一种同义突变结合删除突变的流感病毒的致弱方法及致弱流感病毒株和应用与流程

1.本发明涉及致弱病毒疫苗技术领域，具体涉及一种同义突变结合删除突变的流感病毒的致弱方法及致弱流感病毒株和应用。


背景技术：

2.流感病毒属于正黏病毒科单股负链分节段rna病毒，拥有高度的遗传漂变，几乎每年都会暴发，导致需要每年度根据当季流行的毒株进行疫苗生产研发。流感病毒减毒活疫苗生产快速方便，相比灭活疫苗能够产生黏膜免疫，阻止病毒感染和传播。
3.流感病毒是一种分截段的负链rna病毒，其基因组主要包含pb1，pb2，pa，ha，np，na，m和ns八个片段。其中m基因通过可变剪接编码m1和m2两种蛋白。m1是病毒的结构蛋白，形成病毒囊膜下的蛋白包膜层，与病毒组装和出芽有关。m2蛋白在甲型流感中高度保守，m2蛋白具有离子通道活性，在病毒生命周期的早期阶段，即病毒渗透和脱膜阶段起作用，并且参与病毒组装和形态形成，可以作为病毒致弱的研究点。但目前针对m基因仍缺少高效的流感病毒致弱方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于m基因的同义突变结合删除和突变的流感病毒的致弱方法及致弱流感病毒株和应用。本发明所述致弱方法得到的致弱流感病毒株具有以下优势：1)增殖过程稳定，没有回复野生型的可能性；2)低剂量接毒mdck细胞病毒无法增殖，高剂量接毒时可以在mdck细胞中生长繁殖，体现了致弱病毒限制性增殖能力，相比一过性缺陷型病毒具有更大的诱导免疫潜力；3)安全性佳，免疫效果好，可以作为减毒活疫苗候选株；4)可以接种spf鸡胚并在鸡胚中生长繁殖，为生产实践带来巨大便捷。5)本发明所述致弱方式适用于a型流感病毒亚型，是a型流感病毒致弱的重要方式。
5.本发明提供了一种同义突变结合删除和突变的流感病毒的致弱方法，包括以下步骤：
6.对a型流感病毒m基因中m2基因和m1基因重叠的部分进行同义突变，保证m1氨基酸序列的完整和不变，同时，在m2基因跨膜区进行终止密码子突变和删除部分核苷酸序列，利用反向遗传操作系统，拯救出致弱流感病毒株。
7.优选的是，所述致弱方法的背景毒株包括a/puerto rico/8/1934。
8.优选的是，所述同义突变包括将m基因的第715位碱基到第760位碱基突变为如seq id no.1所示的核苷酸序列。
9.优选的是，所述终止密码子突变包括将m基因的第761位碱基到第766位碱基突变为如seq id no.2所示的核苷酸序列。
10.优选的是，所述删除部分核苷酸序列包括：删除m基因第767位碱基到第877位碱基任意位置和长度的核苷酸序列。
11.优选的是，所述删除部分核苷酸序列包括：
12.删除m基因的第767位碱基到第774位碱基；
13.删除m基因的第767位碱基到第794位碱基；
14.删除m基因的第767位碱基到第817位碱基；
15.删除m基因的第767位碱基到第839位碱基；
16.或，删除m基因的第767位碱基到第877位碱基。
17.本发明还提供了基于上述技术方案所述致弱方法制备得到的致弱流感病毒株。
18.优选的是，所述致弱流感病毒株以a/puerto rico/8/1934为背景，对m基因进行同义突变、终止密码子突变和删除部分核苷酸序列的修饰，修饰后的流感病毒m基因的核苷酸序列如seq id no.3～7之一所示。
19.本发明还提供了一组用于制备上述技术方案所述致弱流感病毒株的缺陷型质粒，所述缺陷型质粒含同义突变结合删除和突变的流感病毒的m基因。
20.本发明还提供了上述技术方案所述的致弱方法或上述技术方案所述的致弱流感病毒株或上述技术方案所述的缺陷型质粒在制备和生产流感致弱病毒疫苗中的应用。
21.本发明提供了一种同义突变结合删除和突变的流感病毒的致弱方法。本发明通过在m基因剪接位置附近引入同义突变，引起m基因可变剪接的异常，为防止回复野生型，在同义突变基础上结合删除和突变，在碱基层面将rna序列进行改变，从而进一步影响rna的二级结构，产生了一系列致弱流感病毒株。并且与前期流感致弱方法不同的是，本发明所产生的致弱流感病毒株1)恢复成野生型的可能性极小，几乎没有；2)低剂量接毒mdck细胞病毒无法增殖，高剂量接毒时可以在mdck细胞中生长繁殖，体现了致弱病毒限制性增殖能力，相比一过性缺陷型病毒具有更大的诱导免疫潜力；3)小鼠试验表明所述致弱流感病毒安全性佳，免疫效果好，可以作为减毒活疫苗候选株；4)可以在鸡胚上良好的生长，为鸡胚生产病毒提供可能。
附图说明
22.图1为本发明提供的m缺陷型流感病毒的生长曲线图；
23.图2为本发明提供的m缺陷型流感病毒在mdck细胞中增殖结果图；
24.图3为本发明提供的小鼠接种病毒后体重变化情况图；
25.图4为本发明提供的小鼠接种病毒后三天鼻甲和肺叶组织病毒滴度结果图；
26.图5为本发明提供的小鼠接种病毒后三天肺叶组织病理切片结果图；
27.图6为本发明提供的免疫小鼠攻毒后10天体重变化图。
具体实施方式
28.本发明提供了一种同义突变结合删除和突变的流感病毒的致弱方法，包括以下步骤：
29.对a型流感病毒m基因中m2基因和m1基因重叠的部分进行同义突变，保证m1氨基酸序列的完整和不变，同时，在m2基因跨膜区进行终止密码子突变和删除部分核苷酸序列，利用反向遗传操作系统，拯救出致弱流感病毒株。
30.本发明优选在m基因剪接位置(m2基因和m1基因重叠的部分)附近引入同义突变，
引起m基因可变剪接的异常，并且在同义突变基础上结合删除和突变，在碱基层面将rna序列进行改变，从而进一步影响rna的二级结构，产生一系列致弱流感病毒株。本发明所述致弱方法制备得到的致弱流感病毒株恢复成野生型的可能性极小，几乎没有；而且可以在mdck细胞或鸡胚上良好的生长，为鸡胚或mdck细胞生产病毒提供可能。同时，小鼠试验表明，本发明所产生的致弱流感病毒株在小鼠上是安全的，为生产安全有效的流感减毒疫苗奠定了基础。
31.在本发明中，所述致弱方法的背景毒株优选包括a/puerto rico/8/1934。
32.在本发明中，所述同义突变优选包括将m基因的第715位碱基到第760位碱基突变为如seq id no.1所示的核苷酸序列。具体是将序列gcctatcagaaacgaatgggggtgcagatgcaacggttcaagtgat(seq id no.18)突变为序列gcgtaccaaaagcgtatgggtgttcaaatgcagagatttaaataag(seq id no.1)，形成m(sn)缺陷型质粒。
33.在本发明中，所述终止密码子突变优选包括将m基因的第761位碱基到第766位碱基突变为如seq id no.2所示的核苷酸序列。即本发明引入两个终止密码子，具体为将第761位碱基到第766位碱基cctctc(seq id no.19)突变为tgatga(seq id no.2)。
34.在本发明中，所述删除部分核苷酸序列优选包括：删除m基因第767位碱基到第877位碱基任意位置和长度的核苷酸序列；更优选的，所述删除部分核苷酸序列包括：
35.删除m基因的第767位碱基到第774位碱基；
36.删除m基因的第767位碱基到第794位碱基；
37.删除m基因的第767位碱基到第817位碱基；
38.删除m基因的第767位碱基到第839位碱基；
39.或，删除m基因的第767位碱基到第877位碱基。
40.具体的，本发明删除m基因的第767位碱基到第774位碱基actattgc(seq id no.20)；结合上述同义突变和终止子突变后，形成m(sn) mut6 del8缺陷型质粒；
41.删除m基因的第767位碱基到第794位碱基actattgccgcaaatatcattgggatct(seq id no.21)；结合上述同义突变和终止子突变后，形成m(sn) mut6 del28缺陷型质粒；
42.删除m基因的第767位碱基到第817位碱基actattgccgcaaatatcattgggatcttgcacttgacattgtggattctt(seq id no.22)；结合上述同义突变和终止子突变后，形成m(sn) mut6 del51缺陷型质粒；
43.删除m基因的第767位碱基到第839位碱基actattgccgcaaatatcattgggatcttgcacttgacattgtggattcttgatcgtctttttttcaaatgca(seq id no.23)；结合上述同义突变和终止子突变后，形成m(sn) mut6 del73缺陷型质粒；
44.或，删除m基因的第767位碱基到第877位碱基actattgccgcaaatatcattgggatcttgcacttgacattgtggattcttgatcgtctttttttcaaatgcatttaccgtcgctttaaatacggactgaaaggagggcct(seq id no.24)；结合上述同义突变和终止子突变后，形成m(sn) mut6 del111缺陷型质粒。
45.本发明优选根据上述同义突变结合删除和突变的情况构造m基因缺陷型质粒，然后将所述m基因缺陷型质粒与pr8背景流感反向遗传的其他7质粒(pb2、pb1、pa、np、ns、ha、na)以及表达全长m2蛋白的质粒(pr8-m2)共转染细胞后收获病毒，得到致弱流感病毒株。
46.本发明还提供了基于上述技术方案所述致弱方法制备得到的致弱流感病毒株。在
本发明中，所述致弱流感病毒株以a/puerto rico/8/1934为背景，对m基因进行同义突变、终止密码子突变和删除部分核苷酸序列的修饰。在本发明中，修饰后的流感病毒m基因的核苷酸序列优选如seq id no.3～7之一所示。
47.本发明还提供了一组用于制备上述技术方案所述致弱流感病毒株的缺陷型质粒，所述缺陷型质粒含同义突变结合删除和突变的流感病毒的m基因。在本发明中，所述缺陷型质粒优选含如seq id no.3～7之一所示的核苷酸序列。在本发明中，制备所述缺陷型质粒所用的引物的核苷酸序列优选如seq id no.8～17所示。
48.本发明还提供了上述技术方案所述的致弱方法或上述技术方案所述的致弱流感病毒株或上述技术方案所述的缺陷型质粒在制备和生产流感致弱病毒疫苗中的应用。
49.下面结合具体实施例对本发明所述的一种同义突变结合删除突变的流感病毒的致弱方法及致弱流感病毒株和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
50.实施例1
51.m基因缺陷型质粒构建
52.设计引物m(sn)-f:atgggtgttcaaatgcagagatttaaataagcctctcactattgccgcaaat(seq id no.25)和m(sn)-r:gagaggcttatttaaatctctg(seq id no.26)，以流感反向遗传8质粒系统中pflu-pr8-m(m基因核苷酸序列如seq id no.27所示)载体质粒为模板，按照primerstar说明书pcr扩增同义突变序列，凝胶电泳确定扩增序列大小正确，切胶回收目的片段并按照hifi dnaassembly试剂盒说明书要求同源重组克隆得到m(sn)质粒。在m(sn)质粒基础上，设计引物pcr扩增并同源重组得到m(sn) mut6 del8缺陷型质粒、m(sn) mut6 del28缺陷型质粒、m(sn) mut6 del51缺陷型质粒、m(sn) mut6 del73缺陷型质粒和m(sn) mut6 del111缺陷型质粒。
53.扩增所用引物见表1：
54.表1扩增用引物
[0055][0056]
[0057]
实施例2
[0058]
缺陷型流感病毒拯救
[0059]
将293t细胞铺赛默飞的特制六孔板，待细胞密度达到70～80％时进行转染。采用经典“6 2”流感反向遗传操作系统拯救缺陷型重组流感病毒。将6个pr8内部基因pflu-pr8-pb2，pflu-pr8-pb1，pflu-pr8-pa，pflu-pr8-np，pflu-pr8-ns以及pflu-pr8-m基因缺陷型质粒，和2个外部基因pflu-pr8-ha，pflu-pr8-na各0.5ug以及表达全长m2的质粒0.25ug分别共转染到293t细胞(lipofectamine 3000)。转然后24h更换含有终浓度为0.5ug/ml tpck-trypsin的培养液，并在转然后48h收集细胞上清，将细胞上清按照0.2ml/枚通过尿囊腔接种8日龄spf鸡胚。接种后的鸡胚在37℃温箱内培养48h。收集鸡胚尿囊液(f0代)，分别获得缺陷型流感病毒，并测定其是否有血凝价。如果没有血凝价，将收获病毒盲传一代，再测其是否有血凝价。所得到m缺陷型流感病毒分别命名为pr8-m(sn)，pr8-m(sn) mut6 del8，pr8-m(sn) mut6 del28，pr8-m(sn) mut6 del51，pr8-m(sn) mut6 del73和pr8-m(sn) mut6 del111。
[0060]
实施例3
[0061]
病毒生长曲线
[0062]
将mdck-m2细胞铺于24孔板，待细胞长满单层后，将m缺陷型流感病毒株以感染复数(moi)为0.001的剂量接种细胞，做3个重复，感染2h后，弃掉24孔板中的液体，用pbs洗涤后加入含2％fbs的dmem培养基维持细胞生长，置37℃、5％co2，培养箱中培养。分别在感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h收获病毒，将收获的不同时间点的病毒液作连续10倍倍比稀释后，每个稀释度做4个重复，分别接种于96孔板中长至单层的mdck-m2细胞中，感染2h后换成2％fbs的dmem培养液维持细胞的生长，48h后观察病变，并收集缺陷型流感病毒株的毒价，应用reed-muench方法计算其tcid
50
，数据分析完成后，绘制m缺陷型流感病毒的生长曲线，结果如图1所示。
[0063]
所有致弱病毒相比野生型pr8病毒，生长能力均有所下降。在感染后24h，各类型致弱病毒滴度约为105个tcid
50
/ml，但之后，病毒大量繁殖，在在感染后48h，致弱病毒滴度在107个tcid
50
/ml左右。可见，本发明所产生的致弱病毒株均可以在mdck-m2细胞高滴度生长，满足正常生产要求。
[0064]
实施例4
[0065]
m缺陷型流感病毒可在正常mdck生长
[0066]
分别取250，1000，4000，16000，64000，256000，1024000，4096000个tcid
50
的m缺陷型流感病毒接种48孔板mdck细胞，观察细胞病变并检测细胞培养液ha效价。结果如图2。由结果可见，本发明m缺陷型流感病毒在低剂量接毒mdck细胞时病毒无法增殖，高剂量接毒时可以在mdck细胞中生长繁殖，体现了致弱病毒限制性增殖能力，相比一过性缺陷型病毒，有利于诱导更好的保护力。
[0067]
实施例5
[0068]
m缺陷型流感病毒可在鸡胚生长
[0069]
将以上m缺陷型流感病毒原液分别接种10日龄spf鸡胚，100μl/胚，每株病毒接种三只鸡胚，72h后收获尿囊液检测病毒ha效价。结果如表2所示：
[0070]
表2 m缺陷型流感病毒鸡胚培养ha效价
[0071][0072]
由表2可见，所有m缺陷型流感病毒均可以在鸡胚中大量生长繁殖，ha效价最高可达到2
9.5
以上，平均多数毒株均可达到2
8.5
。鸡胚的培养除产能较高外，相比细胞培养对设备厂房要求简单，这为生产缺陷型流感病毒提供了极大便利。
[0073]
实施例6
[0074]
传代试验
[0075]
将病毒在mdck-m2细胞系中连续传代10代，测序检测病毒m基因的稳定性。经过检测，所有致弱病毒m基因与传代前相比均没有发生变化，可见，本发明致弱流感病毒在基因层面稳定遗传。
[0076]
实施例7
[0077]
m缺陷型流感病毒小鼠试验
[0078]
取7～8周龄balb/c雌性小鼠鼻内接种以上m缺陷型流感病毒以及野生型pr8毒株，对照组小鼠施用pbs，每组5～8只小鼠。接种后每天记录小鼠体重变化和感染征状(图3)，接种后3天，取pr8-m(sn) mut6 del8，pr8-m(sn) mut6 del51，pr8-m(sn) mut6 del73每组各3只小鼠进行安乐死，解剖获取肺部和鼻甲组织进行病理检测并测定组织病毒滴度。病理检测采用石蜡包埋组织，经过切片、漂片、烘片、he染色等过程后，进行拍照。病毒滴度的检测方法如下：将mdck-m2细胞铺于96孔板，待细胞长满单层后，使用dmem连续10倍倍比比例梯度稀释重组病毒，稀释至10-6
即可，然后将96孔板中的培养基弃掉，用dmem洗涤板子，每孔中加入100μl对应稀释度的重组病毒液，每个梯度做4个重复，于37℃、5％co2的细胞培养箱中孵育2h后，弃掉细胞上清，换成含2％fbs的dmem培养基以维持细胞生长，48h后弃去上清，用pbs洗涤板子两次，于倒置荧光显微镜下观察每孔中的荧光情况并记录，应用reed-muench方法计算其tcid
50
。首免后14天采血，检测小鼠血清hi(血凝价抑制)水平。hi水平检测方法如下：配置四单位抗原，病毒抗原的稀释倍数＝病毒凝集价/4，同时将小鼠待检血清提前用56℃灭活30min，向96孔板的第一孔中加入25μl待检血清，1：2的比例梯度稀释免疫血清，稀释后的血清中加入25μl四单位抗原，室温反应30min后每孔加1％鸡红细胞悬液各25μl，室温静置30min后观察试验结果并记录出现血凝的最高稀释度即为hi水平，结果见表3。小鼠免疫后21天以pr8病毒106tcid
50
/50ul剂量进行攻毒，记录小鼠状态和体重变化(图6)。
[0079]
由结果可知，小鼠感染缺陷型致弱病毒后，第2天，第3天小鼠体重稍有下降，降低幅度在5％以内，随后体重恢复，第5天除对照组外所有接毒小鼠体重恢复至初始并正常生长，至14天小鼠精神状态良好。相对比，接种野生型pr8病毒的对照组5只小鼠在第5天全部死亡。同时，接种后3天，野生型pr8毒株在小鼠鼻甲和肺叶组织中病毒滴度都比致弱流感病
毒高。在肺部组织，野生型病毒滴度显著高于致弱流感病毒pr8-m(sn) mut6 del8，pr8-m(sn) mut6 del51，pr8-m(sn) mut6 del73(图4)，仍然可以在肺叶组织中检测到少量pr8-m(sn) mut6 del73重组病毒。另外，病理切片结果显示，pr8-m(sn) mut6 del73致弱病毒株引起小鼠肺部组织2/3肺叶的少量支气管周围呈弥漫性淋巴细胞浸润，肺间质可见中度的纤维化特征，pr8-m(sn) mut6 del8引起1/3肺叶的少量支气管周围呈弥漫性淋巴细胞浸润，肺间质可见中轻度的纤维化特征，pr8-m(sn) mut6 del51仅引起肺叶少量支气管周围呈弥漫性淋巴细胞浸润。可见，相同的致弱方法所产生的致弱毒株，在毒性上存在区别，其中，pr8-m(sn) mut6 del73毒株毒性相比较高(图5)。
[0080]
综合图3以及图4结果，可见本发明拯救得到的缺陷型流感病毒在小鼠中总体安全，不会引起小鼠死亡，但对小鼠的致病程度有所不同，毒性较高的是pr8-m(sn) mut6 del73毒株。
[0081]
表3血清hi抗体结果
[0082][0083][0084]
小鼠感染病毒后14天，血清hi抗体见表3。由表3结果可知，小鼠产生了有效的hi抗体效价，hi水平平均可达到24到28，其中，pr8-m(sn) mut6 del8，pr8-m(sn) mut6 del73毒株免疫效果表现优秀，可以达到完全保护。pr8-m(sn) mut6 del28致弱毒株免疫效果明显不足。另外，图6结果显示，攻毒后，所有毒株均可以保护小鼠免于病毒感染。除pr8-m(sn) mut6 del51组小鼠体重变化较大之外，pr8-m(sn) mut6 del8和pr8-m(sn) mut6 del73组小鼠体重基本保持平稳，可见虽然pr8-m(sn) mut6 del51病毒株毒性最弱，但综合hi抗体效价以及攻毒试验结果可知，pr8-m(sn) mut6 del51毒株免疫效果弱于pr8-m(sn) mut6 del8和pr8-m(sn) mut6 del73。以上结果进一步说明本发明的致弱流感病毒针对流感ha产生了有效的抗体，但不同致弱方法产生的致弱病毒在免疫效果上存在差异。
[0085]
综合以上结果可知，本发明所述致弱方法所产生的致弱病毒，均具有良好的生长特性，可以在mdck-m2以及鸡胚中生长。同时，高剂量接毒可以在mdck细胞中增殖，显示了病毒限制性复制能力，相比单次复制病毒，具有更加优异的免疫性能。另外，所述致弱方法产生的不同致弱病毒的毒性以及免疫原性之间有所差异，其中，毒性较高的毒株是pr8-m(sn) mut6 del73，免疫原性较差的毒株是pr8-m(sn) mut6 del28。综合生长特性，毒性以及免疫原性三方面数据，可知本发明中表现较好的毒株为pr8-m(sn) mut6 del8。根据流感疫苗制备的不同用途，本发明所述致弱方法可以为制备流感减毒活疫苗候选株以及禽流感减毒灭活疫苗奠定基础。
[0086]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。