一种特异性靶向星形胶质细胞的重组腺相关病毒及其应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特异性靶向星形胶质细胞的重组腺相关病毒及其应用。


背景技术：

2.大脑网络由各种各样的神经细胞组成，神经细胞主要包括神经元和胶质细胞(neuroglia)两大类，分别在大脑中扮演不同的角色。神经胶质细胞的数量比神经元多几十倍，一般可分为小胶质细胞、星形胶质细胞以及少突胶质细胞等。随着神经科学的发展，人们发现不同类型的神经细胞具有不同的网络结构连接与功能，其发生变异可引起不同的大脑疾病和行为障碍。越来越多的证据表明星形胶质细胞跟各种脑疾病相关(nature.2014；509(7499):189-194.)。因此，有必要开发特异性靶向星形胶质细胞的工具，用于解析星形胶质细胞的结构与功能，为脑疾病的治疗提供理论依据和技术支撑。
3.目前，科研工作者对星形胶质细胞的解析主要依赖于转基因动物。然而，转基因动物，如小鼠、大鼠、狗、猪和猴子等，具有繁殖周期长、饲养成本高以及不能灵活地携带目的基因进行神经细胞的操控与疾病的治疗。因此，继续发展能够特异性靶向星形胶质细胞的方法具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种特异性靶向星形胶质细胞的重组腺相关病毒及其应用。
5.本发明第一方面提供一种重组腺相关病毒核心质粒，其包含两端反向末端重复序列itr、gfaabc1d启动子、外源基因、转录调节元件wpre和转录终止序列sv40polya。
6.进一步地，所述外源基因包括报告基因；
7.优选地，所述报告基因为egfp。
8.进一步地，所述重组腺相关病毒核心质粒的核苷酸序列如seq id no：3所示。
9.本发明第二方面提供一种重组腺相关病毒载体系统，包括所述的腺相关病毒核心质粒、重组腺相关病毒包装质粒和腺病毒元件辅助质粒。
10.进一步地，所述重组腺相关病毒包装质粒包括2型腺相关病毒的rep基因和11型腺相关病毒的cap基因；
11.优选地，所述重组腺相关病毒包装质粒以paav-rc2/1为骨架；
12.优选地，所述腺病毒元件辅助质粒为pad-helper。
13.进一步地，所述重组腺相关病毒包装质粒的核苷酸序列如seq id no：4所示。
14.本发明第三方面提供一种重组腺相关病毒，由所述的腺相关病毒核心质粒、重组腺相关病毒包装质粒和腺病毒元件辅助质粒共转染包装细胞系获得。
15.进一步地，所述包装细胞系选自hek-293细胞、hek-293t细胞或hek-293ft细胞；
16.优选地，所述的腺相关病毒核心质粒、重组腺相关病毒包装质粒和腺病毒元件辅
助质粒的分子数为1:1:1。
17.进一步地，所述重组腺相关病毒包装质粒包括2型腺相关病毒的rep基因和11型腺相关病毒的cap基因；
18.优选地，所述重组腺相关病毒包装质粒以paav-rc2/1为骨架；
19.优选地，所述重组腺相关病毒包装质粒的核苷酸序列如seq id no：4所示；
20.优选地，所述腺病毒元件辅助质粒为pad-helper。
21.本发明第四方面提供所述的重组腺相关病毒核心质粒、所述的重组腺相关病毒载体系统或所述的重组腺相关病毒在特异性靶向星形胶质细胞中的应用。
22.本发明的有益效果为；
23.本发明首次将paav2/11作为基因转移载体实现星形胶质细胞的特异性靶向，为神经科学研究、疾病模型建立和基因治疗等提供了更好的工具和技术支撑，具有广泛的应用价值和市场前景。
附图说明
24.图1为重组腺相关病毒核心质粒表达载体图谱。
25.图2为重组腺相关病毒感染背侧海马区域的信号。其中，“dapi”代表对细胞核进行染色的信号，为蓝色荧光；“gfap”代表对星形胶质细胞标志物gfap进行染色后的信号，为红色荧光；“egfp”代表raav2/11-gfaabc1d-egfp-wpre-sv40polya标记的细胞信号，为绿色荧光，与红色荧光共标。
具体实施方式
26.为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
27.实施例1：重组腺相关病毒核心质粒的构建
28.使用bglii和nhei(newenglandbiolabs)限制性内切酶酶切载体pzac2.1-gfaabc1d-rm3d-mcherry-sv40polya(购自addgene,编号：92285)，用胶回收试剂盒(omega公司)回收gfaabc1d启动子片段，用t4连接酶(购于takara公司)连入同样经bglii和nhei双酶切的腺相关病毒载体paav-hsyn-egfp-wpre-sv40polya(布林凯斯(深圳)生物技术有限公司)，连接产物转化大肠杆菌stbl3感受态细胞，置于35℃培养箱过夜，挑取单克隆进行菌落pcr鉴定，鉴定引物为gfaabc1d-f(seq id no.1)和gfaabc1d-r(seq id no.2)，对阳性菌落进行扩大培养和质粒提取，质粒用bglii和nhei双酶切验证和测序，测序正确的质粒命名为paav-gfaabc1d-egfp-wpre-sv40polya。构建获得的重组腺相关病毒核心质粒paav-gfaabc1d-egfp-wpre-sv40polya表达载体的图谱如图1所示，其基因序列如seq id no.3所示。本发明所有pcr使用引物合成和测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
29.实施例2：重组腺相关病毒的制备
30.利用重组腺相关病毒包装质粒paav-rc2/11表达载体包装重组腺相关病毒，将重组腺相关病毒核心质粒paav-gfaabc1d-egfp-wpre-sv40polya与paav-rc2/11血清型aav衣
壳质粒、腺病毒元件辅助质粒pad-helper按质粒分子数1：1：1共转染hek-293t细胞，转染72小时后分别收集上清和细胞沉淀，用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用sybrgreenqpcr法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得raav2/11-gfaabc1d-egfp-wpre-sv40polya病毒的滴度为6.0
×
10
12
vg/ml。
31.重组腺相关病毒包装质粒paav-rc2/11具有如seq id no：4所示的核苷酸序列。
32.实施例3：重组腺相关病毒的活体应用
33.将制备的raav2/11-gfaabc1d-egfp-wpre-sv40polya(100nl/只)病毒通过脑立体定位方式注射于8-10周龄c57bl/6小鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)的背侧海马区域，3周后灌流取脑，小鼠脑组织经depc处理过的pfa溶液固定4小时后再用depc处理过的30％蔗糖-pbs溶液脱水48小时，将脱水后的脑组织用组织包埋剂充分包埋并用冰冻切片机切成40μm厚度的脑片。将包含背侧海马区域的脑片利用gfap抗体进行免疫组化染色，之后贴片并使用玻片扫描仪显微镜对其进行成像。活体检测结果可以看出，raav2/11-gfaabc1d-egfp-wpre-sv40polya标记的绿色荧光信号与星形胶质细胞标志物gfap的红色信号共标，表明raav2/11-gfaabc1d-egfp-wpre-sv40polya重组腺相关病毒能够特异性靶向星形胶质细胞。图2为raav2/11-gfaabc1d-egfp-wpre-sv40polya重组腺相关病毒感染背侧海马区域的信号。
34.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
35.本发明的核苷酸序列如下：
36.seq id no：1
37.aacatatcctggtgtggagt
38.seq id no：2
39.gctagcctatagtgagtcgta
40.seq id no：3
41.cgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaaggccttaattaggctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatctaacatatcctggtgtggagtaggggacgctgctctgacagaggctcgggggcctgagctggctctgtgagctggggaggaggcagacagccaggccttgtctgcaagcagacctggcagcattgggctggccgccccccagggcctcctcttcatgcccagtgaatgactcaccttggcacagacacaatgttcggggtgggcacagtgcctgcttcccgccgcaccccagcccccctcaaatgccttccgagaagcccattgagcagggggcttgcattgcaccccagcctgacagcctggcatcttgggataaaagcagcacagccccctaggggctgcccttgctgtgtggcgccaccggcggtggagaacaaggctctattcagcctgtgcccaggaaaggggatcaggggatgcccaggcatggacagtgggtggcagggggggagaggagggctgtctgcttcccagaagtccaaggacacaaatgggtgaggggagagctctccccatagctgggctgcggcccaaccccaccccctcaggctatgccagggggtgtt
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42.seq id no：4
43.gctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgggggagctcgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggctcttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatca
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