一种检测极性值和硫化氢含量的双功能荧光探针及其制备和应用的制作方法

1.本技术涉及荧光探针检测技术领域，具体涉及一种检测极性值和硫化氢含量的双功能荧光探针及其制备和应用


背景技术：

2.生物系统中功能蛋白的行为与极性密切相关，尤其是在细胞水平上。极性的异常变化与炎症、阿尔茨海默病、癌症等多种疾病密切相关。因此，实时监测极性，尤其是生物系统的极性，具有独特的意义。然而，由于其影响因素的复杂性和短期多样变化，无论是体外还是体内，极性的检测都面临着巨大的挑战。
3.相比于正常细胞，肿瘤细胞内环境的硫化氢含量较大，极性值较小。目前，多数探针只能单一检测细胞中的硫化氢含量或极性值，不利于疾病模型的多因素分析。因此，制备和发现可实现硫化氢含量和极性值检测的双功能探针具有重要的研究价值和应用价值。有鉴于此，特提出本发明申请。


技术实现要素：

4.本技术提供检测极性值和硫化氢含量的双功能荧光探针及其植被和应用，可实现硫化氢含量和极性值的双检测。
5.一种结构式如式(i)所示的化合物：
[0006][0007]
本技术还提供一种所述化合物的制备方法，包括：
[0008]
(1)将化合物(iii)和苯胺加入到溶剂中，95℃～105℃下搅拌反应8～12h，反应结束后将溶剂减压蒸馏得到化合物(ii)；
[0009]
(2)将化合物(ii)与亚硝酸钠及叠氮化钠溶解混合，冰浴下搅拌1～2h，然后经分离纯化即得结构式如式(i)所示的化合物；
[0010][0011]
可选的，所述化合物(iii)和苯胺的摩尔比为1:1～1.2。
[0012]
可选的，所述化合物(ii)、亚硝酸钠和叠氮化钠用盐酸水溶液溶解，反应体系的ph为中性。
[0013]
所述化合物(ii)、亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔比为1:1.2-2:1.5-3。
[0014]
化合物(i)具有可自由旋转的苯环，使得探针对极性值的响应能力提供可能；另一方面，该化合物的叠氮基团，作为荧光淬灭基团，并可以对硫化氢具有较强的专一性。本技术发明人在进行荧光检测实验中发现，该化合物同时具有极性值和硫化氢含量双响应功能。
[0015]
基于此，本技术还提供化合物(i)的如下用途：
[0016]
本技术提供一种如所述的化合物在制备检测极性值的产品中的用途。
[0017]
本技术提供一种如所述的化合物在制备检测硫化氢含量的产品中的用途。
[0018]
本技术提供一种如所述的化合物在制备检测极性值和硫化氢含量的产品中的用途。
[0019]
可选的，所述产品为检测溶液或细胞内极性值和/或硫化氢含量的荧光探针、试纸条或试剂盒。
[0020]
本技术提供一种检测溶液或细胞内极性值和/或硫化氢含量的试剂盒，包括结构式如式(i)所述的化合物。
[0021]
本技术还提供一种非诊断与治疗目的的极性值和/或硫化氢含量的检测方法，包括：
[0022]
将结构式如式(i)所示的化合物加入待测溶液中进行反应，得反应液；
[0023]
在激发波长为360nm、发射波长为470nm条件下检测所得反应液的荧光值，将所得荧光值带入标准曲线，计算得到待测溶液的极性值；
[0024]
在激发波长为370nm、发射波长为540nm条件下检测所得反应液的荧光值，将所得荧光值带入标准曲线，计算得到待测溶液的硫化氢含量。
[0025]
可选的，检测硫化氢含量时，所述化合物的加入量以待测溶液中化合物终浓度与待测溶液中硫化氢含量比计，为10μm：8-20μm。该配比范围内，荧光强度值与硫化氢含量之间呈线性相关，可提高检测的准确性。
[0026]
可选的，检测极性值时，所述化合物的加入量以待测溶液中化合物终浓度与待测溶液中介电常数(ε)计，为10μm：36～79。该配比范围内，荧光强度值与极性变化之间呈线性关系，提高检测的准确性。
[0027]
与现有技术相比本技术至少具有如下有益效果：
[0028]
双功能荧光探针(i)可在不同荧光通道下实现溶液极性值和硫化氢含量的分别检测，提高探针的利用率和细胞/活体可视化性能，具有良好的科研和实际应用价值。
附图说明
[0029]
图1为荧光探针(i)的核磁氢谱。
[0030]
图2为荧光探针(i)的核磁碳谱。
[0031]
图3为荧光探针(i)在不同1,4-二氧六环-水比例下的混合体系的荧光吸收光谱图。
[0032]
图4为荧光探针(i)在不同1,4-二氧六环-水比例下的混合体系的荧光发射光随介电常数(ε)的拟合曲线。谱图。
[0033]
图5为荧光探针(i)在激发波长为360nm、发射波长为470nm时，在不同1,4-二氧六
环-水比例下的混合体系的荧光强度随1,4-二氧六环含量的拟合曲线。
[0034]
图6为荧光探针(i)在激发波长为370nm、发射波长为540nm时，在不同硫化氢含量下的荧光吸收光谱图。
[0035]
图7为荧光探针(i)在激发波长为370nm、发射波长为540nm时，在不同硫化氢含量下的荧光发射光谱图。
[0036]
图8为荧光探针(i)在激发波长为370nm、发射波长为540nm时，在不同硫化氢含量下的荧光发射拟合图。
[0037]
图9为荧光探针(i)在不同溶剂中的荧光强度图。
具体实施方式
[0038]
下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
[0039]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。
[0040]
实施例1：双功能荧光探针(i)的制备
[0041][0042]
(1)化合物(ii)的制备
[0043]
向15ml试管中加入化合物(iii)(32mg,0.2mmol)、苯胺(28mg,0.3mmol)和h2o/dmso(1.0毫升，v/v＝2:1)。将上述混合物在100℃剧烈搅拌12小时。完成后，将反应混合物冷却至室温并加水稀释，混合物用乙酸乙酯萃取，收集的有机层用盐水洗涤，用硫酸镁干燥。减压除去溶剂后，得到粗产物化合物(ii)45mg，产率90％。
[0044]
(2)化合物(i)的制备
[0045]
将得到的化合物(ii)(25mg，0.1mmol)在1.2m hcl(2ml)水溶液中冰浴冷却至0℃。向该搅拌混合物中加入nano2(8mg，0.12mmol)的水溶液，在0℃下搅拌30分钟。然后滴加nan3(10mg，0.15mmol)的水溶液，在室温下搅拌1小时，反应监测结束之后，用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩。以石油醚:乙酸乙酯(3:1)为洗脱剂进行硅胶层析，得到淡黄色固体化合物(i)(25mg，收率90％)。
[0046]
该淡黄色固体化合物(i)的核磁氢谱如图1所示，核磁碳谱如图2所示。1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ7.86
–
7.80(m,3h),7.49
–
7.42(m,2h),7.36
–
7.33(m,2h),7.28(dd,j＝6.6,1.7hz,1h),3.44(s,3h).
13
c nmr(125mhz,common nmr solvents)δ164.08,153.77,139.60,133.20,132.93,130.43,130.41,128.28,128.22,126.35,126.28,124.15,120.13,116.63,116.57,29.90.
[0047]
实施例2：双功能荧光探针(i)(实施例1制备)(10μm)对极性响应的荧光光谱测试。
[0048]
准确称取一定量双功能荧光探针(i)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mm的母液，移液枪吸取4μl加入到4ml不同1,4-二氧六环-水比例中的混合溶剂中，摇荡混匀后加入到比色皿中，用荧光分光光度计测定探针(i)在不同混合体系中的荧光光谱。
[0049]
由图3和图4可知，随着混合液中1,4-二氧六环的比例(体积百分比)增加，溶液的极性降低，以360nm为激发波长、470nm为发射波长的荧光强度不断增加，证明了探针对溶液极性具有响应能力。图5可以看出，在随着1,4-二氧六环的比例增加，介电常数(ε)从7.1(1.4-二氧六环:水＝4:6)到79.2(1.4-二氧六环:水＝10:0)470nm处的荧光强度几乎呈线性变化(线性方程：y＝12.85x-404.8，r2＝0.993，x为介电常数ε)。
[0050]
实施例3：双功能荧光探针(i)(实施例1制备)(10μm)对硫化氢响应的荧光光谱测试。
[0051]
准确称取一定量双功能荧光探针(i)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mm的母液，移液枪吸取4μl加入到0.396ml不同硫化氢浓度的pbs缓冲液(最终硫化氢浓度分别为1μm，2μm，4μm，6μm，8μm，10μm，20μm，30μm，40μm)，在37℃下震荡两小时，摇荡混匀后加入到比色皿中，用荧光分光光度计测定探针(i)在不同混合体系中的荧光光谱。
[0052]
由图6和图7可知，随着混合液中硫化氢离子的含量升高，溶液在370nm处的吸收值逐渐增加，并且以370nm为激发波长、540nm为发射波长的荧光强度不断升高，证明了探针对硫化氢具有响应能力。
[0053]
如图8，待测溶液中加入的化合物终浓度为10μm，与待测溶液中硫化氢浓度8-20μm时呈很好的线性关系，能够更准确的检测出待测溶液中的硫化氢浓度。线性方程：y＝46.35x-303.24(r2＝0.990)，x为硫化氢浓度。
[0054]
实施例4：双功能荧光探针(i)(实施例1制备)的抗干扰能力的测试。
[0055]
准确称取一定量的荧光探针(i)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mm的母液，一方面，移液枪吸取4μl加入到0.396ml不同溶剂中(1至8分别为二氯甲烷，甲醇，乙醇，乙腈，四氢呋喃，二甲基亚砜，乙酸乙酯，1,4-二氧六环，)中，摇荡混匀、超声后加入到比色皿中，用荧光分光光度计以360nm为激发波长、470nm为发射波长进行测试。
[0056]
如图9所示(图中1至8分别为二氯甲烷，甲醇，乙醇，乙腈，四氢呋喃，二甲基亚砜，乙酸乙酯，1,4-二氧六环)，相比于1,4-二氧六环，其它被分析物的加入对探针在470nm处的荧光强度影响很小。以上实验结果证明探针对极性值和硫化氢含量均有很好的特异性。
[0057]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。