一种流感病毒的致弱方法及流感致弱病毒株和应用与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种流感病毒的致弱方法及流感致弱病毒株和应用。


背景技术：

2.甲型流感(influenza a，ia)是一种高度传染性的急性呼吸道疾病，由甲型流感病毒(influenza aviruses，iav)引起，是属于正粘病毒科的分节段负链rna病毒。疫苗接种是预防ia感染的主要手段，目前有灭活和减毒活疫苗。由于黏膜免疫和细胞毒性t细胞反应有限，灭活疫苗的保护效果只能持续很短的时间，需要每年接种一次。相反，iav减毒活疫苗经鼻免疫，可引起强大的黏膜免疫和细胞免疫，因此，它们的保护作用可以持续更长的时间。目前市场上只有两种减毒活疫苗，而且均是基于冷适应特性的毒株，这些疫苗的使用仅限于2岁至49岁的人。因此，需要研发更加安全、有效的减毒活疫苗抵抗ia的感染。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种流感病毒的致弱方法及流感致弱病毒株和应用。本发明所述致弱方法获得的流感致弱病毒株(复制限制型病毒)可以在表达m2蛋白的mdck细胞系上具有良好的生长特性，而且相对于亲本病毒，对小鼠是非致病性的，能够为更加安全、有效的iav减毒活疫苗的筛选奠定基础；流感致弱病毒株还可以在mdck细胞或鸡胚上良好的生长，高剂量的复制限制型病毒可以在mdck细胞或鸡胚生长良好，为利用鸡胚大量生产致弱病毒提供可能。
4.本发明提供了一种流感病毒的致弱方法，包括以下步骤：对流感病毒保守区m2蛋白跨膜结构域和细胞质结构域进行随机数量和位置的碱基缺失，获得具有相应碱基缺失的流感致弱病毒。
5.优选的是，所述致弱方法针对的亲本病毒包括a/puerto rico/8/1934。
6.优选的是，所述随机数量和位置的碱基缺失选自以下(a)～(f)中的一种：
7.(a)缺失m2蛋白编码区第73～86位共14个碱基；
8.(b)缺失m2蛋白编码区第87～106位共20个碱基；
9.(c)缺失m2蛋白编码区第130～151位共22个碱基；
10.(d)缺失m2蛋白编码区第152～189位共38个碱基；
11.(e)缺失m2蛋白编码区第87～151位共65个碱基；
12.(f)缺失m2蛋白编码区第87～189位共103个碱基。
13.本发明还提供了上述技术方案所述致弱方法制备得到的流感致弱病毒株，所述流感致弱病毒株以a/puerto rico/8/1934为亲本病毒，对m2蛋白进行以下(a)～(f)中的一种碱基缺失：
14.(a)缺失m2蛋白编码区第73～86位共14个碱基；
15.(b)缺失m2蛋白编码区第87～106位共20个碱基；
16.(c)缺失m2蛋白编码区第130～151位共22个碱基；
17.(d)缺失m2蛋白编码区第152～189位共38个碱基；
18.(e)缺失m2蛋白编码区第87～151位共65个碱基；
19.(f)缺失m2蛋白编码区第87～189位共103个碱基。
20.优选的是，所述流感致弱病毒株的m2蛋白的编码区的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5或seq id no.6所示。
21.本发明还提供了一组流感致弱病毒株构建用质粒，所述质粒分别含有如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5或seq id no.6所示的核苷酸。
22.优选的是，所述质粒构建时使用的基础质粒含如seq id no.7所示的核苷酸序列。
23.本发明还提供了构建上述技术方案所述质粒用的引物，所述引物的核苷酸序列如seq id no.8～19所示。
24.本发明还提供了上述技术方案所述致弱方法或上述技术方案所述的流感致弱病毒株或上述技术方案所述的质粒或上述技术方案所述的引物在制备流感减毒活疫苗中的应用。
25.本发明提供了一种流感病毒的致弱方法。本发明所述致弱方法获得的流感致弱病毒株(复制限制型病毒)可以在表达m2蛋白的mdck细胞系上具有良好的生长特性，而且相对于亲本病毒，对小鼠是非致病性的，能够为更加安全、有效的iav减毒活疫苗的筛选奠定基础；流感致弱病毒株还可以在mdck细胞或鸡胚上良好的生长，高剂量的复制限制型病毒可以在mdck细胞或鸡胚生长良好，为利用鸡胚大量生产致弱病毒提供可能。
附图说明
26.图1为本发明提供的提取的质粒pr8-m2-del14、pr8-m2-del20、pr8-m2-del22、pr8-m2-del38、pr8-m2-del65和pr8-m2-del103的琼脂糖凝胶电泳图；
27.图2为本发明提供的rt-pcr鉴定复制限制型病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103的琼脂糖凝胶电泳图；
28.图3为本发明提供的复制限制型病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103和亲本病毒iavpr8毒株的病毒生长曲线；
29.图4为本发明提供的复制限制型病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103和亲本病毒iavpr8毒株以不同moi感染mdck细胞72h后细胞病变情况；
30.图5为本发明提供的复制限制型病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103和亲本病毒iavpr8毒株以不同moi感染mdck细胞72h后的血凝价；
31.图6为本发明提供的复制限制型病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103和亲本病毒iavpr8毒株免疫小鼠后14d内的体重变化情况图；
32.图7为iavpr8毒株攻毒后10天小鼠体重变化情况图。
具体实施方式
33.本发明提供了一种流感病毒的致弱方法，包括以下步骤：对流感病毒保守区m2蛋白跨膜结构域和细胞质结构域进行随机数量和位置的碱基缺失，获得具有相应碱基缺失的流感致弱病毒。本发明优选利用反向遗传操作系统在跨膜结构域(transmembrane domain，tm)和细胞质结构域(cytoplasmic domain，ct)区域产生一系列的随机碱基缺失，评估产生的随机缺失病毒的毒性，能够利于安全、有效的iav减毒活疫苗的获得。
34.在本发明中，所述致弱方法针对的亲本病毒优选包括a/puerto rico/8/1934(简称iavpr8)。
35.在本发明中，所述随机数量和位置的碱基缺失优选选自以下(a)～(f)中的一种：
36.(a)缺失m2蛋白编码区第73～86位共14个碱基；编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；
37.(b)缺失m2蛋白编码区第87～106位共20个碱基；编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；
38.(c)缺失m2蛋白编码区第130～151位共22个碱基；编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；
39.(d)缺失m2蛋白编码区第152～189位共38个碱基；编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；
40.(e)缺失m2蛋白编码区第87～151位共65个碱基；编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；
41.(f)缺失m2蛋白编码区第87～189位共103个碱基编码基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。
42.本发明所述致弱方法所产生的流感致弱病毒株可以在mdck细胞或鸡胚上良好生长；滴鼻免疫babl/c小鼠，通过观察体重变化、存活情况并检测鼻甲及肺脏中的病毒含量，发现相对于亲本病毒iav pr8，流感致弱病毒株对小鼠是非致病性的。本发明所述致弱方法为更加安全、有效的iav减毒活疫苗的筛选奠定基础。
43.本发明还提供了上述技术方案所述致弱方法制备得到的流感致弱病毒株，所述流感致弱病毒株以a/puerto rico/8/1934为亲本病毒，对m2蛋白进行以下(a)～(f)中的一种碱基缺失：
44.(a)缺失m2蛋白编码区第73～86位共14个碱基；
45.(b)缺失m2蛋白编码区第87～106位共20个碱基；
46.(c)缺失m2蛋白编码区第130～151位共22个碱基；
47.(d)缺失m2蛋白编码区第152～189位共38个碱基；
48.(e)缺失m2蛋白编码区第87～151位共65个碱基；
49.(f)缺失m2蛋白编码区第87～189位共103个碱基。
50.在本发明中，所述流感致弱病毒株的m2蛋白的编码区的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5或seq id no.6所示。
51.本发明还提供了一组流感致弱病毒株构建用质粒，所述质粒分别含有如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5或seq id no.6所示的核苷酸。本发明所述质粒为m2基因随机碱基缺失质粒，本发明对缺失质粒的构建方法没有特殊
限定，采用本领域技术人员熟知的常规缺失质粒构建方法进行构建即可。在本发明中，所述质粒构建时使用的基础质粒优选含如seq id no.7所示的核苷酸序列。本发明对基础质粒的类型没有特殊限定，所述基础质粒含有如seq id no.7所示的核苷酸序列即可。
52.本发明还提供了构建上述技术方案所述质粒用的引物，所述引物的核苷酸序列如seq id no.8～19所示。
53.本发明还提供了上述技术方案所述致弱方法或上述技术方案所述的流感致弱病毒株或上述技术方案所述的质粒或上述技术方案所述的引物在制备流感减毒活疫苗中的应用。
54.下面结合具体实施例对本发明所述的一种流感病毒的致弱方法及流感致弱病毒株和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
55.实施例1
56.流感病毒m2基因随机碱基缺失质粒构建
57.提取表达流感病毒pr8毒株m2基因的质粒(本发明对此质粒的构建方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常用质粒与m基因按照常规重组质粒构建方法进行过表达m2的质粒的构建即可)，利用一系列碱基缺失引物(引物序列见表1)进行pcr扩增。琼脂糖凝胶电泳鉴定分子量正确后，将目的条带胶回收并在50℃条件下重组15min，将重组产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑取菌落并测序验证正确，利用去内毒素小提中量试剂盒成功制备缺失质粒pr8-m2-del14、pr8-m2-del20、pr8-m2-del22、pr8-m2-del38、pr8-m2-del65、pr8-m2-del103(提取的质粒pr8-m2-del14、pr8-m2-del20、pr8-m2-del22、pr8-m2-del38、pr8-m2-del65和pr8-m2-del103的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示)。
58.表1特异性引物序列
[0059][0060]
实施例2
[0061]
复制限制型流感病毒的拯救及验证
[0062]
将hek293t细胞铺于赛默飞的特制六孔板中，12h后分别将含有pr8的7个基因的质粒(pflu-pr8-pb2、pflu-pr8-pb1、pflu-pr8-pa、pflu-pr8-np、pflu-pr8-ns、pflu-pr8-ha、pflu-pr8-na)、实施例1所构建的m2基因随机碱基缺失系列质粒及表达m2蛋白的质粒共转染至hek293t细胞中，转染后6-8h换液，转染后48h将细胞板冻融一次后收取上清液接种于表达m2蛋白的mdck细胞的t25细胞瓶中，接种72～96h后观察细胞病变并将细胞瓶冻融一次后离心收取上清，分别命名为rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103。
[0063]
利用病毒rna提取试剂盒提取上述所收获的病毒rna，并利用表2中引物进行rt-pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定分子量正确(图2)后，对pcr产物进行测序，表明所收获的病毒为相应碱基缺失的复制限制型病毒。图2为rt-pcr鉴定复制限制型病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103的琼脂糖凝胶电泳图。
[0064]
表2鉴定引物序列
[0065][0066]
实施例3
[0067]
复制限制型流感病毒滴度测定
[0068]
将表达m2蛋白的mdck细胞铺于96孔板，待细胞长满单层后，取50μl复制限制型流感病毒加入至450μl 1％tpck opi-mem中，震荡混匀后作为体系1，最终浓度为10-1
；在体系1中取出50μl加入至450μl 1％tpck opi-mem中，震荡混匀后作为体系2，最终浓度为10-2
；依此类推，将病毒液作连续10倍倍比稀释，稀释至10-10
，然后将96孔板中的培养基弃掉，用pbs洗涤板子，每孔中加入100μl对应稀释度的病毒液，每个梯度做3个重复，于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养72h后观察细胞病变情况，应用reed-muench方法计算其tcid
50
，病毒滴度见表3。
[0069]
表3复制限制型流感病毒滴度汇总表
[0070][0071][0072]
实施例4
[0073]
复制限制型流感病毒生长曲线的测定
[0074]
将表达m2蛋白的mdck细胞铺于48孔板，待细胞长满单层后，将复制限制型流感病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103和亲本病毒iav pr8毒株以感染复数(moi)为0.001的剂量接种细胞，做3个重复，置37℃、5％co2培养箱中培养。分别在感染后24、48、72h和96h收获病毒，将收获的不同时间点的病毒液作连续10倍倍比稀释后，每个稀释度做3个重复，分别接种于96孔板中长至单层的表达m2蛋白的mdck细胞中，于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养72h后观察细胞病变情况，应用reed-muench方法计算其tcid
50
，数据分析完成后，绘制复制限制型流感病毒的生长曲线(图3)，从图3中可以看出rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del65和wt-pr8具有相似的生长特性，且在感染后48h能达到相似的病毒滴度，而且rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del103也能在表达m2蛋白的mdck细胞上具有良好的生长特性。
[0075]
实施例5
[0076]
复制限制型流感病毒在mdck细胞生长情况测定
[0077]
将mdck细胞铺于48孔板，待细胞长满单层后，将复制限制型流感病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103和亲本病毒iav pr8毒株以感染复数(moi)为0.001、0.004、0.016、0.064、0.256、1.024、4.096、16.384的剂量接种细胞，置37℃、5％co2培养箱中培养72h后观察细胞病变情况并拍照(图4，复制限制型病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103和亲本病毒iav pr8毒株以不同moi感染mdck细胞72h后细胞病变情况图)，之后将细胞反复冻融三次，离心收取上清进行鸡红细胞凝集实验并记录血凝价(图5，复制限制型病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103和亲本病毒iav pr8毒株以不同moi感染mdck细胞72h后的血凝价)，实验结果显示较高剂量的复制限制型流感病毒可以在mdck细胞上生长良好，而且从图5中可以看出rpr8-m2-del20病毒的致弱效果更明显，表明本发明所获得的复制限制型流感病毒不是绝对依赖于表达m2蛋白的mdck细胞系。
[0078]
将复制限制型流感病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103原液分别接种于4个鸡胚中，72h后收取鸡胚尿囊液进行鸡红细胞凝集实验并记录血凝价(表4)，而且致弱效果最好的rpr8-m2-del20病毒可以在鸡胚上复制且达到较高的鸡红细胞凝集价，表明本发明的复制限制型流感病毒可以利用鸡胚进行大批量生产，降低成本的同时又能提高产量。
[0079]
表4复制限制型流感病毒接种鸡胚的鸡红细胞凝集价
[0080]
[0081]
实施例6
[0082]
复制限制型病毒免疫实验
[0083]
将4～5周龄balb/c雌性小鼠分为7组，每组8只，分别以106tcid
50
剂量的病毒rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del65、rpr8-m2-del103和亲本病毒iav pr8毒株进行滴鼻免疫，免疫后3d每组取3只小鼠处死并对鼻甲及肺脏进行研磨，取研磨液测定病毒含量，测定方法同实施例3，应用reed-muench方法计算其tcid
50
，病毒滴度见表5。其余5只小鼠每天称量体重并记录，观察至14天，绘制小鼠体重变化图(图6)，发现与wt-pr8毒株相比，免疫rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del20、rpr8-m2-del65病毒的小鼠体重呈现先下降后上升的趋势，免疫rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38、rpr8-m2-del103病毒的小鼠体重略有波动，而免疫wt-pr8毒株的小鼠在免疫后第5天全部死亡，表明本发明的复制限制型流感病毒对小鼠是非致病性的，且免疫后14d血清的hi效价均在2
6.5-2
10
之间(表6)，表明致弱流感病毒的免疫效果较好。而且在免疫后21天用wt-pr8毒株以106tcid
50
剂量攻毒，每天称量体重并记录，观察至10天，绘制小鼠体重变化图(图7)，从图中可以看出，免疫rpr8-m2-del14、rpr8-m2-del22、rpr8-m2-del38病毒的小鼠攻毒后体重略有波动，表明这三株致弱流感病毒具有较好的保护力。为更加安全、有效的iav减毒活疫苗的筛选奠定基础。
[0084]
表5复制限制型流感病毒在小鼠中复制情况
[0085][0086]
表6复制限制型流感病毒免疫小鼠后的hi效价
[0087][0088][0089]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。