸的过程中,适当减少emp 途径的代谢流量,降低副产物乳酸、l-丙氨酸、l-赖氨酸等的生成以及控制乙醛酸循环和tca 循环间的流量分配是提高l-谷氨酸发酵产酸率和糖酸转化率的关键。
35.本研究通过对发酵高峰期（4-20h）的葡萄糖消耗速率，胞外谷氨酸、乳酸、丙氨酸和赖氨酸的积累速率进行测定并进行代谢流分析，结果见表1，运用matlab 软件通过线形规划计算得到两种不同发酵方式l-谷氨酸发酵高峰期的代谢流分布。
36.表1两种发酵方式的代谢产物变化速率及代谢流量
采用全营养流加发酵时生成l-丙氨酸的代谢流降低了21.1%,生成乳酸的代谢流降低了19.4%,生成l-赖氨酸的代谢流降低了24.2%，生产的l-谷氨酸的代谢流增加了13.4%。过对上述结果分析发现，采用全营养流加策略，一方面及时流加的全营养培养基解决了发酵过程中必需营养物质缺乏的问题，提高了菌体活力，从而提升了tca 循环的速率和通量，使得丙酮酸不会被过多积累；另一方面，菌体活力的增加也缓解了菌体的衰老死亡，发酵后期菌体量下降幅度降低，因而产生的菌体蛋白也相对降低，可溶性蛋白的减少使得泡沫不再大量产生，保证氧气的传递效率，降低了乳酸脱氢酶等酶的活力，使得丙酮酸尽可能的流向谷氨酸。
37.实施例2发酵工艺将温度敏感型谷氨酸棒杆菌（保藏编号cgmcc no.5481）种子液的菌体量（od
600
）培养至达到40时，按15%的接种量接种到5l发酵罐的发酵培养基中，2 h 开始流加体积分数为60%的全营养培养基，持续流加24 h，停止流加，发酵总时间为32h；发酵培养基和全营养培养基的体积比例为1:3；从发酵12h时进行放料直至发酵结束，放料速度与流加培养基的速度保持一致；所述的发酵条件为：发酵初始温度为32℃，当发酵液中菌体量（od
600
）达到28时，将温度在30 min内升至37.5℃，1 h后升温至38℃；通过控制转速和通风将溶氧控制在20-40%；通过氨水控制ph在7.0左右。
38.所述的发酵培养基为葡萄糖60 g/l，玉米浆30 g/l，酵母膏5 g/l，豆粕水解液 20 ml/l，kh2po42.5 g/l，mgso4·
7h2o1.2 g/l，kcl1 g/l，mnso410 mg/l，feso410 mg/l，苏氨酸 1g/l，甜菜碱1 g/l，柠檬酸锌200mg/l，vh3 mg/l，v
b1
0.5 mg/l。
39.所述的全营养培养基为：玉米浆干粉30 g/l，豆粕水解液30 ml/l，kh2po42.5 g/l，mgso4·
7h2o1.2 g/l，kcl1 g/l，柠檬酸锌200mg/l，mnso410 mg/l，feso410 mg/l，甲硫氨酸0.5 g/l，vh3 mg/l，v
b1
0.5 mg/l，辅酶q
10 0.1 mg/l。
40.上述豆粕水解液制备方法为：质量分数为20％的豆粕溶液在90℃下预热处理
10min后，在水解工艺为温度40℃、ph3、酸性蛋白酶添加量20000u/g（以干豆粕计），水解时间3h时，灭酶。
41.最大菌体量为66，l-谷氨酸产量为292 g/l。
42.实施例3全营养培养基对比例1全营养培养基为：玉米浆干粉30 g/l，豆粕水解液30 ml/l，kh2po42.5 g/l，mgso4·
7h2o1.2 g/l，kcl1 g/l，mnso410 mg/l，feso410 mg/l，甲硫氨酸0.5 g/l，vh3 mg/l，v
b1
0.5 mg/l。
43.其余同实施例2。
44.经检测，最大菌体量为53，l-谷氨酸产量为268 g/l。
45.全营养培养基对比例2全营养培养基为：玉米浆干粉30 g/l，豆粕水解液30 ml/l，kh2po42.5 g/l，mgso4·
7h2o1.2 g/l，kcl1 g/l，柠檬酸锌200mg/l，mnso410 mg/l，feso410 mg/l，甲硫氨酸0.5 g/l，vh3 mg/l，v
b1
0.5 mg/l。
46.经检测，最大菌体量为59，l-谷氨酸产量为281 g/l。
47.全营养培养基对比例3全营养培养基为：玉米浆干粉30 g/l，豆粕水解液30 ml/l，kh2po42.5 g/l，mgso4·
7h2o1.2 g/l，kcl1 g/l，mnso410 mg/l，feso410 mg/l，甲硫氨酸0.5 g/l，vh3 mg/l，v
b1
0.5 mg/l，辅酶q
10 0.1 mg/l。
48.经检测，最大菌体量为56，l-谷氨酸产量为274 g/l。
49.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。