油菜基因BnCAMTA3的抗病调控功能应用

油菜基因bncamta3的抗病调控功能应用
技术领域
1.本发明属植物抗病性生物技术领域，涉及一个油菜基因bncamta3的抗病调控功能应用，尤其涉及油菜基因bncamta3在菌核病防控中的应用。


背景技术：

2.1、植物基因功能分析技术植物基因的功能通过基因表达和蛋白积累来执行。因此，基因功能通常通过比较分析基因的超常规表达与正常表达情况下的表型(phenotype)或功能情况加以判断和明确。基因的超常表达包括高于正常水平的表达和低于正常水平的表达两大类。高于正常水平的表达主要为超表达/过表达(over-expression)，主要通过连接一个强启动子来驱动目的基因表达的方式来达到。低于正常水平的表达主要通过rna干扰(rna interfering,rnai)、基因敲除(knock-out)等方式来达到。rnai通过构建和转化一个含有同一序列片段相反方向插入一个内含子或其它不表达的序列形成的发卡结构来实现，结果是目的基因表达的降低。基因敲除(knock-out)则通过在植物基因组中的目的基因中插入一个长的非植物序列或切除目的基因等方式来达到，结果是目的基因表达的完全或近乎完全的抑制。构建基因超表达植株和/或rnai植株、基因敲除突变体，比较这些植株的表型和性状与野生型/正常植株的差异，就能明确目的基因对该性状的调节功能。
3.2、植物抗病遗传学调控技术植物抗病性是由植物受体识别病原物配体激活抗病信号传导、活化系列防卫反应而产生的结果。在遗传学上，植物抗病性受基因控制。抗病调控基因的鉴定和利用对于抗病作物种质和品种的创制和选育、从而绿色防控植物病害具有重要意义。钙信号通路广泛参与各类植物抗病性的调控。camta3(calmodulin-binding transcription activator 3)是ca
2
信号途径的重要转录因子，是植物抗病性的重要调控节点，因而是优质抗病调控基因资源。
4.3、菌核病防控技术植物菌核病由核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)侵染所致。核盘菌是坏死营养型(necrotroph)病原真菌，寄主范围极广，是油料作物以及蔬菜作物等的主要病害。每年造成巨大经济损失。由于抗病机制研究不够深入，缺乏高抗品种，化学防治仍然是重要手段。由于一些农药存在生态污染、人畜毒害、易使病原物产生抗药性等问题，鉴定重要抗菌核病调控基因，创制和利用抗病品种，对于菌核病的绿色防控至关重要。
5.4、植物抗病育种技术主要分为传统抗病育种和通过基因工程抗病育种等。传统抗病育种因为有天然遗传隔离现象使抗病资源可用范围受到显著限制，只能应用遗传关系较近的抗病资源，而且需要多次杂交和回交等，因此选育周期长，且需要大量人力物力。而基因工程育种方法是通过将外源的抗病调控基因通过农杆菌介导的方法等技术导入植物，使其获得原来不具有的抗病性。因此，基因工程育种方法打破了天然遗传隔离现象的限制，拓宽了抗病资源可用范
围，而且具有操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力的特点。另外，可通过导入一个广谱抗病调控基因，或者多个不同抗病谱的基因，创制具有广谱抗病的品种。因此具有特别适宜培育广谱、持久抗病品种等优点。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一个油菜基因bncamta3的抗病调控功能应用，具体是提供油菜基因bncamta3在菌核病防控中的应用，所述功能是油菜(brassica napus)钙信号途径基因bncamta3对抗病性的调控功能，可在创制抗菌核病(病原物：核盘菌(sclerotinia sclerotiorum))种质中的应用。
7.所述应用是通过创制转基因油菜来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用。是通过创制超表达bncamta3的转基因油菜来获得增高菌核病抗性的油菜材料中的应用，或通过创制bncamta3-rnai转基因油菜来获得降低菌核病抗性的油菜材料中的应用。
8.本发明以油菜中双11品种cdna为模板，通过pcr克隆获得油菜基因bncamta3，其核苷酸序列如seq id：1所示，该基因的开放阅读框(orf)长3096bp，编码的蛋白由1031个氨基酸组成，其序列如seq id：2所示。bncamta3蛋白包括核定位信号和dna结合结构域cg-1、参与蛋白互作的ank(ankyrin)重复结构域、及结合cam的iq/cambd结构域。本发明克隆的bncamta3核苷酸序列与油菜品种darmor-bzh基因bnac04g34700d和油菜品种zs11位点loc106375930的核苷酸序列较相似，依次分别有107个和111个碱基的区别，均导致23个氨基酸的改变。
9.在本发明之前，该基因的功能没有任何公开报告。本发明首次通过构建该基因的超表达和rnai转基因油菜及其抗病分析，阐明了该基因对油菜菌核病抗性的调控作用及机制。结果显示，与用于转基因的亲本zs11油菜植株相比，超表达转基因油菜植株更抗核盘菌，而rnai转基因植株更感核盘菌，说明bncamta3正调控油菜对核盘菌的抗性。
10.基于以上本发明阐明的bncamta3基因功能，本发明的应用目的是提供所述的油菜bncamta3基因通过创制转基因油菜来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用，包括(1)在通过创制超表达bncamta3的转基因油菜来获得增高对菌核病抗性的油菜材料中的应用(具体见实施例1中的说明)；以及(2)在通过创制bncamta3-rnai的转基因油菜来获得降低对菌核病抗性的油菜材料中的应用(具体见实施例2中的说明)。
11.1.油菜bncamta3基因在通过创制超表达bncamta3的转基因油菜来获得增高对菌核病抗性的油菜材料中的应用。通过以下步骤实现：(1)bncamta3基因超表达结构的构建和获取将bncamta3基因开放阅读框(orf)克隆入一个植物表达载体，使其受强启动子的驱使表达；(2)转化bncamta3基因超表达结构的农杆菌的获取将构建好的bncamta3基因超表达结构通过电击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株；(3)超表达bncamta3的转基因油菜创制和获取通过农杆菌介导法将bncamta3基因超表达结构导入油菜，获取转bncamta3基因超表达结构的油菜；
(4)超表达bncamta3的转基因油菜纯合系的获取分别以抗生素抗性和bncamta3基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的超表达bncamta3的转基因油菜纯合系；(5)对菌核病抗性增高的超表达bncamta3的转基因油菜纯合系筛选鉴定和获取以超表达bncamta3的转基因油菜纯合系为材料，检测分析对菌核病的抗性，获取抗病性增高的转bncamta3基因油菜。
12.2.油菜bncamta3基因在通过创制bncamta3-rnai的转基因油菜来获得降低对菌核病抗性的油菜材料中的应用。通过以下步骤实现：(1)bncamta3基因rnai结构的构建和获取：将bncamta3基因的一个特异性序列片段分别以正反方向克隆入中间表达载体pkannibal，再将重组结构插入rnai载体(part27)，获取rnai结构part27-bncamta3；(2)转化bncamta3基因rnai结构的农杆菌的获取：将bncamta3基因rnai结构(part27-bncamta3)通过电击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株；(3)转bncamta3基因rnai结构油菜的创制和获取：通过农杆菌介导法将bncamta3基因rnai结构导入油菜，获取转bncamta3基因rnai结构的油菜；(4)转bncamta3基因rnai结构油菜纯合系的获取：分别以抗生素抗性和bncamta3基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转bncamta3基因rnai结构的油菜纯合系；(5)抗菌核病的转bncamta3基因rnai结构油菜纯合系的筛选鉴定和获取：以转bncamta3基因rnai结构(part27-bncamta3)的油菜纯合系为材料，检测分析对菌核病的抗性，获取抗菌核病的bncamta3基因rnai油菜。
13.本发明的优点：(1)本发明提供的bncamta3基因是优质抗菌核病调控基因资源，利用该基因获取的抗病材料具有抗病性较强等优点。油菜菌核病抗性是数量性状抗性，由多基因控制。一般而言，单个基因对该抗性的调控程度较低。因此，全世界范围内，油菜菌核病抗性材料都很匮乏，尚无高抗材料。bncamta3基因是钙信号通路关键转录因子基因，是植物抗病性调控中心节点，因而是关键的抗病调控基因资源。利用bncamta3创制抗病品种和种质是病害绿色防控的经济有效和安全的途径。因此，bncamta3基因是一种适用于创制和选育抗菌核病油菜新材料和新品种的全新基因资源。(2)获取抗病材料周期短。获取抗病植物材料和品种的方法主要有常规的传统育种方法和利用抗病调控基因的基因工程育种方法。传统育种方法具有可用抗病资源范围受天然遗传隔离限制，选育周期长，需要大量人工物力等缺点。而基因工程育种方法则具有可用抗病资源范围广、操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力、特别适宜培育广谱、持久、高抗病性品种等优点。本发明利用抗病调控基因bncamta3，采用基因工程方法，创制培育抗菌核病油菜材料，具有周期短，选育快速等特点。
附图说明
14.图1提供本专利获取的各类转基因油菜植株的证据，显示转基因油菜植株中bncamta3基因表达检测结果。利用实时荧光定量pcr检测沉默bncamta3基因的rnai植株(a)
以及超表达bncamta3基因的oe植株(b)中bncamta3基因表达水平。选用油菜bnactin7作为内参基因，非转基因亲本zs11的相对表达量设置为1。实验重复三次，对表达结果数据进行student's t-test检验统计分析，数据以平均值
±
标准差表示。差异显著性以不同数量*号表示(**，p《0.01；****，p《0.001)。结果显示，rnai植株中bncamta3的表达量显著降低，只有对照植株的25％(a)，而超表达株系中bncamta3的表达量明显提高，为对照的4.9倍(b)。表明这些植株为真正的bncamta3基因rnai植株和超表达植株。
15.图2提供bncamta3基因抗菌核病调控功能的证据，显示bncamta3正调控油菜对核盘菌的抗性。对油菜bncamta3转基因植株进行了核盘菌uf-1的接种分析。图中显示接种后24h的表型(a)和病斑面积定量统计分析结果(b)。实验重复三次。对病斑面积数据进行student's t-test检验统计分析，数据以平均值
±
标准差表示。差异显著性以不同数量*号表示(**，p《0.01；***，p《0.005)。结果显示，rnai植株表现出比非转基因植株(zs11)对照更感病的表型，而超表达植株则比对照明显更抗病(a)。病斑面积定量分析结果显示，zs11对照植株的病斑面积为115.6mm2，rnai植株的病斑面积平均达到了151.1mm2，明显大于对照植株；而超表达oe植株的病斑面积只有95.9mm2，显著小于对照(b)。这些结果表明，bncamta3正调控油菜对核盘菌的抗性。
具体实施方式
16.本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
17.实施例1本发明克隆了一个油菜基因bncamta3，首次通过构建超表达转基因油菜，阐明了该基因的抗菌核病调控功能，揭示了该基因对油菜菌核病抗性具有重要正调控功能。因为bncamta3基因的超表达导致油菜对菌核病抗性的显著增强，因此，可以通过构建该基因的超表达转基因油菜、采用基因工程技术创制和获取抗菌核病油菜新材料。主要步骤包括：
18.1)油菜bncamta3基因的克隆和保存本发明提供的油菜bncamta3基因通过以下步骤克隆获得。先根据油菜基因组数据库中bncamta3序列设计了引物bncamta3-f(5
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atg gcg gaa gca aga cga ttt-3’)(序列如seq id：3所示)，以及bncamta3-r(5
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agc gtt cca caa agt tga gga-3’)(序列如seq id：4所示)。采用trizol试剂提取油菜品种中双11叶片总rna，采用rt-pcr方法扩增获取bncamta3 cdna，通过1％琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收pcr产物，使用golden gate内切酶，直接将目的片段连接到pgwb5超表达载体，热击转化大肠杆菌dh5α，在lb培养基中摇菌复苏1h，吸取菌液涂布在卡那霉素的平板上过夜培养，挑取单克隆，提取质粒，以bncamta3-f/bncamta3-r为引物进行pcr扩增，检验所提取的质粒是否包含bncamta3基因，最后送公司测序验证，从而成功克隆和获取bncamta3基因cdna全长序列。bncamta3核苷酸序列如seq id：1所示，该基因的开放阅读框(orf)长3096bp，编码的蛋白由1031个氨基酸组成，其序列如seq id：2所示。该基因编码产物包含核定位信号和dna结合结构域cg-1、参与蛋白互作的ank(ankyrin)重复结构域、及结合cam的iq/cambd结构域。经过blast分析发现，本发明克隆的核苷酸序列与油菜品种darmor-bzh的bnac04g34700d核苷酸序列有107个碱基的区别，导致23个氨基酸改变；与油菜品种zs11的loc106375930核苷酸序列有111个碱基的区别，也导致23个氨基酸改变。在本发明之前，该基因功能没有任何公开报告
19.转化了携带有bncamta3基因序列的载体的大肠杆菌，保存于－80℃冰箱。可随时通过活化菌株，提取质粒，通过pcr扩增，将bncamta3基因亚克隆至目的载体中，用于转基因等研究。同时，pgwb5超表达载体以camv 35s强启动子驱动目的基因的表达，并且携带gfp标签，便于分子鉴定和基因功能研究。
20.2)转化bncamta3基因超表达结构pgwb5-bncamta3的农杆菌的获取将bncamta3基因超表达结构pgwb5-bncamta3通过电击等方法转化对油菜具有强侵染力的农杆菌菌株，如ehal05，在含卡那霉素和利福平抗生素的yep培养基上筛选转化子，再通过pcr鉴定阳性菌株，获取携带bncamta3基因超表达结构pgwb5-bncamta3的农杆菌。用于下一步油菜的遗传转化。
21.3)转bncamta3基因超表达结构pgwb5-bncamta3油菜的创制和获取通过农杆菌介导法将bncamta3基因超表达结构pgwb5-bncamta3导入油菜，最后获取再生的转pgwb5-bncamta3的油菜t0代。具体操作步骤如下：
22.(i)种子清洗及萌发75％乙醇30-60s，无菌水1次，1min/次；0.15％升汞10min，无菌水清洗2次，1min/次；无菌水清洗30min，接种于无菌滤纸晾干；将种子接种于培养瓶，23℃暗培养5-6d；
23.(ii)预培养将萌发的油菜苗下胚轴切成0.4-0.6cm的切段，接种于预培养基，23℃光照培养2-3d；
24.(iii)农杆菌侵染及共培养挑取农杆菌于侵染液中，制备od
600
＝0.2的农杆菌重悬液，将外植体接种于农杆菌悬浮液中侵染10min。将侵染后的外植体接种于无菌滤纸上晾干，接种于共培养基上，23℃暗培养48-72h；
25.(iv)脱菌(延筛)将共培后的外植体接种于脱菌培养基上，23℃光照培养6d；
26.(v)筛选/分化将脱菌处理的外植体接种于筛选/分化培养基上，每皿接种30个外植体，23℃光照培养，15d换一次培养基；
27.(vi)生根培养将分化出的芽接种于生根培养基，23℃光照培养，直至生根。
28.4)转bncamta3基因超表达结构pgwb5-bncamta3的油菜纯合系的筛选鉴定和获取分别以潮霉素抗性和bncamta3基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况。潮霉素抗性筛选在含潮霉素的平板上针对油菜种子开展进行，观察能否在潮霉素抗性平板上正常生长成健康小苗。基因表达采用实时荧光定量pcr等方法进行检测。获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转bncamta3基因超表达结构pgwb5-bncamta3的油菜纯合系。
29.本发明获取的bncamta3超表达转基因油菜纯合系，在潮霉素抗性平板上全部能正常生长成健康小苗、且bncamta3基因表达水平均显著高于对照，为对照的4.9倍(图1b)。表明这些植株为真正的bncamta3基因超表达植株。
30.5)bncamta3基因超表达油菜纯合系的抗病性检测分析
以4)中获取的bncamta3基因超表达油菜纯合系为材料，通过接种核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)，检测分析其对油菜菌核病的抗性，从而明确bncamta3基因对油菜菌核病抗性的调控作用，并且明确是否可以通过构建该基因的超表达转基因油菜、采用基因工程技术创制和获取抗菌核病油菜新材料。
31.核盘菌的活化培养：选取饱满无污染的核盘菌菌核，用酒精灯灼烧过的无菌刀片将菌核切为两半，切面朝下放于pda固体平板上，23℃避光培养3d，选用直径4mm的打孔器打取菌落边缘向内3～5mm的菌丝块，带菌丝的一面朝下接种到新的pda固体平板上，23℃避光培养36h左右可进行接种。
32.核盘菌的接种：选取长势一致的油菜植株供接种。用直径4mm的打孔器打取菌落边缘向内3-5mm的菌丝块，菌丝面朝下接种到发育完全的叶片，每叶左右半叶对称各接种一个菌丝块，覆膜保湿，置于23℃温室培养，适当时间(约24h)后进行拍照记录，病斑面积用imagej软件分析。
33.接种实验重复三次。对病斑面积进行student's t-test检验统计分析，数据以平均值
±
标准差表示。差异显著性以不同数量*号表示(***，p《0.005)。结果显示，bncamta3超表达植株比非转基因的亲本植株表现出显著更抗病的表型，病斑面积比对照显著减小。表明超表达bncamta3基因显著增强了油菜对核盘菌的抗性(图2)。
34.这些结果表明，bncamta3超表达植株对菌核病的抗性显著高于野生型植株对照。bncamta3基因的超表达导致油菜对菌核病抗性的显著提高，因此，bncamta3对油菜菌核病的抗性起正调控作用。该结果还证明，可以通过构建bncamta3的超表达转基因油菜、采用基因工程技术创制和获取抗菌核病油菜新材料。
35.实施例2本发明实施例1通过构建bncamta3基因的超表达植株，阐明了油菜基因bncamta3对菌核病抗性的正调控功能。本实施例阐述bncamta3基因的rnai油菜构建技术，并通过该材料进一步证明bncamta3对菌核病抗性的正调控功能。本实施例提供通过构建bncamta3基因的rnai油菜来创建获取对菌核病抗性下降的油菜新材料的技术，这些材料可用于基因功能和作用机制分析等用途。主要步骤包括：
36.(1)bncamta3基因rnai结构的构建和获取根据本发明克隆的bncamta3序列设计引物bncamta3-f3(5
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ggagaggacacgctcgag atg gcg gaa gca aga cgt-3’，斜体部分为包含xho i酶切位点、与线性化载体pkannibal一致的序列)(序列如seq id：5所示)，以及bncamta3-r3(5
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tttccttaccaattggggtacc atg tag aac atc aac gct tcc ag-3’，斜体部分为包含kpn i酶切位点、与线性化载体pkannibal一致的序列)(序列如seq id：6所示)；bncamta3-f4(5
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ttcgaaatcgataagctt atg tag aac atc aac gct tcc ag-3’，斜体部分为包含hind iii酶切位点、与线性化载体pkannibal一致的序列)(序列如seq id：7所示)，以及bncamta3-r4(5
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ttaaagcaggactctaga atg gcg gaa gca aga cgt-3’，斜体部分为包含xba i酶切位点、与线性化载体pkannibal一致的序列)(序列如seq id：8所示)。以实施例1的1)中获取的pgwb5-bncamta3质粒为模板，bncamta3-f3和bncamta3-r3为引物对，通过pcr扩增获取长为300bp的bncamta3正向片段(片段1)，然后通过xho i/kpn i双酶切pkannibal载体(片段2)，将片段1、2用重组连接酶重组连接、转化、卡那霉素培养基平板筛选、酶切、pcr鉴定和测序
鉴定等步骤获取亚克隆了300bp bncamta3正向片段的中间表达载体pkannibal-bncamta3-1。将测序正确的质粒用xba i和hind iii双酶切，回收大片段(片段3)。同时以pgwb5-bncamta3质粒为模板，bncamta3-f4和bncamta3-r4为引物对，通过pcr扩增获取长为300bp的bncamta3反向片段(片段4)，并回收，将片段3、4用重组连接酶重组连接、转化、卡那霉素培养基平板筛选、酶切、pcr和测序鉴定等步骤获取含有正、反向bncamta3片段的pkannibal-bncamta3-rnai载体。将pkannibal-bncamta3-rnai载体和part27用not i酶切，t4连接。然后用xba i和xho i双酶切、pcr和测序鉴定是否在重组载体的pdk intron两端正反双向插入了300bp的bncamta3片段，从而获取rnai结构part27-bncamta3。
37.(2)转化bncamta3基因rnai结构的农杆菌的获取将bncamta3基因rnai结构(part27-bncamta3)通过电击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株，如eha105，在含壮观霉素的yep培养基上筛选转化子，再通过xba i和xho i双酶切和pcr鉴定，获取携带bncamta3基因rnai结构part27-bncamta3的农杆菌。用于下一步油菜的遗传转化。
38.(3)转bncamta3基因rnai结构油菜的创制和获取通过农杆菌介导法将bncamta3基因rnai结构part27-bncamta3导入油菜，最后获取转part27-bncamta3的油菜t0代。具体操作步骤同实施例1的3)中如述。
39.(4)转bncamta3基因rnai结构油菜纯合系的获取分别以抗生素抗性和bncamta3基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况。卡那霉素抗性筛选在含卡那霉素的平板上针对油菜种子开展进行，观察能否在卡那霉素抗性平板上正常生长成健康小苗。基因表达采用实时荧光定量pcr等方法进行检测。获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转bncamta3基因rnai结构part27-bncamta3的油菜纯合系。这些油菜纯合系在卡那霉素抗性平板上全部能正常生长成健康小苗、且bncamta3基因表达水平显著低于转空载体的对照。
40.本发明获取了bncamta3-rnai油菜纯合系，在卡那霉素抗性平板上能正常生长成健康小苗、且bncamta3基因表达水平显著低于野生型对照，只有对照植株的25％(图1a)。表明这些植株为真正的bncamta3基因rnai植株。
41.(5)抗菌核病的转bncamta3基因rnai结构油菜纯合系的筛选鉴定和获取以转bncamta3基因rnai结构(part27-bncamta3)的油菜纯合系为材料，检测分析对菌核病的抗性。接种方法和抗病性评价同实施例1)的5)中所述。
42.对本发明构建的bncamta3-rnai植株进行核盘菌接种分析的结果显示，bncamta3-rnai植株比非转基因植株对照明显更感病(图2)。bncamta3-rnai植株的病斑面积显著大于对照(图2)。表明bncamta3-rnai植株对菌核病的抗性显著低于对照。bncamta3基因的表达抑制导致油菜对菌核病抗性的显著降低。本发明通过构建bncamta3-rnai油菜成功地创制获取了菌核病抗性明显降低的油菜新材料。
43.综上，本发明结合图1-图2的结果，首次揭示了油菜钙信号途径关键基因bncamta3对油菜菌核病抗性起正调控作用。本发明提供了bncamta3在创制抗菌核病作物种质中的应用途径和应用技术，提供了实施例，并成功获取了抗菌核病油菜。