一种放线菌的特征肽及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物检测技术领域，特别是涉及一种放线菌的特征肽及其应用。


背景技术：

2.放线菌(actinomyces graevenitzii)是放线菌科下种属。是由buchanan在1918年创立的，该科的一般特征是：革兰氏染色阳性，分支，偏直条状，大多数成员是属于球杆状或者类球形。细胞长度一般小于0.5μm，平均长度在1.7μm到2.9μm之间。群落可能形成丝状体形成类似菌丝体的外形，但是大多数菌落不分枝，而且主要是白色或者灰色，有一些特殊的菌落会形成深红色、淡红色、棕色、粉色、淡粉或淡黄色。现在该科根据16s rna的核酸序列划分出五个不同的属。
3.公开号为cn112011602a的发明专利申请公开了免疫恢复相关的肠道菌群，含与免疫恢复相关的生物标志物包括32种肠道细菌物种，右旋乳酸脱氢酶、以及18个乳酸菌物种(包括actinomyces graevenitzii)。利用该生物标志物可以对患者免疫受损后的免疫恢复预后进行风险评估，但并没有公开放线菌检测用的特征肽。
4.公开号为cn112666270a的发明申请公开了一种基于组合特征肽的靶向分析检测金黄色葡萄球菌及肠毒素的新方法及试剂盒。具体地本发明中公开了可作为金黄色葡萄球菌及其分泌的肠毒素a和肠毒素b检测标准的特征肽。本发明的特征肽检测技术实现了同时检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素，极大的减少了检测时间和假阳性结果，为金黄色葡萄球菌及其肠毒素的检出提供了可靠有效的质量控制方法。可见，通过寻找特定细菌的特征肽能够用于特异性检测该细菌。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对上述问题，提出一组可用于放线菌鉴定的特征性多肽，以及一种放线菌特有的特征性多肽的液相色谱质谱鉴定方法，它具有唯一性强，灵敏度高，能精确鉴别样本中是否含有放线菌。
6.本发明提出的一组用于鉴定放线菌(actinomyces graevenitzii)的特征性多肽，序列为ieeslgedavyagasafpr(m/z661.322，z＝3)、aqtvedvistisgqvqsvdwk(m/z1145.583，z＝2；m/z764.056，z＝3)、sewegtlssqlr(m/z696.842，z＝2)和aflgmdiegvr(m/z604.310，z＝2)中的一条或多条；母体质量误差容限为10.0ppm，碎片质量误差容限为0.05da。
7.一种放线菌(actinomyces graevenitzii)的特征肽，氨基酸序列为ieeslgedavyagasafpr、aqtvedvistisgqvqsvdwk、sewegtlssqlr和aflgmdiegvr中的至少一种。
8.本发明又提供了所述特征肽在非医学诊断为目的的检测放线菌中的应用。
9.优选的，所述的应用，检测使用液相色谱质谱联用方法。
10.本发明又提供了一种非医学诊断为目的的检测放线菌的方法，使用液相色谱质谱联用方法检测样品，若样品中存在权利要求1所述特征肽，则样品中存在放线菌。
11.优选的，待检测的样品为以下一种：
12.(1)人口腔、食道、胃、肠道或肺来源样品，
13.(2)环境样本。环境样本可以是土壤样本、水样本、污泥样本等。
14.优选的，所述的方法，包括以下步骤：将待测的样品经蛋白质提取、胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解溶液经截留分子量3k-10k的超滤管离心超滤，收集滤液冷冻干燥，脱盐后干燥含多肽的洗脱液，加0.1％甲酸溶解，经多肽含量定量后进样，经液相色谱c
18
柱梯度分离和高分辨质谱进行谱图采集、鉴定。
15.更优选的，液相色谱质谱联用时，进样量为0.5～1μg，进样流速为10nl/分钟；液相色谱c
18
柱梯度分离的条件如下：a相为含0.1％甲酸的水溶液，b相为含0.1％甲酸的乙腈溶液。
16.更优选的，谱图采集时间为150分钟，纳升液相分离梯度如下：
[0017][0018]
更优选的，高分辨质谱进行谱图采集的参数如下：
[0019][0020][0021]
本发明研究发现了放线菌(actinomyces graevenitzii)特征性多肽，能够用于放线菌检测鉴定，本发明所提供的特征性多肽的氨基酸序列为ieeslgedavyagasafpr、aqtvedvistisgqvqsvdwk、sewegtlssqlr和aflgmdiegvr中的至少一种，该特征性多肽为放线菌所特有，可用液相色谱串联质谱进行鉴定。该方法具有特异性强，灵敏度高，能够准确的鉴定放线菌。
附图说明
[0022]
图1为多肽ieeslgedavyagasafpr(m/z661.322，z＝3)的母离子质谱图(a)和二级
质解析谱图(b)。
[0023]
图2为多肽aqtvedvistisgqvqsvdwk(m/z764.056，z＝3)的母离子质谱图(a)和二级质解析谱图(b)。
[0024]
图3为多肽sewegtlssqlr(m/z696.839，z＝2)的母离子质谱图(a)和二级质解析谱图(b)。
[0025]
图4为多肽aflgmdiegvr(m/z604.310，z＝2)的母离子质谱图(a)和二级质解析谱图(b)。
具体实施方式
[0026]
实施例1：特征性多肽筛选
[0027]
本实施例使用设备为纳升液相色谱仪(easy-nlc 1000)和ltq-orbitrap elite高分辨质谱，所用试剂碳酸氢氨、胰蛋白酶、乙腈、甲酸等试剂均需色谱纯。
[0028]
口腔样品首先用差速离心法分离细菌，然后按以下步骤制备多肽样本：分离细菌样本中按4∶1(v∶v)加入100％tca溶液，再加入1m dtt母液，使其终浓度为100mm。震荡混匀。冰上放置1小时后，14000g离心5分钟，弃上清。沉淀加入-20℃丙酮800μl，涡旋吹散沉淀，4℃条件下静置10分钟，14000g离心5分钟，弃上清。沉淀加入-20℃丙酮300μl，将沉淀吹散并超声15分钟助溶，-20℃静置30分钟。4℃6500g离心10分钟，弃上清，该步骤重复2次。将沉淀置于95℃金属浴中5-10分钟干燥，彻底除去丙酮。配制新鲜的8m的ua(尿素)溶液，每管加入120μl浓度为8m的ua，将沉淀吹散，置于50℃金属浴中10分钟后，14000g离心10分钟后孵育，取上清，得到粗体的蛋白溶液，用nano-drop测蛋白浓度。吸取每样品300μg蛋白对应的蛋白溶液转入10k的超滤管中(超滤管置于收集管上)，加入200μl浓度为8m的ua，14000g离心10分钟，弃收集管中的废液，此步骤重复2次。加入100μl浓度为0.05m的iaa(碘乙酰胺)溶液，与超滤管中液体混匀后，暗处孵育20分钟；14000g离心10分钟，弃收集管中的废液。加入100μl的ua，14000g离心10分钟，弃收集管中的废液，此步骤重复2次。加入100μl浓度为0.05m的abc(碳酸氢铵)溶液，与超滤管中液体混匀后，暗处孵育20分钟；14000g离心10分钟，弃收集管中的废液，此步骤重复2次。加入40μl浓度为0.05m的abc溶液，按照蛋白质：酶＝50-100∶1的关系，加入1μg/μl的胰蛋白酶母液，混匀后，37℃条件下孵育15h。将超滤管转移至新的离心管上，14000g离心10分钟。加入40μl abc溶液，14000g离心10分钟。弃超滤管，将离心管内的液体冻干燥。脱盐步骤：将上述冷冻干燥的样本用20μl浓度0.4％(v/v)的三氟乙酸(tfa)溶解；用100％的乙腈acn湿润c
18
枪头(zip tip c
18
，millipore)一次，10μl/次；用50％的acn湿润枪头两次，10μl/次；用10μl 0.1％的tfa平衡tip枪头两次；吸10μl样本，来回吹打10次；用0.1％的tfa洗两次，10μl/次；用10μl 0.1％的甲酸/60％的acn进行洗脱；冷冻干燥约30分钟；加20μl 0.1％的甲酸溶解，取1.5μl样品，用nanodrop检测肽段浓度，将剩余样品转入质谱250μl的上样管中，放入纳升级液相色谱的48孔上样盘，按测定多肽浓度，取1μg总量的多肽进行纳升液相色谱仪(easy-nlc 1000)分离和ltq-orbitrap elite高分辨质谱鉴定。
[0029]
液相色谱质谱联用时，进样流速为10nl/分钟；液相色谱c
18
柱梯度分离的条件如下：a相为含0.1％甲酸的水溶液，b相为含0.1％甲酸的乙腈溶液。谱图采集时间为150分钟，纳升液相分离梯度如下：
[0030][0031][0032]
高分辨质谱进行谱图采集的参数如下：
[0033][0034]
质谱数据采用peaks studio 8.0进行分析检索，检索参数如下：
[0035]
1、搜索引擎名称：peaks；
[0036]
2、母体质量误差容限：10.0ppm；
[0037]
3、碎片质量误差容限：0.05da；
[0038]
4、酶：胰蛋白酶；
[0039]
5、固定修改：carboxymethyl；
[0040]
6、可变修改：oxidation和deamidation；
[0041]
7、数据库：源于uniprot公共数据库中的细菌蛋白质数据库。
[0042]
检索结果如下表1所示。
[0043]
表1
[0044][0045]
结果表明，在鉴定到的涉及4个蛋白中的13个多肽中，其中有4个是放线菌(a.graevenitzii)的特征性多肽，分别为ieeslgedavyagasafpr、aqtvedvistisgqvqsvdwk、sewegtlssqlr和aflgmdiegvr。其余的9个不是，因在其它细菌中也能检索到，如fdglavr肽在其它物种中也存在，如下表2所示。
[0046]
表2
[0047][0048]
实施例2：特异性鉴定-阳性
[0049]
本实施例使用设备为纳升液相色谱仪(easy-nlc 1000)和ltq-orbitrap elite高分辨质谱，所用试剂碳酸氢氨、胰蛋白酶、乙腈、甲酸等试剂均需色谱纯。
[0050]
放线菌(a.graevenitzii)中按4∶1(v∶v)加入100％tca溶液，再加入1m dtt母液，使其终浓度为100mm。震荡混匀。冰上放置1小时后，14000g离心5分钟，弃上清。沉淀加入-20℃丙酮800μl，涡旋吹散沉淀，4℃条件下静置10分钟，14000g离心5分钟，弃上清。沉淀加入-20℃丙酮300μl，将沉淀吹散并超声15分钟助溶，-20℃静置30分钟。4℃6500g离心10分钟，弃上清，该步骤重复2次。将沉淀置于95℃金属浴中5-10分钟干燥，彻底除去丙酮。配制新鲜的8m的ua(尿素)溶液，每管加入120μl浓度为8m的ua，将沉淀吹散，置于50℃金属浴中10分钟后，14000g离心10分钟后孵育，取上清，得到粗体的蛋白溶液，用nano-drop测蛋白浓度。吸取每样品300μg蛋白对应的蛋白溶液转入10k的超滤管中(超滤管置于收集管上)，加入200μl浓度为8m的ua，14000g离心10分钟，弃收集管中的废液，此步骤重复2次。加入100μl浓度为0.05m的iaa(碘乙酰胺)溶液，与超滤管中液体混匀后，暗处孵育20分钟；14000g离心10分钟，弃收集管中的废液。加入100μl的ua，14000g离心10分钟，弃收集管中的废液，此步骤重复2次。加入100μl浓度为0.05m的abc(碳酸氢铵)溶液，与超滤管中液体混匀后，暗处孵育20分钟；14000g离心10分钟，弃收集管中的废液，此步骤重复2次。加入40μl浓度为0.05m的
abc溶液，按照蛋白质：酶＝50-100∶1的关系，加入1μg/μl的胰蛋白酶母液，混匀后，37℃条件下孵育15h。将超滤管转移至新的离心管上，14000g离心10分钟。加入40μl abc溶液，14000g离心10分钟。弃超滤管，将离心管内的液体冻干燥。脱盐步骤：将上述冷冻干燥的样本用20μl浓度为0.4％(v/v，下同)的三氟乙酸(tfa)溶解；用100％的乙腈acn湿润c
18
枪头(zip tip c
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，millipore)一次，10μl/次；用50％(v/v)的acn湿润枪头两次，10μl/次；用10μl 0.1％的tfa平衡tip枪头两次；吸10μl样本，来回吹打10次；用0.1％的tfa洗两次，10μl/次；用10μl浓度0.1％(v/v)的甲酸/60％的acn进行洗脱；冷冻干燥约30分钟；加20μl 0.1％的甲酸溶解，取1.5μl样品，用nanodrop检测肽段浓度，将乘余样品转入质谱250μl的上样管中，放入纳升级液相色谱的48孔上样盘.按测定多肽浓度，取1μg总量的多肽进行纳升液相色谱仪(easy-nlc 1000)分离和ltq-orbitrap elite高分辨质谱鉴定。
[0051]
液相色谱质谱联用时，进样流速为10nl/分钟；液相色谱c
18
柱梯度分离的条件如下：a相为含0.1％甲酸的水溶液，b相为含0.1％甲酸的乙腈溶液。谱图采集时间为150分钟，纳升液相分离梯度如下：
[0052][0053]
高分辨质谱进行谱图采集的参数如下：
[0054][0055]
质谱数据采用peaks studio 8.0进行分析检索，检索参数如下：
[0056]
1、搜索引擎名称：peaks；
[0057]
2、母体质量误差容限：10.0ppm；
[0058]
3、碎片质量误差容限：0.05da；
[0059]
4、酶：胰蛋白酶；
[0060]
5、固定修改：carboxymethyl；
[0061]
6、可变修改：oxidation和deamidation；
[0062]
7、数据库：含实施例1中筛选得到的四条特征性多肽序列的定制数据库。
[0063]
检索结果如下表3所示。
[0064]
表3
[0065][0066]
说明样本中存在放线菌(a.graevenitzii)，相应母离子质谱图和二级质解析谱图如图1～4所示，其中图1为ieeslgedavyagasafpr(m/z 661.322，z＝3)；图2为aqtvedvistisgqvqsvdwk(m/z 764.056，z＝3)；图3为sewegtlssqlr(m/z696.839，z＝2)；图4为aflgmdiegvr(m/z 604.310，z＝2)。
[0067]
实施例3：特异性鉴定-阴性
[0068]
本实施例使用设备为纳升液相色谱仪(easy-nlc 1000)和ltq-orbitrap elite高分辨质谱，所用试剂碳酸氢氨、胰蛋白酶、乙腈、甲酸等试剂均需色谱纯。用actinomycetales目(放线菌目)16srna通用引物ggcktgcggtgggtacgggc和ggctttaagggattcgctccrcctcac(其中k表示g或t，r表示a或g)对样本进行pcr扩增并对产物进行测序、blast比对，证实不含放线菌(a.graevenitzii)的植物根系样本，用差速离心法分离细菌，然后按以下步骤制备多肽样本：分离细菌样本中按4∶1(v∶v)加入100％的tca溶液，再加入1m的dtt母液，使其终浓度为100mm。震荡混匀。冰上放置1小时后，14000g离心5分钟，弃上清。沉淀加入-20℃丙酮800μl，涡旋吹散沉淀，4℃条件下静置10分钟，14000g离心5分钟，弃上清。沉淀加入-20℃丙酮300μl，将沉淀吹散并超声15分钟助溶，-20℃静置30分钟。4℃6500g离心10分钟，弃上清。该步骤重复2次。将沉淀置于95℃金属浴中5-10分钟干燥，彻底除去丙酮。配制新鲜的浓度为8m的ua(尿素)溶液，每管加入120μl浓度为8m的ua，将沉淀吹散，置于50℃金属浴中10分钟后，14000g离心10分钟后孵育，取上清，得到粗体的蛋白溶液，用nano-drop测蛋白浓度。吸取每样品300μg蛋白对应的蛋白溶液转入10k的超滤管中(超滤管置于收集管上)，加入200μl浓度为8m的ua，14000g离心10分钟，弃收集管中的废液，此步骤重复2次。加入100μl浓度为0.05m的iaa(碘乙酰胺)溶液，与超滤管中液体混匀后，暗处孵育20分钟；14000g离心10分钟，弃收集管中的废液。加入100μl的ua，14000g离心10分钟，弃收集管中的废液，此步骤重复2次。加入100μl浓度为0.05m的abc(碳酸氢铵)溶液，与超滤管中液体混匀后，暗处孵育20分钟；14000g离心10分钟，弃收集管中的废液，此步骤重复2次。加入40μl浓度为0.05m的abc溶液，按照蛋白质∶酶＝50-100∶1的关系，加入1μg/μl的胰蛋白酶母液，混匀后，37℃条件下孵育15h。将超滤管转移至新的离心管上，14000g离心10分钟。加入40μl abc溶液，14000g离心10分钟。弃超滤管，将离心管内的液体冻干燥。脱盐步骤：将上述冷冻干燥的样本用20μl浓度0.4％的三氟乙酸(tfa)溶解；用100％的乙腈acn湿润c
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枪头(zip tip c
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，millipore)一次，10μl/次；用50％的acn湿润枪头两次，10μl/次；用10μl浓度为0.1％的tfa平衡tip枪头两次；吸10μl样本，来回吹打10次；用0.1％的tfa洗两次，10μl/次；用10μl 0.1％的甲酸/60％的acn进行洗脱；冷冻干燥约30分钟；加20μl浓度为0.1％的甲酸溶解，取1.5μl样品，用nanodrop检测肽段浓度，将乘余样品转入质谱
250μl的上样管中，放入纳升级液相色谱的48孔上样盘.按测定多肽浓度，取1μg总量的多肽进行纳升液相色谱仪(easy-nlc 1000)分离和ltq-orbitrap elite高分辨质谱鉴定。
[0069]
液相色谱质谱联用时，进样流速为10nl/分钟；液相色谱c
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柱梯度分离的条件如下：a相为含0.1％甲酸的水溶液，b相为含0.1％甲酸的乙腈溶液。谱图采集时间为150分钟，纳升液相分离梯度如下：
[0070][0071]
高分辨质谱进行谱图采集的参数如下：
[0072][0073][0074]
质谱数据采用peaks studio 8.0进行分析检索，检索参数如下：
[0075]
1、搜索引擎名称：peaks
[0076]
2、母体质量误差容限：10.0ppm
[0077]
3、碎片质量误差容限：0.05da
[0078]
4、酶：胰蛋白酶
[0079]
5、固定修改：carboxymethyl
[0080]
6、可变修改：oxidation和deamidation
[0081]
7、数据库：含四条特征性多肽序列的定制数据库
[0082]
检索结果：在相应的母离子质量范围内没有检索到相应的多肽。