Chi3l1在调控hUC-MSCs抑制Th17分化介导的免疫调节作用上的应用的制作方法

chi3l1在调控huc
‑
mscs抑制th17分化介导的免疫调节作用上的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及间充质干细胞免疫调节作用机制研究。


背景技术：

2.人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stemcells,huc
‑
mscs)是存在于脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种间充质干细胞，具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的多向分化潜能和强大的免疫调节作用。huc
‑
mscs因其取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，分泌细胞生长因子种类多，便于扩增和传代，同时无配型、排异等优点，成为临床研究和应用的理想mscs 来源。与经典的骨髓mscs比较，huc
‑
mscs具有与骨髓源mscs相似的生物学特性，但在增殖能力、cfu
‑
f形成、cd106、hla
‑
i的表达和神经诱导分化等方面优于骨髓mscs，因此，huc
‑
mscs具有更广阔的临床应用前景。
3.免疫抑制功能是mscs独特的生物学特性和被应用与研究的基础。大量研究表明，huc
‑
mscs与其他组织来源的mscs具有类似的免疫调节作用，主要是通过分泌和表达一系列免疫抑制因子、细胞因子、生长因子和外泌体等调控炎症反应，包括il
‑
6、tgfβ、pge2、ido、inos、趋化因子和外泌体等，其中ido是huc
‑
mscs重要的免疫调节分子，这些分子共同作用构成复杂的调节网络，抑制多种免疫细胞的活化和功能，包括巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、t细胞和b细胞等；这些调节因子不仅可抑制t淋巴细胞增殖，同时还可抑制初始t细胞向th1和th2细胞亚群的分化，促进调节性t细胞(regulatory t cells,treg)的产生等，从而抑制机体的炎症反应，达到治疗急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease, agvhd)等炎性疾病的目的。
4.但最新研究表明，炎症因子ifn
‑
γ联合tnf
‑
α或il
‑
1β预处理的mscs 可有效治疗agvhd，而在骨髓移植同一天输注单纯mscs，即炎症反应尚未开始时，治疗效果不显著。同时，体内移植mscs治疗缓解期的实验性自身免疫性脑脊髓炎几乎没有疗效，这些结果均提示mscs免疫调节作用具有可塑性，依赖于强炎症微环境赋能才可发挥免疫抑制作用。目前认为低浓度的炎症因子不足以诱导mscs免疫抑制分子开关inos或ido的表达，但可促进趋化因子的高表达，进而趋化淋巴细胞至其周围，加剧炎症反应。但迄今为止，这一理论是否适用所有组织来源的mscs,以及是否为huc
‑
mscs治疗agvhd主要作用机制仍不清楚。


技术实现要素：

5.基于此，有必要提供了chi3l1在调控人脐带间充质干细胞免疫调节作用上的应用。
6.为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
7.骨髓、脐带、胎盘、羊膜四种msc中，chi3l1在脐带msc中高表达；炎症因子ifn
‑
γ联合tnf
‑
α刺激huc
‑
mscs高表达chi3l1；chi3l1敲低的 huc
‑
mscs抑制th17细胞分化作用降
低；huc
‑
mscs分泌的chi3l1抑制cd4 细胞的p
‑
stat3表达，从而抑制th17分化。
8.首先，本发明提供了chi3l1在调控人脐带间充质干细胞免疫调节作用上的应用，所述免疫调节作用为抑制th17细胞分化。
9.优选的，敲低所述chi3l1基因后，人脐带间充质干细胞抑制th17细胞分化作用降低。
10.优选的，所述chi3l1基因通过调节cd4细胞的p
‑
stat3表达调控人脐带间充质干细胞抑制th17细胞分化作用。
11.优选的，所述chi3l1抑制cd4细胞的p
‑
stat3表达，从而抑制th17 细胞分化。
12.优选的，炎症因子ifn
‑
γ联合tnf
‑
α刺激人脐带间充质干细胞可以高表达所述chi3l1基因。
13.进一步地，本发明提供一种调控chi3l1基因表达的制剂，所述制剂中含有促进chi3l1基因表达的试剂，所述促进chi3l1基因表达的试剂中含有炎症因子ifn
‑
γ和tnf
‑
α。
14.进一步地，本发明还提供一种调控人脐带间充质干细胞抑制th17细胞分化作用的制剂，所述制剂含有调控chi3l1基因表达的制剂或p
‑
stat3抑制剂或p
‑
stat3促进剂，上调chi3l1基因表达的制剂抑制th17细胞分化，下调chi3l1基因表达的制剂促进th17细胞分化，所述p
‑
stat3抑制剂抑制 th17细胞分化，所述p
‑
stat3促进剂促进th17细胞分化。
15.进一步地，本发明还提供一种调控人脐带间充质干细胞的方法，所述方法是通过调控chi3l1基因的表达进而调节p
‑
stat3，从而调控抑制th17细胞分化作用。
16.优选的，所述chi3l1基因通过调控cd4细胞实现调节p
‑
stat3。
17.进一步地，本发明还提供一种cd4细胞表达p
‑
stat3的调节剂，所述制剂含有调控chi3l1基因表达的制剂，上调chi3l1基因表达的制剂抑制 p
‑
stat3表达，下调chi3l1基因表达的制剂促进p
‑
stat3表达。
18.基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
19.我们前期利用转录组测序发现壳多糖酶3样蛋白1(chi3l1)是 huc
‑
mscs中高表达、与jak/stat通路相关、且受炎症因子调控的一种免疫相关分子，目前国内外均未见chi3l1调控mscs发挥免疫抑制作用及其分子机制的报道，为此，本发明发现chi3l1可以调控huc
‑
mscs免疫抑制作用，并且是通过调控cd4细胞stat3活化实现，这为临床治疗提供理论与应用指导。
附图说明
20.图1chi3l1在不同来源间充质干细胞中表达情况以及炎症因子对其的作用；
21.图2利用慢病毒构建sh
‑
chi3l1载体感染huc
‑
mscs后，与t细胞共培养，t细胞增殖情况及炎症因子表达变化。图c横坐标每个数据从左往右的 3个柱子分别代表图例从上往下的3组；
22.图3利用慢病毒构建sh
‑
chi3l1载体感染huc
‑
mscs后，与t细胞共培养，t细胞的p
‑
stat3表达变化；
23.图4添加p
‑
stat3抑制剂后，各组体外诱导th17比例和p
‑
stat3表达情况。
具体实施方式
24.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
25.下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
26.下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
27.实施例1炎症因子ifn
‑
γ联合tnf
‑
α刺激huc
‑
mscs高表达chi3l1
28.炎症因子ifn
‑
γ联合tnf
‑
α(20ng/ml)分别刺激huc
‑
mscs 24h,48h,72h，然后分别提取细胞的总rna，总蛋白和上清蛋白，利用实时荧光定量pcr技术(q
‑
pcr)和western blot检测chi3l1表达量。
[0029][0030]
如图1a所示，人骨髓(bm
‑
msc)、羊膜(hm
‑
msc)、胎盘(hp
‑
msc)、脐带(hu
‑
msc)来源的间充质干细胞中，chi3l1在huc
‑
mscs中高表达；如图1b所示，炎症因子ifn
‑
γ和tnf
‑
α刺激huc
‑
mscs后chi3l1高表达；如图1c所示，western blot检测ifn
‑
γ和tnf
‑
α刺激的huc
‑
mscs上清中chi3l1高表达；如图1d所示，western blot检测ifn
‑
γ和tnf
‑
α刺激的 huc
‑
mscs内源chi3l1高表达。
[0031]
实施例2慢病毒载体转染huc
‑
mscs
[0032]
利用慢病毒构建sh
‑
chi3l1载体感染huc
‑
mscs，获得稳定表达的 sh
‑
chi3l1
‑
huc
‑
mscs，载体为gv493。共构建3种慢病毒载体，挑选敲低效率最高的75488进行后续试验。
[0033]
chi3l1
‑
rnai(75488)acccacatcatctacagctttchi3l1
‑
rnai(75489)cagcagctatgacattgccaachi3l1
‑
rnai(75490)aggtgcagtacctgaaggaca
[0034]
将复苏的huc
‑
mscs p2代细胞接种至六孔板中，接种细胞数为1
×
105。用含有4μl/ml hitransg a的10％fbs的α
‑
mem完全培养基换液，加入病毒悬液(滴度为moi＝10，转染病毒量为1
×
107/ml)，转染24h后更换培养基为2ml含10％fbs的α
‑
mem完全培养基，并进行扩增培养，转染48h 后加入嘌呤霉素(2μmol/ml)进行药物抗药基因筛选48h，更换新鲜培养基进行细胞扩增，待细胞融合度达80％
‑
90％左右，胰酶消化后传代扩增培养。
[0035]
实施例3 sh
‑
chi3l1
‑
huc
‑
mscs与t细胞共培养
[0036]
分别将huc
‑
mscs，sh
‑
chi3l1
‑
huc
‑
mscs,sh
‑
nc
‑
huc
‑
mscs与小鼠t淋巴细胞共培养，同时用anti
‑
cd3刺激t细胞活化，cfse染料标记两组淋巴细胞，流式细胞术检测t细胞增殖：
[0037]
a)小鼠脾脏淋巴细胞分离液分离t淋巴细胞；
[0038]
b)anti
‑
cd3抗体用pbs稀释为1μg/ml，加入到96孔板(50μl/孔)，转移至37℃孵育
2h；
[0039]
c)弃掉96孔板的包被液，分别用pbs洗涤2次，分别加入cfse染色的t淋巴细胞(2.5
×
104/孔)，同时分别加入huc
‑
mscs， sh
‑
chi3l1
‑
huc
‑
mscs,sh
‑
nc
‑
huc
‑
mscs，共培养72h；
[0040]
d)收集共培养的t淋巴细胞，流式细胞术检测t淋巴细胞增殖比例和细胞亚群。
[0041]
e)提取共培养后t细胞的总rna，逆转录，qpcr检测炎症因子ifn
‑ꢀ
γ，il
‑
17a，foxp3和stat3表达。
[0042]
如图2a和2b所示，敲低chi3l1后，huc
‑
mscs对t细胞增殖抑制作用减少，t细胞增殖增多；如图2c所示，敲低chi3l1后，th17细胞分泌的炎症因子il
‑
17a增多，说明th17细胞增多，huc
‑
mscs抑制th17细胞分化作用降低。
[0043]
实施例4不同组mscs与t细胞共培养，chi3l1缺失组p
‑
stat3表达增加
[0044]
收集实施例3各组mscs，细胞裂解液4℃裂解细胞30min，4℃、10000
ꢀ×
g离心25min，bca蛋白浓度测定试剂检测蛋白含量，加入5
×
上样缓冲液煮沸后离心，取20μg蛋白样品加上样电泳，经10％sds
‑
page凝胶电泳后，转移到pvdf膜上，用含5％脱脂奶粉的封闭液室温封闭1h。4℃过夜孵育兔抗stat3、兔抗p
‑
stat3及鼠抗gapdh，用tbst洗膜3次，加入山羊抗兔及山羊抗鼠抗体，室温孵育1h，再用tbst洗膜3次，ecl化学发光显影。
[0045]
如图3a所示，敲低chi3l1后，q
‑
pcr检测共培养后t细胞的stat3 表达增加；如图3b所示，敲低chi3l1后，western blot检测共培养后t细胞的p
‑
stat3表达增加。
[0046]
实施例5体外诱导th17细胞分化
[0047]
1)cd4

cd62l

(miltenyi biotec,130
‑
106
‑
643)免疫磁珠分选naive cd4 细胞，用1640完全培养基重悬为单细胞悬液，接种已包被anti
‑
cd3(5μg/ml) 的96孔板(5
×
105/孔)；
[0048]
2)随机分为5组，每组5复孔，分别加入msc，sh
‑
nc
‑
msc, sh
‑
chi3l1
‑
msc,sh
‑
chi3l1
‑
msc联合sc201组(s3i
‑
201，stat3磷酸化抑制剂)；
[0049]
3)分别加入th17诱导培养基，诱导培养基包含2μg/ml anti
‑
cd28，1.0 ng/ml tgf
‑
β,30ng/ml il
‑
6,20ng/ml il
‑
1b,20ng/ml il
‑
23,10μg/ml anti
‑
il
‑
4 和10μg/ml anti
‑
ifn
‑
g；
[0050]
4)诱导培养72h，分别收集各组悬浮t细胞，接种24孔板，同时加入细胞刺激剂，使得胞内il
‑
17a表达且不分泌至胞外；
[0051]
5)分别比较anti
‑
mousepe
‑
cd4,anti
‑
mouseapc
‑
il
‑
17a,pe
‑
p
‑
stat3，抗体检测各组细胞il
‑
17a表达和p
‑
stat3表达。
[0052]
如图4所示，敲低huc
‑
mscs的chi3l1后，th17细胞比例和p
‑
stat3 增加；但是加入p
‑
stat3抑制剂后，th17细胞比例和p
‑
stat3减少。说明 chi3l1基因通过调节cd4细胞的p
‑
stat3表达，进而调控人脐带间充质干细胞抑制th17细胞分化作用
[0053]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。