一种D-核糖-5-磷酸的制备方法和应用与流程

一种d-核糖-5-磷酸的制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物催化领域，具体涉及一种d-核糖-5-磷酸的制备方法和应用。


背景技术：

2.β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononuclotide，β-nmn或nmn)是nad

(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称辅酶1)最直接的前体，nad

是参与细胞新陈代谢、氧化还原、蛋白质转录等上千种重要生理反应的重要活性物。由于nad 分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对nad

前体小分子物质β-nmn的研究发现，食用β-nmn可以有效提升体内nad

的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得β-nmn成为了“不老神药”，在功能性保健食品方面有着很大的开发潜力和市场前景。目前nmn在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以nmn为主要成份开发出多种保健品，如美国herbalmax、基因港geneharbor nmn9000、日本mirai lab nmn3000胶囊、澳大利亚synext等。
[0003][0004]
生物酶法制备nmn的其中一条路线是以d-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到nmn。如cn110373397a公开了在市售的核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶，以及烟酰胺核糖激酶突变体(r189h/s232t/r302k)催化下制得nmn。cn111051520a中公开了在scrbk、bsprs、hdnampt和drppk共同催化下制得nmn，反应48小时生成3.6mm的nmn，其中scrbk为来源于酿酒酵母(ncbi登录号为p25332)的rbk(ribokinase)，但是nmn的产量仍然需要提高。
[0005]
三步反应中其中重要的第一步是d-核糖在核糖激酶的作用下得到d-核糖-5-磷酸，因此需要开发一种能够高效地催化d-核糖为d-核糖-5-磷酸的高活性核糖激酶。


技术实现要素：

[0006]
为解决现有的β-烟酰胺单核苷酸生产工艺无法实现保持高转化率的同时提高原料浓度，从而生产效率低下的缺陷的技术问题，本发明提供了一种d-核糖-5-磷酸的制备方法和应用。本发明的发明人通过筛选，意外发现了四种催化能力强的核糖激酶，能够催化底物d-核糖和磷酸供体例如三磷酸腺苷二钠盐制得d-核糖-5-磷酸。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种d-核糖-5-磷酸的制备
方法，其包括使用核糖激酶，将d-核糖和磷酸供体进行磷酸化反应制得所述d-核糖-5-磷酸，其特征在于，所述核糖激酶的氨基酸序列如ncbi登录号为wp_054396858.1、ccx07771.1、wp_125988536.1和/或wp_160803741.1所示的d-核糖激酶。
[0008]
优选地，编码所述核糖激酶的核苷酸序列如seq id no:1～4所示。
[0009]
在优选的实施例中，所述d-核糖的浓度为10g/l～100g/l，例如40g/l。
[0010]
优选地，所述磷酸供体与所述d-核糖的摩尔比为1:1000～5:1，例如1.5:1；和/或，所述核糖激酶与所述d-核糖的质量比为1:200～1:10。所述的磷酸供体优选为atp或atp钠盐。
[0011]
更优选地，所述磷酸化反应的ph为6.0～8.0，例如7.0～7.5；和/或，所述磷酸化反应的温度为25～40℃，例如35℃。
[0012]
在优选的实施例中，所述制备方法还包括磷酸供体再生的步骤：利用磷酸转移酶和磷酸原料将失去磷酸基团的磷酸供体的产物磷酸化为磷酸供体；
[0013]
优选地，所述磷酸原料与d-核糖的摩尔比为1:1～2:1；和/或，所述磷酸供体的产物为adp或adp钠盐。
[0014]
在优选的实施例中，所述磷酸供体为atp，和/或，所述磷酸原料为磷酸化合物，例如为乙酰磷酸二钠，乙酰磷酸二钾和/或乙酰磷酸二铵；
[0015]
优选地，所述磷酸化合物与所述d-核糖的摩尔比为1:1，和/或，所述磷酸转移酶与所述磷酸化合物的质量比为1:500～1:50，例如为1:163；和/或，所述磷酸供体再生的反应温度为20～40℃，例如为35℃；和/或，所述磷酸供体再生的反应ph值为6～8，例如为7.4。
[0016]
在优选的实施例中，所述磷酸转移酶为ncbi登录号为aac75356.1的乙酸激酶。
[0017]
优选地，编码所述乙酸激酶的核苷酸序列如seq id no:9所示。
[0018]
在优选的实施例中，所述核糖激酶的制备包括以下步骤：
[0019]
(1)将含有所述核糖激酶基因的工程菌培养至od600为0.5～1.0优选0.8，25℃诱导优选用终浓度为0.1mm的iptg诱导并培养12～24小时，优选16小时；
[0020]
(2)收集菌体并以1:(5～20)例如1:10的重量体积比重悬至缓冲液，破碎后得到粗酶液；优选所述粗酶液经纯化，例如用ni bestarosehp树脂纯化，和/或，所述缓冲液为50mm ph 7.5的tris-hcl或pbs缓冲液；其中所述重量体积比为g:ml。
[0021]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：提供一种核糖激酶在制备d-核糖-5-磷酸或β-烟酰胺单核苷酸中的用途，其中，所述核糖激酶为ncbi登录号为wp_054396858.1、ccx07771.1、wp_125988536.1和/或wp_160803741.1的d-核糖激酶。
[0022]
优选地，编码所述核糖激酶的核苷酸序列如seq id no:1～4所示。
[0023]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：提供一种酶组合物，其包括：
[0024]
1)氨基酸序列如ncbi登录号为wp_054396858.1、ccx07771.1、wp_125988536.1和wp_160803741.1所示的d-核糖激酶的至少两种；或者，
[0025]
2)d-核糖激酶和磷酸转移酶；其中，所述d-核糖激酶为氨基酸序列如ncbi登录号为wp_054396858.1、ccx07771.1、wp_125988536.1和/或wp_160803741.1所示的d-核糖激酶，所述磷酸转移酶为氨基酸序列如ncbi登录号aac75356.1所示的乙酸激酶。
[0026]
优选地，编码所述烟酰胺核糖核苷激酶的核苷酸序列如seq id no:1～4所示；和/或，编码所述乙酸激酶的核苷酸序列如seq id no:9所示。
[0027]
本发明的积极进步效果在于：
[0028]
本发明的d-核糖激酶稳定性和酶活高，利用其制备d-核糖-5-磷酸具有工艺操作简单、适用于更高的底物浓度、转化率高、生产效率高的优点。
具体实施方式
[0029]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0030]
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参考j.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
[0031]
pet28a和蛋白抽提试剂(bugbuster protein extraction reagent)购买自novagen公司；dpni酶购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司；ndei酶、hindiii酶购买自thermo fisher公司，e.coli bl21(de3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。d-核糖(采购于上海麦克林生化科技有限公司)；atp采购自安徽翠鸟生物技术有限公司。
[0032]
实施例1d-核糖激酶(ribokinase，rbk)的制备
[0033]
lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
[0034]
tb液体培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉18g/l，甘油4ml/l，kh2po42.31g/l、k2hpo4·
2h2o 16.43g/l，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
[0035]
核糖激酶氨基酸信息见下表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司(上海市松江区香闵路698号)全基因合成，酶切位点ndei、hindiii，载体pet28a。合成的d-核糖激酶基因转化至宿主e.coli bl21(de3)感受态细胞，得到含有核糖激酶基因的工程菌株。其中，enz.01为cn111051520a中的seq id no:7；enz.02为bioorganic&medicinal chemistry 14(2006)，6327-6332中核糖激酶，ncbi登录号为aac76775.1。
[0036]
表1 d-核糖激酶
[0037]
[0038]
将含有rbk基因的工程菌分别在平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml lb液体培养基中，37℃震荡培养4h。按1％(v/v)接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜tb液体培养基中，37℃震荡培养至od600达到0.8左右时，降温至25℃，加入iptg至其终浓度为0.1mm，诱导培养16h。培养结束，收集培养液于4℃4000rpm离心20min(离心机：eppendorf centrifuge 5810r)，弃上清，收菌体，后置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
[0039]
将收集到的菌体取3g，重悬于30ml 50mm ph 7.4的tris-hcl缓冲液中，4℃高压均质破碎，得到核糖激酶粗酶液，将均质后的核糖激酶粗酶液用ni bestarosehp(博格隆(上海)生物技术有限公司，产品编号aa0041)树脂纯化，用bradford试剂盒(采购自上海捷瑞生物工程有限公司)测定蛋白浓度，保存于-20℃冰箱待用。蛋白浓度见表2。
[0040]
表2
[0041][0042]
将核糖激酶与现有技术enz.01和enz.02分别进行序列同源性比对，结果如下表3所示：
[0043]
表3
[0044][0045]
酶序列与现有技术中已公开的应用制备nmn的核糖激酶的序列同源性较低。
[0046]
实施例2乙酸激酶的制备
[0047]
根据乙酸激酶(ncbi登录号：aac75356.1)基因(seq id no:9)全合成乙酸激酶酶切位点ndei、hindiii，载体pet28a。合成的乙酸激酶基因转化至宿主e.coli bl21(de3)感
受态细胞，得到含有乙酸激酶基因的工程菌株。
[0048]
将含有乙酸激酶基因的工程菌分别在平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml lb液体培养基中，37℃震荡培养4h。按1v/v％接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜tb液体培养基中，37℃震荡培养至od600达到0.8左右时，加入iptg至其终浓度为0.1mm，25℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液4500rpm离心20min(离心机：eppendorf centrifuge 5810r)，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
[0049]
取10g乙酸激酶重悬于50ml 0.1m ph7.5磷酸钠缓冲液，高压均质破碎，得到乙酸激酶粗酶液，将均质后的粗酶液用ni bestarosehp(博格隆(上海)生物技术有限公司，产品编号aa0041)树脂纯化，用bradford试剂盒(采购自上海捷瑞生物工程有限公司)测定蛋白浓度，保存于-20℃冰箱待用。蛋白浓度15mg/ml。
[0050]
乙酸激酶液体酶的酶活的测定方法：
[0051]
4.0g二磷酸腺苷(adp)，1.38g乙酰磷酸二铵盐，0.19g无水氯化镁，加入10ml 0.2m ph7.5的磷酸钠缓冲液和70ml纯水，磁力搅拌溶解，用20％na2co3水溶液调节ph至7.5，定容至100ml底物溶液。取底物溶液19.5ml于反应容器中，置于30℃摇床中150rpm保温10min。加入0.5ml稀释后的乙酸激酶液体酶，于30℃、150rpm摇床中反应。反应10min后取反应液加入2m盐酸摇匀淬灭反应，离子对hplc方法检测生成的三磷酸腺苷(atp)，根据标准曲线计算atp浓度，并计算出液体酶的酶活为10048u/ml。
[0052]
离子对hplc检测方法：
[0053]
色谱柱：welch ultimate aq-c18(5μm，4.6*250mm)；缓冲液：0.05mol/l磷酸氢二铵水溶液：10％四丁基氢氧化铵水溶液＝91：1(体积比)，磷酸调节ph至3.6；流动相：乙腈：缓冲液＝8：92(体积比)；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μl；运行时间：40min；稀释液：超纯水。
[0054]
实施例3d-核糖-5-磷酸的制备
[0055]
在反应体系中加入48ml纯水，加入2g d-核糖(13.3mmol)，0.20g六水氯化镁、11g三磷酸腺苷二钠盐(19.9mmol)，25℃水浴搅拌溶解，用4％氢氧化钠水溶液(质量体积比)调ph到7.4左右，最后分别加入2ml核糖激酶纯酶液。在35℃，ph7.0-7.5，150rpm中反应2h，反应过程中tlc检测反应的进行，结果见表4。
[0056]
tlc检测方法：
[0057]
展开剂：乙酸乙酯:异丙醇:水:醋酸＝3:3:1:1；显色剂：10％硫酸乙醇(5.5ml 90ml乙醇混合均匀)；烘枪250℃15秒。
[0058]
d核糖rf＝0.7；r5p rf＝0.2。结果显示enz.04、enz.05、enz.07、enz.08都可以获得比现有技术中enz.01更好的转化率，其中enz.04、enz.07、enz.08的转化率几乎可达100％。
[0059]
表4液体酶催化制备核糖-5-磷酸
[0060]
酶转化率enz.01《50％enz.04100％enz.05约50％enz.07100％
enz.08100％
[0061]
实施例4不同ph对反应的影响
[0062]
在反应体系中加入48ml纯水，加入2g d-核糖(13.3mmol)，0.20g六水氯化镁、11g三磷酸腺苷二钠盐(19.9mmol)，25℃水浴搅拌溶解，用4％氢氧化钠水溶液(质量体积比)调至不同ph值，最后分别加入2ml纯酶液。在35℃，150rpm中反应2h，反应过程中tlc检测反应的进行，结果见表5。
[0063]
表5
[0064]
phenz.04enz.05enz.07enz.086.0100％约50％100％100％7.0100％约50％100％100％8.0100％约50％100％100％
[0065]
结果显示，ph6.0～8.0条件下反应都能很好地进行。
[0066]
实施例5不同温度对反应的影响
[0067]
在反应体系中加入48ml纯水，加入2g d-核糖(13.3mmol)，0.20g六水氯化镁、11g三磷酸腺苷二钠盐(19.9mmol)，25℃水浴搅拌溶解，用4％氢氧化钠水溶液(质量体积比)调至ph7.0，最后分别加入2ml纯酶液。分别在不同温度下，150rpm中反应2h，反应过程中tlc检测反应的进行，结果见表6。
[0068]
表6
[0069]
温度enz.04enz.05enz.07enz.0825℃100％约50％100％100％30℃100％约50％100％100％35℃100％约50％100％100％40℃100％约50％100％100％
[0070]
结果显示，温度25～40℃条件下反应都能很好地进行。
[0071]
实施例6d-核糖-5-磷酸的制备
[0072]
在反应体系中加入48ml纯水，加入2g d-核糖(13.3mmol)，0.20g六水氯化镁、0.2g三磷酸腺苷二钠盐，2.45g乙酰磷酸二钠(13.3mmol)，25℃水浴搅拌溶解，用4％氢氧化钠水溶液(质量体积比)调ph到7.4左右，最后分别加入2ml核糖激酶纯酶液和1ml乙酸激酶纯酶液。在35℃，ph7.0-7.5，150rpm中反应2h，反应过程中tlc检测反应的进行，tcl检测方法同实施例3，结果见表7。
[0073]
表7
[0074]
酶转化率enz.01《50％enz.04100％enz.05约50％enz.07100％enz.08100％
[0075]
本实施例与实施例3的区别在于后者提供了过量的atp二钠盐(19.9mmol)，而本实
施例用乙酸激酶再生磷酸供体，atp二钠盐的含量仅为2mmol，但催化效果与实施例3相当，说明了乙酸激酶可以很好地再生磷酸供体(atp)反应产物。