过表达选择的内源蛋白的经修饰的酵母细胞的制作方法

1.本发明的菌株和方法涉及过量生产选择的内源蛋白的酵母细胞，所述选择的内源蛋白具有高氨基酸含量的选择的氨基酸。所述酵母可以在常规生物乙醇生产设施中使用以产生醇以及增加量的选择的氨基酸，从而提高发酵产物和联产物如动物饲料成分的质量和商业价值。


背景技术：

2.许多国家从可发酵的底物(例如玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)制造燃料醇。根据可再生燃料协会(美国华盛顿特区)，仅仅在美国，2015年的燃料乙醇生产就接近150亿加仑。
3.除了生产约2.8加仑乙醇外，在干磨乙醇工厂中加工的一蒲式耳(56磅)玉米还产生约17.5磅的动物饲料。动物饲料通常呈具溶解物的干酒糟(distillers dried grains with solute,ddgs)的形式，并且代表耗尽淀粉的玉米部分加上用于发酵的酵母的生物质。按单位重量，ddgs对动物比未加工玉米更有营养，因为它更富含蛋白质和脂肪。除了ddgs，干磨乙醇工厂还能够生产用于动物饲料应用的其他富含蛋白质的玉米产物和联产物。
4.传统地，赖氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、和色氨酸已被分类为非反刍类动物的必需氨基酸。半胱氨酸和酪氨酸可以分别从甲硫氨酸和苯丙氨酸合成，但这两个前体都是必需氨基酸。如果不能在ddgs中足量供应这些氨基酸以满足饲料转化预期，则必须补充这些氨基酸。特别地，合成的赖氨酸可意味着动物饲料的一个重要成本。
5.存在对改善或维持从含淀粉原料生产醇同时提高动物饲料联产物的营养价值的方法的需要。


技术实现要素：

6.描述了涉及过量生产选择的内源蛋白的酵母细胞的组合物和方法，所述选择的内源蛋白具有高氨基酸含量的选择的氨基酸。所述酵母可以在常规生物乙醇生产设施中使用以产生醇以及增加量的选择的氨基酸，从而提高发酵产物和联产物如动物饲料成分的质量和商业价值。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
7.1.在一个方面，提供了一种用于在制备食物或饲料组合物中使用的微生物，所述微生物包含提高编码蛋白质的内源基因的表达的遗传修饰，所述蛋白质相对于所述蛋白质的氨基酸总含量具有升高比率的预选择氨基酸，其中所述预选择氨基酸赋予所述食物或饲料组合物相较于包含缺少所述遗传修饰的、在其他方面相同的微生物或从其衍生的产物的在其他方面相同的食物或饲料组合物的营养益处。
8.2.在如段落1所述的微生物的一些实施例中，所述内源基因在引入所述遗传修饰之前天然存在于所述微生物中。
9.3.在如段落1或2所述的微生物的一些实施例中，所述遗传修饰是引入表达盒，所述表达盒包含所述内源基因的另外的拷贝。
10.4.在如段落1或2所述的微生物的一些实施例中，所述遗传修饰是引入更强的启动子，所述更强的启动子可操作地连接至所述内源基因。
11.5.在如段落1或2所述的微生物的一些实施例中，所述遗传修饰是所述内源基因的表达的天然存在的负调节物缺失，或其中所述遗传修饰提高所述内源基因的表达的天然存在的正调节物的表达。
12.6.在如段落1-5中任一项所述的微生物的一些实施例中，预选择氨基酸相对于所述蛋白质的氨基酸总含量的所述升高比率，与所述预选择氨基酸相对于所述微生物生产的所有蛋白质的氨基酸总含量的比率相比，是至少1.2。
13.7.在如段落1-6中任一项所述的微生物的一些实施例中，所述生物是产乙醇菌。
14.8.在如段落1-7中任一项所述的微生物的一些实施例中，所述生物是酵母属(saccharomyces)物种。
15.9.在如段落1-8中任一项所述的微生物的一些实施例中，所述微生物不包含为赋予所述食物或饲料组合物营养益处的目的而引入的编码蛋白质的外源基因，所述蛋白质相对于所述蛋白质的氨基酸总含量具有升高比率的预选择氨基酸。
16.10.在如段落1-9中任一项所述的微生物的一些实施例中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因、磷酸转酮酶途径的一个或多个基因、甘油途径和/或乙酰辅酶a途径中的改变、或用于制备乙醇的替代途径(alternative pathway)。
17.11.在另一个方面，提供了一种用于在食物或饲料组合物中提高微生物、或从其衍生的产物的营养价值的方法，所述方法包括向所述微生物引入提高编码蛋白质的内源基因的表达的遗传修饰，所述蛋白质相对于所述蛋白质的氨基酸总含量具有升高比率的预选择氨基酸，其中所述预选择氨基酸赋予所述食物或饲料组合物相较于包含缺少所述遗传修饰的、在其他方面相同的微生物或从其衍生的产物的在其他方面相同的食物或饲料组合物的营养益处。
18.12.在如段落11所述的方法的一些实施例中，所述内源基因在引入所述遗传修饰之前天然存在于所述微生物中。
19.13.在如段落11或12所述的方法的一些实施例中，所述遗传修饰是引入表达盒，所述表达盒包含所述内源基因的另外的拷贝。
20.14.在如段落11或12所述的方法的一些实施例中，所述遗传修饰是引入更强的启动子，所述更强的启动子可操作地连接至所述内源基因。
21.15.在如段落11或12所述的方法的一些实施例中，所述遗传修饰是所述内源基因的表达的天然存在的负调节物缺失，或其中所述遗传修饰提高所述内源基因的表达的天然存在的正调节物的表达。
22.16.在如段落11-15中任一项所述的方法的一些实施例中，预选择氨基酸相对于所述蛋白质的氨基酸总含量的所述升高比率，与所述预选择氨基酸相对于所述微生物生产的所有蛋白质的氨基酸总含量的比率相比，是至少1.2。
23.17.在如段落11-16中任一项所述的方法的一些实施例中，所述微生物是产乙醇菌。
24.18.在如段落11-17中任一项所述的方法的一些实施例中，所述生物是酵母属物种。
25.19.在如段落11-18中任一项所述的方法的一些实施例中，所述微生物不包含为赋予所述食物或饲料组合物营养益处的目的而引入的编码蛋白质的外源基因，所述蛋白质相对于所述蛋白质的氨基酸总含量具有升高比率的预选择氨基酸。
26.20.在如段落11-19中任一项所述的方法的一些实施例中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因、磷酸转酮酶途径的一个或多个基因、甘油途径和/或乙酰辅酶a途径中的改变、或用于制备乙醇的替代途径。
27.根据包括任何附图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。
具体实施方式
28.i.概述
29.描述了涉及具有遗传突变的酵母的方法，所述方法涉及过量生产选择的内源蛋白的酵母细胞，所述选择的内源蛋白具有高氨基酸含量的选择的氨基酸。所述酵母可以在常规生物乙醇生产设施中使用以产生醇以及增加量的选择的氨基酸，从而提高发酵产物和联产物如动物饲料成分的质量和商业价值。
30.ii.定义
31.在详细地描述本发明的菌株和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合这些术语在相关领域中所用的普通含义。
32.如本文所使用的，“醇”是指其中羟基官能团(-oh)与饱和碳原子结合的有机化合物。
33.如本文所使用的，“酵母细胞”、“酵母菌株”、或简称“酵母”是指来自子囊菌门(ascomycota)和担子菌门(basidiomycota)的生物。示例性酵母是来自酵母目(saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的特定实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(s.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物以及用于生产可饮用醇的生物，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。
34.如本文所使用的，短语“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”或类似短语(参见上文)是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。
35.如本文所使用的，短语“基本上无活性”或相似短语意指指定活性在混合物中不可检测或以不会干扰混合物的预期目的的量存在。
36.如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从n-末端到c-末端方向进行呈现。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖天然地修饰的或通过干预(例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合)而修饰的氨基酸聚合物。所述定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
37.如本文所使用的，“内源”基因或蛋白质源自所讨论的系统(如酵母细胞)内部。这样的基因或蛋白天然存在并没有人类干预。如本文所使用的，即使内源基因或蛋白质可能
过表达，如果所述基因或蛋白质的一些量是天然存在的，那么仍认为其是内源的。
38.如本文所使用的，“外源”基因或蛋白质源自所讨论的系统(如酵母细胞)外部。这样的基因或蛋白质非天然存在并必须被引入，例如，通过人类干预引入。如本文所使用的，即使表达盒可能被引入以过量生产内源基因或蛋白质，如果一些量是天然存在的，那么不认为所述基因或蛋白质是外源的。
39.如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关的蛋白质”。此类蛋白质可源自不同属和/或物种的生物、或甚至不同纲的生物(例如，细菌和真菌)。相关的蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。
40.如本文所使用的，术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白质。这并不旨在意味着同源物必定是进化上相关的。因此，所述术语旨在涵盖从不同生物获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白作为参考蛋白诱导相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经过工程化以产生具有一种或多种所希望的活性的酶。
41.序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何适合方法确定(参见，例如，smith和waterman(1981)adv.appl.math.[应用数学进展]2:482；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.[分子生物学杂志],48:443；pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:2444；威斯康星遗传学软件包(wisconsin genetics software package)(遗传学计算机组公司(genetics computer group)，威斯康星州麦迪逊(madison,wi))中的程序，如gap、bestfit、fasta和tfasta；以及devereux等人(1984)nucleic acids res.[核酸研究]12:387-95)。
[0042]
例如，pileup是确定序列同源性水平的有用程序。pileup使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以绘制显示用于创建所述比对的聚类关系的一个树。pileup使用feng和doolittle的渐进比对方法的简化(feng和doolittle(1987)j.mol.evol.[分子进化杂志]35:351-60)。所述方法类似于higgins和sharp描述的方法((1989)cabios[计算机在生物学中的应用]5:151-53)。有用的pileup参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是blast算法，由以下描述：altschul等人((1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志]215:403-10)以及karlin等人((1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90:5873-87)。一个特别有用的blast程序是wu-blast-2程序(参见，例如，altschul等人(1996)meth.enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“w”、“t”、以及“x”确定了所述比对的灵敏度与速度。所述blast程序使用字长(w)为11、blosum62得分矩阵(参见，例如，henikoff和henikoff(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(b)为50、期望值(e)为10、m'5、n'-4、以及两条链的比较作为默认值。
[0043]
如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同
一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的clustal w算法计算序列同一性百分比。参见thompson等人(1994)nucleic acids res.[核酸研究]22:4673-4680。clustal w算法的默认参数是：
[0044][0045][0046]
两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽的区别仅在于保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。
[0047]
如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白质或rna表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予指定表型。
[0048]
如本文所使用的，术语“野生型”和“天然的”可互换使用，并是指天然发现的基因、蛋白质或菌株。
[0049]
如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。这样的蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、选择性标记等，并且能以高水平表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的经修饰的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。
[0050]
如本文所使用的，术语“表达多肽”和相似术语是指使用细胞的翻译机器(例如，核糖体)产生多肽的细胞过程。
[0051]
如本文所使用的，“过表达多肽”、“过量生产多肽”、“提高多肽的表达”和相似术语是指与不包括指定遗传修饰的亲本或“野生型”细胞所观察到的相比，以高于正常水平的水平表达多肽。
[0052]
如本文所使用的，“表达盒”是指包括启动子、和氨基酸编码区以及终止子(即，启动子::氨基酸编码区::终止子)以及允许所述编码多肽在细胞中生产所需的其他核酸序列的dna片段。表达盒可以是外源的(即，引入细胞中)或内源的(即，存在于细胞中)。
[0053]
如本文所使用的，“基因的缺失”是指所述基因从宿主细胞的基因组中除去。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如，增强子元件)时，基因的缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如，包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失，但未要求非相邻控制元件的缺失。
[0054]
如本文所使用的，“基因的破坏”泛指任何实质上阻止细胞在宿主细胞中产生功能性基因产物(例如，蛋白质)的遗传的或化学的操作(即，突变)。示例性破坏方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另一调节元件)缺失、或其诱变，其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒位、及其组合和变化，任何这些突变基本上阻止功能基因产物的产生。也可以使用rnai、反义、或任何其他消除基因表达的方法破坏基因。可以通过非相邻控制元件的缺失或遗传操作来破坏基因。
[0055]
如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换地使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。
[0056]
如本文所使用的，“主要遗传决定子”是指基因或其遗传操作，所述基因或其遗传操作对于在不存在其他基因或其遗传操作的情况下赋予特定表型是必要和充分的。然而，特定基因对于赋予特定表型是必要和充分的，这并不排除通过进一步的遗传操作可以实现对表型产生另外的作用的可能性。
[0057]
如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(例如酶活性、结合活性、表面活性特性等)的蛋白质，并且其未被诱变、截短、或以其他方式修饰以消除或减少此活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。
[0058]
如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(典型地是蛋白质)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，所述破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
[0059]
如本文所使用的，如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以阻止产生呈现出野生型蛋白质的活性特征的功能性蛋白/多肽，则对所述酵母细胞已经进行了“修饰以阻止产生指定蛋白”。这样的修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码的多肽缺乏前述活性的基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因修饰、及其组合。
[0060]
如本文所使用的，“发酵液”是用酵母发酵后但蒸馏前的乙醇生产设施的产物。
[0061]
如本文所使用的，“全釜馏物”是蒸馏后乙醇生产设施的副产物。
[0062]
如本文所使用的，“稀釜馏物”是分离固体材料后全釜馏物的液体部分。
[0063]
如本文所使用的，“酒糟(dg)”是全釜馏物的固体/浆料组分。
[0064]
如本文所使用的，“干酒糟(ddg)”是已干燥的dg。
[0065]
如本文所使用的，“具溶解物的干酒糟(ddgs)”是与浓缩的稀釜馏物一起进行干燥以增加营养价值的dg。
[0066]
如本文所使用的，“湿的”蒸馏副产物含有按重量计至少20％的水。
[0067]
如本文所使用的，“干的”蒸馏副产物含有按重量计少于20％的水。
[0068]
如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。
[0069]
如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。
[0070]
如本文所使用的，除非上下文另外明确指明，否则单数冠词“一个/种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物。本文引用的所有参考文献均通过援引以其全文特此并入。除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
[0071]
℃摄氏度
[0072]
dg酒糟
[0073]
ddg干酒糟
[0074]
ddgs具溶解物的干酒糟
[0075]
dna脱氧核糖核酸
[0076]
dp聚合度
[0077]
ds干固体
[0078]
etoh乙醇
[0079]
g或gm克
[0080]
g/l克/升
[0081]
ga葡糖淀粉酶
[0082]
gau/gds葡糖淀粉酶单元/克干固体
[0083]
hplc高效液相色谱
[0084]
hr或h小时
[0085]
kda千道尔顿
[0086]
m摩尔
[0087]
mg毫克
[0088]
ml或ml毫升
[0089]
ml/min毫升/分钟
[0090]
mm毫摩尔
[0091]
n当量浓度
[0092]
na不适用
[0093]
pcr聚合酶链式反应
[0094]
ppm百万分率
[0095]
sapu/gds蛋白酶单元/克干固体
[0096]
sscu/gds真菌α-淀粉酶单元/克干固体
[0097]
δ与缺失有关
[0098]
μg微克
[0099]
μl和μl微升
[0100]
μm和μm微摩尔
[0101]
iii.表达增加量的预选择的内源蛋白的酵母细胞
[0102]
美国专利号7,309,602描述了一种通过向酵母细胞中引入编码包含必需氨基酸的多肽的重组表达载体来提高发酵残留物的价值的方法。而用于产生含有增加量的有价值氨
基酸的发酵产物或联产物的合理策略通常需要大量的工作来鉴别在酵母中表达良好且耐受良好的有价值的蛋白质。
[0103]
本发明的组合物和方法代表了生产有价值的蛋白质的改进的策略。并非选择含有高比率目的氨基酸的外源目的蛋白，而是使用关于内源酵母蛋白的氨基酸含量的知识来选择能够过表达以生产相似结果的蛋白质。
[0104]
可以使用易得的信息来测定如酿酒酵母的生物产生的每种蛋白质的氨基酸含量。作为实例，已发现作为总残基中的分数的赖氨酸在所有酿酒酵母蛋白中的平均出现率是0.08(或8％)，其明显大于如果所有氨基酸残基都均等占比时的5％。表1中示出了在本研究中鉴别的五个富含赖氨酸的蛋白质。这些蛋白富含赖氨酸，并且如果它们过表达，基于它们的注释(参见，如下)，也似乎不可能对细胞具有毒性。指定了编码所述蛋白质的基因、所述蛋白质的全长、赖氨酸残基的数量和赖氨酸分数(表示为k/aa)。
[0105]
表1.酿酒酵母中选择的富含赖氨酸的蛋白质
[0106]
蛋白质基因k/aaloc1yfr001w0.200mrpl24ymr193w0.151bud13ygl174w0.146syf2ygr129w0.144smb1yer029c0.142
[0107]
可以对任何预选择氨基酸(最重要的是动物所必需的氨基酸)进行相似分析。出于本研究的目的，汇编了来自5,895种酿酒酵母蛋白质的氨基酸组成的数据，这允许了鉴别富含任何一种或多种选择的氨基酸的蛋白质。
[0108]
在一些实施例中，就选择的氨基酸作为总氨基酸的分数而言，与所述氨基酸在总细胞蛋白中的分数相比，所述预选择氨基酸在内源蛋白中的升高比率是至少1.2、至少1.4、至少1.6、至少1.8、或甚至至少2.0。在一些实施例中，就预选择氨基酸在总细胞蛋白中的量而言，所述氨基酸在内源蛋白中的量高至少20％、至少40％、至少60％、至少80％、或甚至至少100％。
[0109]
在一些实施例中，与通过在相同条件下生长的亲本细胞生产的富含选择的氨基酸的内源蛋白的量相比，通过经修饰的细胞生产的富含选择的氨基酸的内源蛋白表达增加至少0.5倍、至少1.0倍、至少1.5倍、至少2.0倍、至少3.0倍、或更多。
[0110]
优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作实现了增加的富含选择的氨基酸的内源蛋白表达，所述遗传操作与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。
[0111]
在一些实施例中，本发明的组合物和方法涉及向酵母细胞中引入核酸，所述核酸能够指导富含选择的氨基酸的内源蛋白的过表达或增加的表达。特定的方法包括但不限于(i)将用于产生所述多肽的外源表达盒引入宿主细胞中，任选地还有内源表达盒，(ii)用允许产生增加量的多肽的内源盒取代外源表达盒，(iii)修饰内源表达盒的启动子以增加表达，(iv)增加用于富含赖氨酸的内源多肽过表达的相同或不同盒的拷贝数，和/或(v)修饰宿主细胞的任何方面以增加所述多肽在宿主细胞中的半衰期。
[0112]
在一些实施例中，被修饰的亲本细胞已经包括目的基因，例如编码可选择标记、碳
水化合物加工酶或其他多肽的基因。在一些实施例中，随后将引入的基因引入经修饰的细胞中。
[0113]
在一些实施例中，被修饰的亲本细胞已经包括增加乙醇生产的工程化的目的途径(如pkl途径)，或增加醇生产的任何其他途径。
[0114]
如所例示的，当预选择氨基酸是赖氨酸时，可能的内源蛋白包括loc1(60s核糖体亚基组装/输出蛋白)、smb1(核小核糖核蛋白相关蛋白)、bud13(前mrna剪接因子(pre-mrna-splicing factor))、mrpl24(线粒体核糖体蛋白)和syf2(前mrna剪接因子)。
[0115]
示例的loc1多肽的氨基酸序列如下seq id no:2所示：
[0116][0117]
示例的smb1多肽的氨基酸序列如下seq id no:4所示：
[0118][0119]
示例的bud13多肽的氨基酸序列如下seq id no:6所示：
[0120][0121]
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，在经修饰的酵母细胞中过表达的loc1、smb1或bud13多肽的氨基酸序列与seq id no:2、seq id no:4或seq id no:6具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
[0122]
在一些实施例中，经修饰的细胞包括增加赖氨酸生产的其他基因或其他修饰。
[0123]
iv.富含选择的氨基酸的内源蛋白与有益于醇生产的突变的组合表达
[0124]
在一些实施例中，除了生产增加量的富含选择的氨基酸的内源蛋白之外，本发明
的经修饰的酵母细胞进一步包括有益于醇生产的另外的修饰。
[0125]
在特定的实施例中，经修饰的酵母细胞包含由引入异源磷酸转酮酶(pkl)基因、异源磷酸转乙酰酶(pta)基因和异源乙酰化乙酰基脱氢酶(aadh)基因产生的人工或替代乙醇生产途径，如wo 2015148272(miasnikov等人)中所述，将这些酶引入使通道碳通量远离甘油途径并且朝向乙酰辅酶a的合成，所述乙酰辅酶a然后转化为乙醇。
[0126]
所述经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径减弱的突变，已知所述突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因gpd1、gpd2、gpp1和/或gpp2中的一个或多个来降低或消除内源nad依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(gpd)或磷酸甘油磷酸酶(gpp)活性。参见例如美国专利号9,175,270(elke等人)、8,795,998(pronk等人)和8,956,851(argyros等人)。
[0127]
经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶a合酶(也称为乙酰辅酶a连接酶)活性(ec 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸盐并将其转化为ac-coa。这避免了乙酸盐对酵母细胞生长的不良影响，并且可以进一步有助于醇产量的提高。提高乙酰辅酶a合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶a合酶基因引入细胞、提高内源乙酰辅酶a合酶基因的表达等来实现。用于引入细胞中的特别有用的乙酰辅酶a合酶可以从康斯力鬃毛甲烷菌(methanosaeta concilii)(uniprot/trembl登录号：wp_013718460)获得。这些酶的同源物，包括与上述来自康斯力鬃毛甲烷菌的乙酰辅酶a合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、以及甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶，也可用于本发明的组合物和方法中。
[0128]
在一些实施例中，经修饰的细胞可进一步包括编码具有nad

依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的这样的基因的引入。
[0129]
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可进一步过表达糖转运体样(stl1)多肽(参见，例如，ferreira等人(2005)mol biol cell[细胞分子生物学]16:2068-76；等人(2015)mol microbiol[分子微生物学]97:541-59以及wo 2015023989 a1)，从而增加乙醇生产并且减少乙酸盐。
[0130]
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可以进一步过表达聚腺苷酸结合蛋白，例如pab1，从而增加醇生产并且减少乙酸盐生产。
[0131]
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
[0132]
在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，所述酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例
中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自由以下组成的组：pdc1、pdc5、pdc6、及其组合。在一些实施例中，所述酵母细胞在编码fra2、ald6、adh1、gpd2、bdh1、和ymr226c的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。
[0133]
v.富含选择的氨基酸的内源蛋白与其他有益突变的组合表达
[0134]
在一些实施例中，除了生产增加量的富含选择的氨基酸的内源蛋白、富含赖氨酸的内源蛋白(任选地与有益于醇生产的遗传修饰组合)之外，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括任何数量的编码目的蛋白的另外的目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入另外的目的基因，所述遗传操作导致赖氨酸反馈抑制降低或醇生产增加。目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自由以下组成的组的酶：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化并以其他方式修饰。
[0135]
vi.适合修饰的酵母细胞
[0136]
酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(kluyveromyces)、拉茜斯酵母属(lachancea)和裂殖酵母属(schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需的特征，诸如高乙醇生产、快速生长速率等。许多酵母已被基因工程化以产生异源酶或甚至包括异源途径。
[0137]
vii.底物和条件
[0138]
从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与这样的底物和条件完全相容。
[0139]
乙醇生产工艺存在多种变化，包括冷蒸煮或无蒸煮，涉及处于糊化温度或低于糊化温度下的液化、同时糖化和发酵、分馏工艺等。预期上述工艺均与本发明的组合物和方法相容。
[0140]
viii.发酵产物和联产物
[0141]
典型的醇发酵产物包括具有与碳原子结合的羟基官能团(-oh)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。
[0142]
醇生产(以及特别是干磨乙醇生产)的有价值的副产物(或联产物)是动物饲料产品，通常呈干酒糟(ddg)或更常见地，具溶解物的干酒糟(ddgs)的形式。这些动物饲料产品在许多方面比用于乙醇生产的初始原料更有营养，因为其中的碳水化合物消耗殆尽，但富含来自原料和发酵生物(即，产乙醇菌(ethanologen))的氨基酸。
[0143]
ddgs或其他玉米联产物的特定氨基酸组成对动物饲料的质量十分重要，因为一些氨基酸远比其他氨基酸更重要。赖氨酸是大多数农场动物的必需氨基酸，如果没有通过ddg、ddgs或其他发酵后联产物适当地足量提供，则必须补充赖氨酸以使饲料转化率最大
化。合成的赖氨酸昂贵，并且意味着动物饲料的一个重要成本。
[0144]
因为酵母代表发酵后产物中的重要组分，因此酵母的氨基酸含量显著影响发酵液、全釜馏物、稀釜馏物、干酒糟、具溶解物的干酒糟、浓缩酒糟可溶物或其他含蛋白质的发酵后联产物的氨基酸含量。用本发明的酵母替代常规酵母提高了这样的发酵后产物中赖氨酸的量，从而提高了它们作为动物饲料产品的价值。
[0145]
使用本发明的经修饰的酵母，可以实现赖氨酸增加至少0.2倍、至少0.5倍、至少1.0倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.7倍、至少2.0倍、或更多。
[0146]
鉴于本说明书，本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员将是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制所述菌株和方法。
[0147]
实例
[0148]
实例1：编码富含赖氨酸的内源蛋白的基因的选择
[0149]
分析由在酿酒酵母基因组中的内源基因编码的每种蛋白质的氨基酸含量以鉴别富含赖氨酸的天然蛋白。发现作为总残基中的分数的赖氨酸(即，k/aa)在蛋白质中的平均出现率是0.08。因此，酿酒酵母蛋白质典型地具有8％赖氨酸含量，其大于如果所有氨基酸残基都均等占比时的5％。在下表2中汇总了用于赖氨酸过量生产的前五位的候选基因。这些基因不一定具有最高的k/aa；然而，基于公开的注释，如果过表达，这些基因非常可能是细胞耐受的。
[0150]
表2.酿酒酵母中选择的富含赖氨酸的蛋白质
[0151]
基因蛋白质aa长度k数量k/aayfr001wloc1205410.200ymr193wmrpl24259390.151ygl174wbud13267390.146ygr129wsyf2216310.144yer029csmb1197280.142
[0152]
在fermax
tm gold(玛翠公司(martrex inc.)，美国明尼苏达州(minnesota,usa)；本文中缩写为“fg”)的有氧生长过程中在各个时间测定表2中每个基因的表达，fg是用于谷物乙醇工业的众所周知的发酵酵母。根据trizol法(生命技术公司(life-tech)，马里兰州罗克维尔(rockville,md))从单个样品中制备rna。然后使用qiagen rneasy迷你试剂盒(凯杰公司(qiagen)，马里兰州日耳曼敦(germantown,md))清洁所述rna。使用应用生物系统公司(applied biosystems)的大容量cdna逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific)，特拉华州威明顿市(wilmington,delaware))从单个样品的总mrna中生成cdna。使用鸟枪法(shotgun method)对制备的每个样品的cdna进行测序，然后相对于单个基因进行定量。在表3中报告的结果为每千碱基千万转录物的读数(rpk10m)，并可以用于对样品中每个转录物的量进行定量。
[0153]
表3.fg中的赖氨酸蛋白表达
[0154][0155]
基于几个因素(包括所述蛋白质的赖氨酸含量、表达水平、基因的全长和易于通过pcr扩增)，为进一步研究选择了三个基因，即，(i)编码loc1(60s核糖体亚基组装/输出蛋白)的yfr001w、(ii)编码smb1(核小核糖核蛋白相关蛋白)的yer029c、和(iii)编码bud13(前mrna剪接因子)的ygl174w。
[0156]
实例2：在酵母中过量生产富含赖氨酸的蛋白质
[0157]
使用标准分子技术，使用来自在预选择基因座处插入的表达盒的强启动子(fba1)在fg中过表达loc1、bud13和smb1。所有程序均基于可公开获得的yfr001w、yer029c和ygl174w的核酸序列，这些序列在下文(5'至3')提供：
[0158]
》loc1yfr001w sgdid:s000001897,chrvi:149110..149724(seq id no:1)：
[0159]
atggcaccaaagaaaccttctaagagacaaaatctgagaagagaagtcgcaccagaggtgtttcaagattcacaagctaggaatcaactagcgaatgttcctcatcttaccgaaaaatctgcccagcgtaagccttctaaaaccaaggttaaaaaagaacagtctttggctagactttatggtgcgaagaaggacaagaaggggaaatattctgagaaagacttgaatattccaacactcaatagagctatcgttccgggtgttaaaataaggaggggaaagaaaggtaagaaattcattgctgataacgacactctgactttaaaccgtttaataacaactattggtgacaagtacgacgatatagctgagagtaagcttgaaaaggctagaagattagaagagatacgagaattgaaaagaaaggaaattgaaagaaaggaagcgcttaaacaagataaactagaagaaaaaaaagacgagattaaaaagaagtcttctgtcgcaaggactatacgtagaaagaataaacgtgatatgttgaaaagtgaagcaaaagctagtgaaagtaaaactgaaggaaggaaggtaaaaaaagtctcatttgctcaatag
[0160]
》smb1yer029c sgdid:s000000831,chrv:212587..213177(seq id no:3)：
[0161]
atgagcaaaatacaggtggcacatagcagccgactagccaaccttattgattataagctgagggttctcactcaagatggccgcgtttacatcgggcaattgatggcatttgataaacatatgaatttagtgttgaatgagtgtatagaagagagggtacccaaaactcaactagataaattaagaccgagaaaagattcaaaagatggaaccactttgaacatcaaggtagaaaaaagagtgttgggactgactatactaagaggagaacagatcttatccacagtggtggaggataagccgctactatccaagaaggaaagactagtgagagataaaaaggaaaagaaacaagcgcaaaagcagacgaaactaagaaaagagaaagagaaaaagccgggaaagatcgctaaacctaacacggccaatgcgaagcatactagtagcaattctagggagattgcccaaccatcgtcgagcagatacaatggtggcaacgataatatcggcgcaaataggtcgaggtttaataatgaagcgccccctcaaacaaggaagtttcagcccccaccaggttttaaaagaaaataa
[0162]
》bud13ygl174w sgdid:s000003142,chrvii:174545..175345(seq id no:5)：
[0163]
atggcattgcatcagtatttatcagagacttatgggcccacgaaacccaaaaataagacgaaaaagaagaagaaagagtcaaaatcagacgctaactcagacaaaacttctttgatagtaaaagaacggctaagtacactgcaacaagaacaggagaagtcaggagttgcttcattcagcaagtttgacaaacaaaaaagcaagaatatatggaagaacctggaaacaaacgagctttcccatgcaataacacatccttccgcatcgtcaattactggcaacgaaagcaagaacgatctaaaggaaatcagggctcaagagccacttgtcacagtagcagacaaatcgaaaacacgaaaaaccatatacagagacgctcaaggtcacaagattcaggaagattccaagatagacgattctagttttagtcgatctaaatatgaagatgagaaagccgcggaaagagagcaatacctgaaaaatttgaatatgggagacgtgcaaaagcttggaataaatgtagatgcacatgataagaagaaaaatcaaactgcctcgagtctgacgatagaagaccctgcaataacatttacacatgacaaagaaagaactgtaaaaacatctttactgggccgcaagctttatgataagccagcacctgagaacaggtttgccattatgcctgggtcaagatgggacggtgtccacagatcaaatggctttgaagaaaaatggtttgctaagcaaaatgagatcaatgagaagaaagtgcaaagctacaccctacaggaggattattga
[0164]
所述yfr001w基因编码60s核糖体亚基组装/输出蛋白loc1(uniprotkb-p43586)，其如下seq id no:2所示：
[0165][0166]
所述yer029c基因编码核小核糖核蛋白相关蛋白b(smb1；uniprotkb-p40018)，其如下seq id no:4所示：
[0167][0168]
所述ygl174w基因编码前mrna剪接因子cwc26(bud13；uniprotkb-p46947)，其如下seq id no:6所示：
[0169][0170][0171]
通过菌落pcr确定表达盒在jen1d基因座的插入。使经修饰的酵母菌株在非选择性培养基中生长，以除去赋予用于选择转化体的卡那霉素抗性的质粒，产生了与亲本酵母相
techniques for monitoring the nutritional value of animal meals[监测动物的膳食营养价值的常规技术],doctoral thesis at north carolina state university[北卡罗来纳州立大学博士论文])，将ddgs样品与胃蛋白酶和胰液素共同孵育。简言之，将0.33g的ddgs与3.33ml的0.05m柠檬酸盐缓冲液(ph 2)和大约0.012g胃蛋白酶(来自猪胃粘膜)一起以》400u/mg蛋白添加至20ml闪烁瓶中。允许混合物在200rpm振荡下在38℃孵育约24小时。此后，向各小瓶中添加5ml的磷酸盐缓冲液(0.2m，ph 11.5，含有0.025％w/w叠氮化钠)和大约0.023g胰液素(来自猪胰腺，4 x uxp规格)。将小瓶放回38℃培养箱中(以200rpm振荡)66小时左右。此后，从每个小瓶中取样，使样品向下旋转通过0.2μm过滤器，并通过hplc分析游离氨基酸。
[0184]
与通过使用亲本fg菌株发酵生产的发酵联产物中的赖氨酸含量相比，通过使用fg-loc1
过
菌株发酵生产的发酵联产物中的生物可利用的赖氨酸含量多1.08倍(即，多8％)。