一种二阶段调节pH发酵生产结冷胶的方法

一种二阶段调节ph发酵生产结冷胶的方法
技术领域
1.本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种二阶段调节ph发酵生产结冷胶的方法。


背景技术：

2.结冷胶是一种线性四糖单元聚合体，它包含四个单糖分子，即β-1,3-d-葡萄糖，β-1,4-d-葡萄糖，β-1,4-d-葡萄糖醛酸和α-1,4-l-鼠李糖。其中d-葡萄糖、d-葡萄糖醛酸、l-鼠李糖按照2∶1∶1的摩尔比通过糖苷键连接构成结冷胶的基本单元，再通过重复聚合，构成结冷胶的主链，其相对分子质量一般大约在5
×
105～1
×
106道尔顿。
3.结冷胶由于其优良的稳定性，优越的凝胶性能，良好的配伍性等理化特性以及较高的安全性，在市场中的各个行业领域都得到了广泛的应用，如食品、化工、石油、医药等领域中都有结冷胶的参与应用。目前市场对结冷胶的需求量不断增加，但结冷胶的生产仍然存在一些缺陷，不能满足市场需要，因此提高结冷胶的产量具有一定的市场经济价值，需要进行进一步的深入研究。
4.为了生产结冷胶，科学家们不断地进行结冷胶生产菌株的筛选，其中少动鞘氨醇单胞菌是最早也是最多的被用于发酵产结冷胶的菌株，人们最开始在伊乐藻中得到该菌株，因此以前又被称作为伊乐假单胞菌。少动鞘氨醇单胞菌能够从各种各样的生物中分离获得，其来源广泛，除了潮湿的植物，还能从动物组织，池水水样，土壤等中获取得到，此菌种性能稳定，能够生产较多结冷胶，因此目前研究员们主要利用少动鞘氨醇单胞菌来进行发酵产结冷胶的研究。
5.近年来，国内外学者对发酵生产结冷胶的不同生产条件进行研究，其目的是提高结冷胶的生产量，降低生产成本，实现结冷胶的商业化应用。目前尚未见通过精细化ph调控来提升少动鞘氨醇单胞菌发酵生产结冷胶的产量的相关报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种二阶段调节ph发酵生产结冷胶的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明采用二阶段调节ph值的方法来提高少动鞘氨醇单胞菌发酵生产结冷胶的产量。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种二阶段调节ph发酵生产结冷胶的方法，发酵菌种为少动鞘氨醇单胞菌(sphingomonaspaucimobilis)atcc 31461；发酵工艺包括以下步骤：
9.第一阶段：将初始ph值设为7.5，发酵24h；
10.第二阶段：发酵24h后将ph值调节至5.6，发酵至结束。
11.进一步地，所述发酵工艺具体包括以下步骤：
12.第一阶段：将发酵培养基的初始ph值设为7.5，接种少动鞘氨醇单胞菌(sphingomonaspaucimobilis)atcc 31461，发酵培养24h；
13.第二阶段：发酵24h后将发酵液的ph值调节至5.6，继续发酵至64h。
14.进一步地，所述发酵培养基为:葡萄糖30g，酵母膏1g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾3g，硫酸钾1g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁1g，水1000ml，ph 7.0，121℃灭菌20min。
15.进一步地，第一阶段和第二阶段的培养条件均为30℃，200r/min。
16.进一步地，按体积分数计，所述少动鞘氨醇单胞菌的接种量为5％。
17.本发明公开了以下技术效果：
18.本发明以少动鞘氨醇单胞菌(sphingomonaspaucimobilis)atcc 31461为实验对象，采用二阶段调节ph值的方法来发酵生产结冷胶，本发明的方法在第一阶段能够促进少动鞘氨醇单胞菌生物量的大量增长，第二阶段能够促进及结冷胶的合成，提升结冷胶的产量，使得少动鞘氨醇单胞菌产结冷胶最高达到9.94g/l，明显高于一般发酵培养方法所得的结冷胶产量。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为不同发酵初始ph对生物量的影响；
21.图2为不同发酵初始ph对结冷胶产量的影响；
22.图3为不同发酵初始ph对结冷胶粘度的影响；
23.图4为初始发酵ph对结冷胶发酵生长曲线的影响，其中(a)是初始发酵ph 7.5对结冷胶发酵生长曲线的影响，(b)是初始发酵ph 6.5对结冷胶发酵生长曲线的影响；
24.图5为二阶段调节ph法菌体生物量和结冷胶产量。
具体实施方式
25.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
26.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
27.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
28.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实
施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
29.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
30.以下实施例或实验例中：
31.实验过程中使用的发酵菌株为少动鞘氨醇单胞菌(sphingomonas paucimobilis)atcc 31461，来自于合肥师范学院生命科学学院微生物实验室；
32.实验过程使用的仪器包括：电热恒温鼓风干燥机dhg-9143bs
‑ⅲ
(新苗医疗器械制造有限公司，上海)，立式压力蒸汽灭菌器ldzm-80kcs(申安医疗器械厂，上海)，高速台式冷冻离心机tcl-20m(湘仪离心机仪器有限公司，长沙)，旋转流变仪rs6000(thermo electron(karlsruhe)gmbh)，电炉a型(申航五金电器厂，丹阳)，电热恒温培养箱dnp-9162(三发科学仪器有限公司，上海)，冰箱bcd-190zm2(美菱，合肥)，电子天平ja2603(安亭电子仪器厂，上海)，超净工作台vs-840k(奥利星电子有限公司，浙江)，台式恒温振荡器bsd-tx270(博迅医疗生物仪器有限公司，上海)，气浴恒温振荡器thz-82b(金坛市医疗仪器厂，江苏)；
33.活化培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15～20g，水1000ml，ph 7.4，121℃灭菌20min；
34.种子培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000ml，ph 7.4，121℃灭菌20min；
35.发酵培养基：葡萄糖30g，酵母膏1g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾3g，硫酸钾1g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁1g，水1000ml，ph 7.0，121℃灭菌20min；
36.多糖的测定：将发酵液在10000r/min，4℃的条件下离心30min后，取出上清液加入两倍体积的95％乙醇，放入4℃冷藏柜中静置24h后，在10000r/min，4℃的条件下离心10min，所得多糖置于60℃电热恒温鼓风干燥机中干燥24h，直至恒重，称重，计算多糖的产量；
37.菌体生物量的测定：发酵液在10000r/min，4℃的条件下离心30min后，将上清液倒出，随后用蒸馏水洗涤沉淀的菌体3次后，所得菌体置于105℃电热恒温鼓风干燥机中干燥24h至恒重，称重，计算菌体的干重；
38.粘度的测定：使用流变仪测定粘度。设置流变仪参数，静态剪切速率为0.1～100/s，温度为20℃，每次设定20组数据进行测定，得出与剪切速率对应的剪切应力，粘度的计算公式为：粘度＝剪切应力/剪切速率。
39.实验例1
40.1.活化培养
41.将置于-80℃冰箱中甘油保藏的少动鞘氨醇单胞菌菌种接种于活化培养基上，在30℃恒温培养箱中培养24h。
42.2.种子培养
43.将活化的少动鞘氨醇单胞菌菌种接种到种子培养基(装液量为50ml/250ml锥形瓶)中，置于30℃、200r/min的摇床培养24h。
44.3.发酵培养
45.将种子培养基以5％(体积分数)的接种量接入到ph为5.5、6、6.5、7、7.5的发酵培养基(装液量为50ml/250ml锥形瓶)中，置于30℃、200r/min的摇床培养64h。用流变仪测定
不同ph条件下发酵液的粘度(图3)，再测定不同ph条件下的菌体生物量(图1)和发酵产生的结冷胶产量(图2)。
46.图1为不同发酵初始ph对生物量的影响，由图1可知，在初始ph为7.5的条件下，菌体生物量达到最大(2.97g/l)，此时多糖产量为5.30g/l。
47.图2为不同发酵初始ph对结冷胶产量的影响，由图2可知，在初始ph为6.5的条件下，结冷胶合成产量达到最大(8.52g/l)，此时菌体生物量为1.67g/l。且随着初始ph的降低，结冷胶的产量不断增加，由此可以推测出结冷胶适合在偏酸性的条件下生产。但是当初始ph为6时结冷胶的产量低于初始ph为6.5时结冷胶的产量，所以初始ph过低不利于结冷胶的合成。我们选择ph6.5和ph7.5为发酵初始ph进一步对少动鞘氨醇单胞菌发酵产结冷胶进行研究。
48.根据图3可知，在发酵初始ph为6.5时发酵液的粘度最大，在初始ph为8时发酵液的粘度最小，发酵液的粘度在偏弱酸性的条件下较大。将图2与图3进行对比可以看出，发酵液粘度随初始ph的变化趋势与结冷胶产量随初始ph的变化趋势相似，这可能是由于结冷胶的产量越多，发酵液的粘度越大，发酵液粘度随结冷胶产量的变化而变化导致的。而每个变量中发酵液粘度的误差可能是由于接种时接种量之间差别或者其他环境因素使得每瓶发酵液中结冷胶合成不均导致的。
49.实验例2
50.根据实验例1的实验结果，可以得出发酵初始ph为6.5时少动鞘氨醇单胞菌发酵产结冷胶最多，发酵初始ph为7.5时产生的菌体生物量最大。因此在发酵初始ph为6.5和7.5的条件下分别测定结冷胶和菌体的生长曲线，以及ph的变化曲线，结果见图4。
51.图4(a)是初始发酵ph 7.5对结冷胶发酵生长曲线的影响。由图4(a)可知，在发酵24～56h时发酵液中持续有大量结冷胶产生，其中24～32h内合成速度很快，虽然32h以后结冷胶仍然在不断生成，但生成速率变得缓慢，在56h后结冷胶的生成量几乎趋于稳定。在8～24h内菌体生物量迅速增加，达到24h后菌体生物量增长缓慢，处于稳定状态。同时在发酵过程中随着多糖的合成增加，ph值不断降低，且ph的变化范围很大，有继续下降的的趋势，而此时多糖的合成产量也仍在不断上升。这是因为随着结冷胶产量不断增加，合成的有机酸也逐渐增多，导致发酵液的ph逐渐降低。
52.图4(b)是初始发酵ph 6.5对结冷胶发酵生长曲线的影响。由图4(b)可知，在发酵16～40h时发酵液中结冷胶大量产生，并且在40h后结冷胶的产量逐渐趋于平稳，几乎保持不变。在8～24h内菌体生物量增长较为迅速，在24h后生物量虽然也有增长，但是增长趋势逐渐变得平缓，进入了增长稳定期。同时发酵液在发酵过程中ph值不断降低，这是因为随着结冷胶产量不断增加，合成的有机酸也逐渐增多，导致发酵液的ph逐渐降低，但当ph降到5.4以后，ph的下降趋势变得平缓，结冷胶的产量也几乎保持不变，逐渐稳定，生长也逐渐停止。
53.根据上述结果分析我们可以看出当发酵时间达到24h后，菌体生物量都几乎处于稳定增长期。在菌体生物量达到稳定后，多糖产量仍然在不断上升，出现上述现象可能是菌体与结冷胶在生长过程中竞争碳源导致的，根据少动鞘氨醇单胞菌发酵产结冷胶的机理，我们可以推测在发酵过程中当菌体的生长合成减慢，生物量稳定后，碳代谢朝着结冷胶合成的方向移动，导致结冷胶的产量不断增加。并且在ph降到5.4及以下甚至更低时多糖的生
产合成会逐渐停止，合成速度减慢，因此发酵液过酸不利于结冷胶的生产。
54.为了提高结冷胶的产量，采用两个ph阶段组合在一起的培养方法即二阶段调节ph法对少动鞘氨醇单胞菌发酵产结冷胶进行研究，也就是说菌体生长和结冷胶合成分别在不同的ph条件下进行。
55.采用二阶段调节ph的方法来提高结冷胶的产量，首先我们要找到发酵时间和ph的调节点。根据本实验例的实验结果，我们可以知道在少动鞘氨醇单胞菌发酵产结冷胶的过程中，发酵24h后结冷胶的生产量急速增加，菌体的增长趋势变得平缓，此时菌体生物量几乎达到最大(1.64g/l)，因此24h可以确定为发酵时间的调节点。同时根据初始ph 6.5和初始ph 7.5时少动鞘氨醇单胞菌发酵产结冷胶过程中ph的变化曲线，发酵至24h后，分别将发酵液ph调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，发现将ph调至5.5左右，结冷胶产量最大。由此得到第二阶段ph调控结冷胶生物产量的策略如下：第一个阶段是在初始ph 7.5的条件下发酵培养24h，使菌体实现快速生长直至生物量达到最大，第二阶段，将ph调至5.5，从而实现结冷胶的最大转化率。
56.实施例3
57.1.活化培养
58.将置于-80℃冰箱中甘油保藏的少动鞘氨醇单胞菌菌种接种于活化培养基上，在30℃恒温培养箱中培养24h。
59.2.种子培养
60.将活化的少动鞘氨醇单胞菌菌种接种到种子培养基(装液量为50ml/250ml锥形瓶)中，置于30℃、200r/min的摇床培养24h。
61.3.发酵培养
62.二阶段调节ph法发酵结冷胶：将种子培养基以5％(体积分数)的接种量接入到发酵培养基中，置于30℃、200r/min的摇床发酵培养，将发酵过程分为两个阶段，第一个阶段是将发酵培养基初始ph调节到7.5，发酵培养24h(期间ph不再调节)；第二个阶段是在发酵培养24h后，将ph调节至5.6继续进行培养至64小时(期间ph不再调节)，发酵结束。测定菌体生物量和结冷胶产量，结果见图5。
63.由图5可知，在第一阶段即发酵24h内菌体生物量急剧增长，而结冷胶生长较为缓慢，在第二阶段即发酵24h后菌体生物量的增长趋于稳定，生长速率减慢，同时结冷胶在持续合成，产量不断增加，直至培养64h后结冷胶的生长也没有出现稳定的趋势，仍然有上升的趋势。这是因为在第二阶段发酵液中的碳浓度升高，此时菌体生长速率趋于稳定，碳代谢朝着结冷胶合成的方向移动导致结冷胶的产量不断上升。在利用二阶段调节ph法发酵培养结束后，结冷胶产量最大为9.94g/l，而根据实验例1的实验研究结果可知结冷胶的最大产量为8.52g/l，两个数据进行比较可以看出结冷胶的产量得到了明显的提高。根据上述结果分析，我可以得出结论：采用二阶段调节ph的方法能够提高结冷胶的碳源转化率，有效地提高结冷胶的产量。
64.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。