一种利用木质纤维素发酵联产生物氢与微藻油脂的方法与流程

1.本发明属于生物资源综合利用及生物能源技术领域，具体涉及一种利用木质纤维素发酵联产生物氢与微藻油脂的方法。


背景技术：

2.化石燃料是满足世界能源需求的主要能源。然而，随着经济全球化和工业化进程的不断发展，不可再生的化石燃料的供应已经满足不了日益增长的能源需求，许多国家都在寻找其他燃料来源。生物质能是全球能源危机的有效替代资源，作为最具发展潜力的可再生资源，生物质能已成为新能源领域的重要一员。我国秸秆产量居于世界之首，每年产量超过八亿吨，大部分都未能高效利用，给环境带来了极大负担。利用木质纤维素类生物质生产清洁能源，在生产可再生绿色能源的同时，避免了木质纤维素资源未被充分利用而造成的环境污染和资源浪费。
3.氢能具有许多优点，如能量密度高、燃烧产物无污染物、可再生性等，目前被认为是最理想的清洁能源类型。微生物暗发酵制氢因其可以木质纤维素水解糖液为基质产氢，成为目前生物氢研究的重点。然而受限于产氢微生物对原料的转化率，其发酵废液仍残留有一定量的糖，以及一些低分子有机酸、醇类等代谢中间产物，这既造成木质纤维素资源利用不高，又带来了一系列新的环境问题。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用木质纤维素发酵联产生物氢与微藻油脂的方法。首先制备木质纤维素水解糖液，再利用木质纤维素水解糖液作为产氢菌的发酵培养基产氢，再利用产氢的发酵废液作为微藻的培养基进行微藻培养以生产油脂，进而实现生物氢与微藻油脂的联产，该方法提高了木质纤维素能源化利用的效率，降低了发酵废液对环境污染风险的问题。
5.本发明采取的技术方案如下：
6.一种利用木质纤维素发酵联产生物氢与微藻油脂的方法，所述方法包括以下步骤：
7.(1)将木质纤维素原料风干、粉碎后过筛；
8.(2)过筛后的木质纤维素进行稀酸水解预处理，得到木质纤维素酸水解液，然后加入碱调节其ph至10.0，离心，收集上清液并调节其ph值至5.0，再经脱色处理得到木质纤维素水解糖液，将木质纤维素水解糖液作为发酵培养基的主要成分；木质纤维素水解糖液中的主要成分为葡萄糖和木糖；
9.(3)将产氢菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵，并收集发酵过程中产生的氢气，发酵后的废液经离心、过滤除菌，然后向滤液中补充微量元素作为微藻培养基；
10.(4)将微藻种子液接种至微藻培养基中进行培养，培养结束后离心、洗涤沉淀得到微藻，然后提取微藻中的油脂。
11.步骤(1)中，所述木质纤维素原料为棉秆、稻草、麦秸、玉米秆、玉米芯中的任意一种或多种。
12.步骤(1)中，使用20
‑
40目的筛网进行过筛。
13.步骤(2)中，所述稀酸为稀硫酸；所述稀酸的体积浓度为1％
‑
5％。
14.步骤(2)中，所述木质纤维素与稀酸的固液比为1g:3
‑
8ml；所述水解预处理的条件为121
‑
135℃水解30
‑
60min。
15.步骤(2)中，所述发酵培养基的组成为：每升木质纤维素水解糖液中含有牛肉膏3
‑
5g、蛋白胨5
‑
10g、nacl 2
‑
5g、kh2po
4 0.3
‑
0.5g、mgso4·
7h2o 0.2
‑
0.5g，ph 6.5
‑
8.0；所述木质纤维素水解糖液的浓度为30
‑
50g/l。
16.步骤(2)中，室温下用氢氧化钙将木质纤维素酸水解液的ph值调至10.0以脱去酸类毒性物质；使用体积浓度为1
‑
5％的稀硫酸将上清液的ph值调节至5.0。
17.步骤(2)中，所述离心的条件为4000
‑
6000r/min离心10
‑
20min。
18.步骤(3)中，所述产氢菌为klebsiella sp.，其能有效利用木质纤维素水解糖液中的葡萄糖和木糖发酵产氢。
19.步骤(3)中，所述产氢菌的种子液浓度为od
600
＝0.8
‑
1.0；所述产氢菌的种子液按5
‑
10％发酵培养基重量的接种量接种至发酵培养基中，在30
‑
37℃下发酵72
‑
120h。
20.步骤(3)中，每升微藻培养基中含有nano31.5g、k2hpo
4 0.04g、mgso4·
7h2o 0.075g、cacl2·
2h2o 0.036g、na2co
3 0.02g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁0.006g、edtana
2 0.001g、h3bo
3 2.86mg、mncl2·
4h2o 1.86mg、znso4·
7h2o 0.22mg、na2moo4·
2h2o 0.39mg、cuso4·
5h2o 0.08mg、co(no3)2·
6h2o 0.05mg，ph调节至7.5。
21.步骤(3)中，所述过滤除菌为使用0.22μm ca
‑
cn水系混合纤维微孔滤膜进行过滤除菌，此种过滤除菌方式滤液中的各营养组分保留较好，以便于后续更好的培养微藻。
22.步骤(4)中，微藻种子液中微藻的细胞数为107～108cfu/ml；微藻种子液按照10％微藻培养基重量的接种量接种至微藻培养基，培养温度20
‑
28℃，光照强度4000
‑
6000lx，光暗周期16h：8h，培养时间144h
‑
240h。
23.步骤(4)中，微藻为富含油脂、具备异养或兼养生长能力的单细胞真核藻类，优选为小球藻chlorella sp.、栅藻scendesmus sp.。
24.步骤(4)中，提取微藻中油脂的方法为氯仿
‑
甲醇法，具体操作流程为：按每克湿藻体加4mol/l的盐酸10
‑
20ml，振荡混匀，室温下处理10
‑
20min后，沸水浴3
‑
5min，立即置于
‑
20℃速冷。冷却后，加入与盐酸等比例甲醇，振荡2
‑
3min混匀，加入与甲醇等体积的氯仿，振荡2
‑
3min，4000
‑
6000r/min离心10
‑
20min，收集下层氯仿层，再加入与氯仿等体积的0.15％氯化钠溶液，混匀后4000
‑
6000r/min离心10
‑
20min，收集下层氯仿层，用已知重量的接收瓶收集所有氯仿层溶液，在70
‑
80℃水浴锅蒸去氯仿，得到油脂。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
26.(1)本发明以木质纤维素为原料，依次培养产氢细菌和产油微藻生产氢气和油脂，木质纤维素原料来源广泛、价格低廉，有助于降低生物能源成本，促进产业发展。
27.(2)本发明采取以产氢细菌利用木质纤维素水解糖液发酵产氢、进一步利用产氢废液培养产油微藻的工艺，一方面节约了微藻培养所需用水和碳源，另一方面还充分提高了木质纤维素原料的转化利用率，可降低水资源利用和产氢废液的环境风险，实现了生物
能源的清洁生产与资源环境保护的有机结合。
28.(3)本发明所述工艺，可获得1700
‑
3200ml/l的累积产氢量，微藻油脂产率0.80
‑
1.90g/l，要显著高于其它工艺所得生物氢和微藻油脂产率。
附图说明
29.图1为本发明实施例3中产氢菌的累积产氢量；
30.图2为本发明实施例3中微藻的油脂产量；
31.图3为本发明实施例4中产氢菌的累积产氢量；
32.图4为本发明实施例4中微藻的油脂产量；
33.图5为本发明实施例5中产氢菌的累积产氢量；
34.图6为本发明实施例5中微藻的油脂产量；
35.图7为本发明实施例6中产氢菌的累积产氢量；
36.图8为本发明实施例6中微藻的油脂产量。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明进行详细说明。
38.实施例中的：
39.产氢菌klebsiella sp.种子液的获取过程为：用接种环无菌操作从试管斜面保藏菌种中挑取5环接种于种子培养基中，种子培养基装液量为100ml/250ml三角瓶，在37℃、120r/min条件下振荡培养18h，得到klebsiella sp.种子液。
40.小球藻chlorella sp.种子液的获取过程为：用接种环无菌操作从试管斜面保藏的chlorella sp.藻种中蘸取少量藻细胞，在固体平板培养基上z字形划线接种，划线后置于光照培养箱中活化培养6d，培养条件为：光照强度5000lx，温度28℃，光暗比为16h：8h；然后再接种到种子培养基中扩大培养至小球藻的浓度为107～108cfu/ml。
41.栅藻scendesmus sp.种子液的获取过程为：用接种环无菌操作从试管斜面保藏的scendesmus sp.藻种中蘸取少量藻细胞，在固体平板培养基上z字形划线接种，划线后置于光照培养箱中活化培养6d，培养条件为：光照强度4000lx，温度25℃，光暗比为16h：8h；然后再接种到种子培养基中扩大培养至栅藻的浓度为107～108cfu/ml。
42.微藻中油脂的提取方法为：按每克湿藻体加4mol/l的盐酸10ml，振荡混匀，室温下处理10min后，沸水浴3min，立即置于
‑
20℃速冷。冷却后，加入与盐酸等比例甲醇，振荡2min混匀，甲醇与氯仿按体积比为1:1加入氯仿，振荡2min，4000r/min离心20min，收集下层氯仿层，再加入与氯仿等体积的0.15％氯化钠溶液，混匀后4000r/min离心20min，收集下层氯仿层，用已知重量的接收瓶收集所有氯仿层溶液，在80℃水浴锅蒸去氯仿，得到油脂。
43.实施例1
44.(1)将棉秆、稻草经粉碎后风干、粉碎后过20目筛，采用正交试验优化稀酸水解条件，考察因素为稀硫酸浓度、水解时间、固液比和水解温度，具体因素水平见表1。
45.(2)将棉秆、稻草经上述不同条件水解后，抽滤，得到酸水解液，室温下用氢氧化钙将水解液ph值调至10.0以脱去酸类毒性物质，6000r/min离心15min，收集上清液并用稀硫酸将ph值调节至5.0，再经脱色树脂脱色，得到各处理条件的棉秆、稻草水解糖液。以水解液
中的葡萄糖和木糖浓度为检测指标，经正交分析得到最优的酸水解条件，结果如表2所示。
46.表1棉秆、稻草酸水解正交试验因素水平表
[0047][0048]
表2棉秆酸水解正交试验结果分析
[0049][0050]
注：k1、k2、k3为每个因素在各个水平下的指标平均值，例如，表2中因素a的棉秆水解液葡萄糖浓度的k1值，为序号1
‑
3三个处理对应葡萄糖浓度的平均值，k2值为序号4
‑
6三个处理对应葡萄糖浓度的平均值，k3值为序号7
‑
9三个处理对应葡萄糖浓度的平均值；因素b的棉秆水解液葡萄糖浓度的k1值，为序号1、4、7三个处理对应葡萄糖浓度的平均值，以此类推；r为极差值，即每个因素下k的最大值减去最小值。
[0051]
经正交试验优化结果表明：在以棉秆和稻草两种木质纤维素基质进行酸水解制备糖液时，最优的水解条件组合为：a3b2c2d3,即稀硫酸浓度4％、固液比1:5、水解时间30min、水解温度121℃，在此条件下可获得最大的葡萄糖和木糖收率，优于其余条件。
[0052]
实施例2
[0053]
(1)分别将棉秆、稻草经粉碎后风干、粉碎后过20目筛，配制体积浓度为4％的稀硫酸溶液，调节棉秆或稻草与稀硫酸溶液的固液比为1g:5ml，于121℃下水解30min，抽滤，分
别得到棉秆、稻草的酸水解液，室温下用氢氧化钙将水解液ph值调至10.0以脱去酸类毒性物质，6000r/min离心10min，收集上清液并用稀硫酸将ph值调节至5.0，再经脱色树脂脱色，即分别得到棉秆水解糖液、稻草水解糖液。
[0054]
(2)分别调节棉秆水解糖液、稻草水解糖液浓度为40g/l，配制产氢发酵培养基，产氢发酵培养基的组成为牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl 5g、kh2po
4 0.5g、mgso4·
7h2o 0.5g，上述水解糖液1000ml，ph值调为7.5，调节产氢菌klebsiella sp.种子液浓度od
600
＝0.9，按10％的接种量接种至发酵培养基中，在37℃下发酵120h后，得到产氢废液。
[0055]
(3)将发酵产氢废液4000r/min离心20min，上清液分别用121℃高压蒸汽灭菌15min、0.22μm ca
‑
cn水系混合纤维微孔滤膜过滤除菌进行处理，并检测处理前后上清液中的主要成分，结果见表3。
[0056]
表3不同除菌方式处理前后发酵产氢废液中的主要成分
[0057][0058]
结果表明：以不同的木质纤维素基质水解糖液为基质，klebsiella sp.发酵后的产氢废液中的成分主要以葡萄糖和木糖为主，含有一定量的乙酸、乙醇和乳酸，且不同基质各组分浓度有较大差异。利用0.22μm ca
‑
cn水系混合纤维微孔滤膜过滤除菌产氢废液，各营养组分保留较好，而121℃、15min灭菌处理后产氢废液中的有机酸组分损失较大，乙酸和乙醇没有检出，同时葡萄糖和木糖也有一定的损耗，因此高温高压灭菌处理不能很好地反应发酵液实际，过滤除菌更有利于保留产氢废液的营养组分，且能耗等成本低。
[0059]
实施例3
[0060]
利用木质纤维素发酵联产生物氢与微藻油脂的方法，包括以下步骤：
[0061]
(1)棉秆经粉碎后风干、粉碎后过20目筛，配制体积浓度为4％的稀硫酸溶液，调节棉秆与稀硫酸溶液的固液比为1g:5ml，于121℃下水解30min，抽滤，得到棉秆酸水解液，室温下用氢氧化钙将水解液ph值调至10.0以脱去酸类毒性物质，6000r/min离心10min，收集上清液并用稀硫酸将ph值调节至5.0，再经脱色树脂脱色，即得到棉秆水解糖液。
[0062]
(2)调节棉秆水解糖液浓度为40g/l，配制产氢发酵培养基，产氢发酵培养基的组成为牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl 5g、kh2po
4 0.5g、mgso4·
7h2o 0.5g，上述水解糖液1000ml，ph值调为7.5，调节产氢菌klebsiella sp.种子液浓度od
600
＝0.9，按5％的接种量接种至产氢发酵培养基中，在30℃下发酵，得到累积产氢量曲线如图1所示，从图1可知，发酵120h时的累积产氢量达到1855ml/l。
[0063]
(3)将步骤(2)中的发酵产氢废液4000r/min离心20min，上清液经0.22μmca
‑
cn水系混合纤维微孔滤膜过滤除菌，补充适量微量元素制作微藻培养基，每升微藻培养基中含有nano31.5g、k2hpo
4 0.04g、mgso4·
7h2o 0.075g、cacl2·
2h2o 0.036g、na2co
3 0.02g、柠檬
酸0.006g、柠檬酸铁0.006g、edtana20.001g、h3bo
3 2.86mg、mncl2·
4h2o 1.86mg、znso4·
7h2o 0.22mg、na2moo4·
2h2o 0.39mg、cuso4·
5h2o 0.08mg、co(no3)2·
6h2o 0.05mg，ph调为7.5，小球藻chlorella sp.经活化后接种至种子培养基中培养至微藻的浓度为107cfu/ml，然后按10％的接种量接种培养，培养温度28℃，光照强度5000lx，光暗周期16h：8h，每2d测定微藻油脂产量，结果见图2。从图中可以看出，培养至192h时，小球藻chlorella sp.的油脂产量达到1.80g/l。
[0064]
实施例4
[0065]
利用木质纤维素发酵联产生物氢与微藻油脂的方法，包括以下步骤：
[0066]
(1)棉秆经粉碎后风干、粉碎后过20目筛，配制体积浓度为4％的稀硫酸溶液，调节棉秆与稀硫酸溶液的固液比为1g:5ml，于121℃下水解30min，抽滤，得到棉秆酸水解液，室温下用氢氧化钙将水解液ph值调至10.0以脱去酸类毒性物质，5000r/min离心15min，收集上清液并用稀硫酸将ph值调节至5.0，再经脱色树脂脱色，即得到棉秆水解糖液。
[0067]
(2)调节棉秆水解糖液浓度为30g/l，配制产氢发酵培养基，产氢发酵培养基的组成为牛肉膏5g、蛋白胨5g、nacl 3g、kh2po
4 0.3g、mgso4·
7h2o 0.2g，上述水解糖液1000ml，ph值调为7.0，调节产氢菌klebsiella sp.种子液浓度od
600
＝0.8，按8％的接种量接种至产氢发酵培养基中，在35℃下发酵，得到累积产氢量曲线如图3所示，从图3可知，发酵120h时的累积产氢量为1700ml/l。
[0068]
(3)将步骤(2)中的发酵产氢废液5000r/min离心15min，上清液经0.22μmca
‑
cn水系混合纤维微孔滤膜过滤除菌，补充适量微量元素制作微藻培养基，每升微藻培养基中含有nano31.5g、k2hpo
4 0.04g、mgso4·
7h2o 0.075g、cacl2·
2h2o 0.036g、na2co
3 0.02g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁0.006g、edtana20.001g、h3bo
3 2.86mg、mncl2·
4h2o 1.86mg、znso4·
7h2o 0.22mg、na2moo4·
2h2o 0.39mg、cuso4·
5h2o 0.08mg、co(no3)2·
6h2o 0.05mg，ph值调为7.5，栅藻scendesmus sp.经活化后接种至种子培养基中培养至栅藻的浓度为108cfu/ml，然后按5％比例接种培养，培养温度20℃，光照强度4000lx，光暗周期16h：8h，每2d测定微藻油脂产量，结果见图4。从图中可以看出，培养至144h时，栅藻scendesmus sp.的油脂产量达到1.11g/l。
[0069]
实施例5
[0070]
利用木质纤维素发酵联产生物氢与微藻油脂的方法，包括以下步骤：
[0071]
(1)稻草经粉碎后风干、粉碎后过20目筛，配制体积浓度为4％的稀硫酸溶液，调节棉秆与稀硫酸溶液的固液比为1g:5ml，于121℃下水解30min，抽滤，得到稻草酸水解液，室温下用氢氧化钙将水解液ph值调至10.0以脱去酸类毒性物质，4500r/min离心15min，收集上清液并用稀硫酸将ph值调节至5.0，再经脱色树脂脱色，即得到稻草水解糖液。
[0072]
(2)调节稻草水解糖液浓度为40g/l，配制产氢发酵培养基，产氢发酵培养基的组成为牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl 5g、kh2po
4 0.5g、mgso4·
7h2o 0.5g，上述水解糖液1000ml，ph值调为7.5，调节产氢菌klebsiella sp.种子液浓度od
600
＝1.0，按10％的接种量接种至发酵培养基中，在37℃下发酵，得到累积产氢量曲线如图5所示，从图5可知，发酵120h时的累积产氢量为3200ml/l。
[0073]
(3)将步骤(2)中的发酵产氢废液4500r/min离心15min，上清液经0.22μmca
‑
cn水系混合纤维微孔滤膜过滤除菌，补充适量微量元素制作微藻培养基，每升微藻培养基中含
有nano31.5g、k2hpo
4 0.04g、mgso4·
7h2o 0.075g、cacl2·
2h2o 0.036g、na2co
3 0.02g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁0.006g、edtana20.001g、h3bo
3 2.86mg、mncl2·
4h2o 1.86mg、znso4·
7h2o 0.22mg、na2moo4·
2h2o 0.39mg、cuso4·
5h2o 0.08mg、co(no3)2·
6h2o 0.05mg，栅藻scendesmus sp.经活化后接种至种子培养基中培养至栅藻的浓度为107cfu/ml，然后按10％比例接种培养，培养温度25℃，光照强度6000lx，光暗周期16h：8h，每2d测定微藻油脂产量，结果见图6。从图中可以看出，培养至144h时，栅藻scendesmus sp.的油脂产量达到1.76g/l。
[0074]
实施例6
[0075]
利用木质纤维素发酵联产生物氢与微藻油脂的方法，包括以下步骤：
[0076]
(1)稻草经粉碎后风干、粉碎后过20目筛，配制体积浓度为4％的稀硫酸溶液，调节棉秆与稀硫酸溶液的固液比为1g:5ml，于121℃下水解30min，抽滤，得到稻草酸水解液，室温下用氢氧化钙将水解液ph值调至10.0以脱去酸类毒性物质，6000r/min离心20min，收集上清液并用稀硫酸将ph值调节至5.0，再经脱色树脂脱色，即得到稻草水解糖液。
[0077]
(2)调节稻草水解糖液浓度为50g/l，配制产氢发酵培养基，产氢发酵培养基的组成为牛肉膏3g、蛋白胨10g、nacl 5g、kh2po
4 0.5g、mgso4·
7h2o 0.3g，上述水解糖液1000ml，ph值调为8.0，调节产氢菌klebsiella sp.种子液浓度od
600
＝0.8，按8％的接种量接种至发酵培养基中，在32℃下发酵，得到累积产氢量曲线如图7所示，从图7可知，发酵120h时的累积产氢量为2850ml/l。
[0078]
(3)将步骤(2)中的发酵产氢废液4000r/min离心20min，上清液经0.22μmca
‑
cn水系混合纤维微孔滤膜过滤除菌，补充适量微量元素制作微藻培养基，每升微藻培养基中含有nano31.5g、k2hpo
4 0.04g、mgso4·
7h2o 0.075g、cacl2·
2h2o 0.036g、na2co
3 0.02g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁0.006g、edtana20.001g、h3bo
3 2.86mg、mncl2·
4h2o 1.86mg、znso4·
7h2o 0.22mg、na2moo4·
2h2o 0.39mg、cuso4·
5h2o 0.08mg、co(no3)2·
6h2o 0.05mg，ph值调为7.5，小球藻chlorella sp.经活化后接种至种子培养基中培养至小球藻的浓度为108cfu/ml，然后按6％比例接种培养，培养温度28℃，光照强度6000lx，光暗周期16h：8h，每2d测定微藻油脂产量，结果见图8。从图中可以看出，培养至240h时，小球藻chlorella sp.的油脂产量达到1.90g/l。
[0079]
上述参照实施例对一种利用木质纤维素发酵联产生物氢与微藻油脂的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。