磁性体装置在调节高糖环境中细胞的氧化应激水平、活力及增殖、迁移和浸润能力中的应用的制作方法

1.本发明涉及磁场技术领域，具体涉及磁性体装置在调节高糖环境中细胞的氧化应激水平、活力及增殖、迁移和浸润能力中的应用。


背景技术：

2.目前我国约有1.2亿糖尿病患者，伴随着糖尿病发病率的激增，糖尿病并发症也在严重威胁着人类的健康和生命。糖尿病患者体内因其高糖的环境可以造成其机体内高水平的氧化应激，进而引发糖尿病并发症的发生和发展。
3.氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，机体内自由基的产生和抗氧化防御之间严重失衡，从而导致组织损伤。因而氧化应激与糖尿病并发症的发生、发展密切相关。为了研究糖尿病及其并发症的病理和发病机制，科研人员需要在体外模拟出糖尿病患者体内高血糖的实验环境，然后再通过细胞实验，研究高糖环境对不同细胞的影响和病变。
4.近些年，伴随着磁生物学领域的迅猛发展，通过磁装置调节离体细胞的葡萄糖水平的研究如雨后春笋般涌现，如公开号为cn111408051a的专利公开一种调节血液葡萄糖水平的磁场发生装置及其应用，通过磁场发生装置对离体肝癌细胞进行处理，该磁场发生装置能够调节离体肝癌细胞葡萄糖的水平，改善铁代谢。
5.然而，不同的磁场条件处理细胞后，对细胞的影响并不相同，如公开号为cn111411041a的专利中的旋磁细胞培养装置，在一定条件下培养乳腺癌细胞，可抑制乳腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭。如有研究发现，0.26t和0.50t的smfs对细胞atp没有影响，但1t和9t smfs对细胞atp水平有着不同的影响，且呈时间依赖性(wang,d.et al.cellular atp levels are affected by moderate and strong static magnetic fields.bioelectromagnetics 39,352-360,doi:10.1002/bem.22122(2018).)。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于提供一种以非治疗为目的基于磁性体装置在同时降低高糖环境中细胞的氧化应激水平，提高细胞活力，减少细胞死亡，促进细胞增殖、迁移和浸润能力中的应用。
7.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
8.磁性体装置在调节高糖环境中细胞的氧化应激水平、活力及增殖、迁移和浸润能力中的应用，所述磁性体装置包括磁性体和细胞培养单元，所述细胞培养单元位于磁性体顶壁，所述细胞位于细胞培养单元内，所述磁性体的s极或n极向上，调节细胞受到的磁场强度为0.5t，所述细胞加磁处理时间为24h。
9.有益效果：采用本发明中的磁性体装置，0.5t的n极或s极处理后均可以降低高糖环境中细胞的氧化应激水平，增强细胞活力，减少细胞死亡，同时能够促进细胞增殖、迁移和浸润能力，且s极调节效果优于n极。
10.本发明与现有技术采用磁疗贴改善血液循环、增强细胞活力等作用相比，细胞活力增强为细胞代谢atp水平增加，各项综合生命活动加速，但是细胞增殖和凋亡是影响了细胞周期的变化，细胞活力增强并不一定能够促进细胞增殖，减少细胞凋亡。
11.优选地，所述细胞培养单元为细胞培养皿。
12.优选地，所述细胞为离体小鼠胚胎成纤维细胞。
13.优选地，所述高糖环境中的细胞为葡萄糖诱导的离体小鼠胚胎成纤维细胞，所述诱导包括以下步骤：将小鼠胚胎成纤维细胞接种于培养板中，加入浓度为25mmol/l的d-( )-葡萄糖溶液，调整培养板的培养基中葡萄糖终浓度为50mmol/l。
14.有益效果：葡萄糖诱导的离体小鼠胚胎成纤维细胞，在细胞体内外形成类似高血糖的环境，形成高氧化应激水平，通过本发明中的磁性体装置处理后，氧化应激水平显著降低。
15.优选地，所述应用包括以下步骤：将葡萄糖诱导的离体小鼠胚胎成纤维细胞接种到细胞培养单元中，然后置于磁性体顶壁，将磁性体装置置于细胞培养箱中培养24h。
16.优选地，所述磁性体装置位于培养箱中。
17.优选地，所述培养箱为二氧化碳培养箱。
18.优选地，所述细胞为离体小鼠胚胎成纤维细胞。
19.磁性体装置在构建高糖低氧化应激水平细胞模型中的应用，所述磁性体装置包括磁性体和细胞培养单元，所述细胞培养单元位于磁性体顶壁，所述细胞位于细胞培养单元内，所述磁性体的s极或n极向上，调节细胞受到的磁场强度为0.5t，所述细胞加磁处理时间为24h。
20.有益效果：采用本发明中的磁性体装置，0.5t的n极或s极处理后均可以降低高糖环境中细胞的氧化应激水平，从而构建高糖低氧化应激水平细胞模型。
21.优选地，所述高糖环境的细胞为葡萄糖诱导的离体小鼠胚胎成纤维细胞，所述诱导包括以下步骤：将小鼠胚胎成纤维细胞接种于培养板中，加入浓度为25mmol/l的d-( )-葡萄糖溶液，调整培养板的培养基中葡萄糖终浓度为50mmol/l。
22.有益效果：葡萄糖诱导的离体小鼠胚胎成纤维细胞，在细胞内外形成高糖环境，形成高氧化应激水平，通过本发明中的磁性体装置处理后，氧化应激水平显著降低，从而构建高糖低氧化应激水平细胞模型。
23.本发明的优点在于：采用本发明中的磁性体装置，0.5t的n极或s极处理后均可以降低高糖环境中细胞的氧化应激水平，增强细胞活力，减少细胞死亡，同时能够促进细胞增殖、迁移和浸润能力，且s极调节效果优于n极。
24.本发明与现有技术采用磁疗贴改善血液循环、增强细胞活力等作用相比，细胞活力增强为细胞代谢atp水平增加，各项综合生命活动加速，但是细胞增殖和凋亡是影响了细胞周期的变化，细胞活力的增强并不一定代表着细胞增殖的促进和细胞凋亡的减少。
附图说明
25.图1为本发明实施例1中磁性体装置的结构示意图；图中1磁性体；11磁性体顶壁；2细胞培养皿；3细胞；图中箭头表示图中右侧附图为从上往下的俯视图；
26.图2为本发明实施例2中不同葡萄糖浓度处理小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的相对
细胞存活率统计图；
27.图3为本发明实施例2中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的nrf2蛋白免疫荧光结果图；
28.图4为本发明实施例2中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的nrf2蛋白免疫印迹图；
29.图5为本发明实施例2中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的nrf2蛋白免疫印迹图定量统计图；
30.图6为本发明实施例2中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的ros相对含量图；
31.图7为本发明实施例3中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的细胞相对活力检测图；
32.图8为本发明实施例3中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的活细胞和死细胞免疫荧光图；
33.图9为本发明实施例3中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的活细胞百分比统计图；
34.图10为本发明实施例3中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的死细胞百分比统计图；
35.图11为本发明实施例3中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的细胞划痕试验随时间变化划痕闭合图；
36.图12为本发明实施例3中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的细胞浸润随时间变化图；
37.图13为本发明对比例1中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的ros相对含量图；图中control表示正常对照组；
38.图14为本发明对比例1中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的细胞相对数量图；图中control表示正常对照组；
39.图15为本发明对比例1中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的细胞周期分布图；图中control表示正常对照组；
40.图16为本发明对比例1中n/s极磁性体装置处理葡萄糖诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的存活、死亡、凋亡百分比图；图中control表示正常对照组；
41.图17为本发明对比例2中n/s极磁性体装置处理不同葡萄糖浓度诱导的小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3的总细胞数目图。
具体实施方式
42.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
44.实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或
条件或者按照产品说明书进行。
45.实施例1
46.如图1所示，本发明所用的磁性体装置包括磁性体、细胞培养单元。
47.磁性体的磁场方向为竖直方向。细胞培养单元为细胞培养皿，细胞培养皿位于磁性体顶壁11。
48.将磁性体装置放置在培养箱腔体的内底面，保证磁性体的s极向上，磁性体的n极向下与细胞培养箱腔体的内底面相对。
49.或者磁性体的n极向上，磁性体的s极向下与细胞培养箱的腔体的内底面相对。
50.本实施例中细胞培养皿的磁感应强度为～0.5t。本实施例中磁性体为钕铁硼永磁体，s极或n极磁场向上，表面最大强度达到0.5t。在钕铁硼永磁体的上端或下端，极性均匀，磁场梯度维持在相对较小的范围。
51.实施例2
52.采用实施例1中的磁性体装置在调节葡萄糖诱导的离体小鼠胚胎成纤维细胞氧化应激水平中的应用，具体包括以下步骤：
53.(1)葡萄糖诱导的离体小鼠胚胎成纤维细胞，在细胞内外形成高糖环境，形成高氧化应激水平，具体步骤如下：
54.小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3)按照每孔5000个细胞/100μl接种于96孔培养板中。并设置对照组和模型组。模型组另需加入不同浓度的d-( )-葡萄糖溶液(购于生工，货号a600219，溶剂为磷酸盐缓冲液)，加入葡萄糖溶液后，各细胞培养体系中葡萄糖浓度依次为25，30，50，70mmol/l，对照组和模型组细胞分别放置在37℃的二氧化碳培养箱(co2气体体积与气体总体积比v/v为5％)中培养24h，然后每孔加入10μl的cck-8溶液(cck-8溶液购于mce，货号：sq19844)，在37℃的二氧化碳培养箱中继续培养1h，在酶标仪上选择450nm的波长，检测各个孔的吸光度，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝模型组吸光度均值/对照组
×
100％，并筛选得到最佳葡萄糖诱导浓度。
55.(2)将对照组和模型组4
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105个/毫升的细胞接种到直径为3.5cm的细胞培养皿中，对照组细胞的培养环境为基础培养基(购于康宁，货号10-014-cv)；模型组细胞的培养环境为经步骤(1)筛选得到的葡萄糖终浓度为50mmol/l的培养基，然后将模型组细胞分别置于实施例1中0.5t磁场强度的n极、s极以及不充磁的磁性体的顶壁，培养24h。
56.测定指标及测定方法：
57.(1)免疫荧光检测nrf2蛋白在细胞内的分布情况：在检测前往细胞培养皿中放入盖玻片，进行细胞爬片。磁场处理24h后，取出盖玻片，用磷酸盐缓冲液(购于碧云天，货号c0221a)洗涤两次，然后在室温下用4％多聚甲醛(购于赛维尔，货号g1101，多聚甲醛在多聚甲醛溶液中的质量体积百分比m/v为4％)固定细胞15分钟，再用pbs洗涤三次后，在室温下用含有2％牛血清白蛋白(购于生工，货号a600332)、0.2％叠氮化钠(购于索莱宝，货号p0200)和含有0.1％的triton x-100(购于生工，货号a600198)的tbst溶液(购于赛维尔，货号g0004)制成的封闭液处理细胞1小时。按照1：1000的稀释比例，用上述封闭液稀释nrf2抗体(抗体购于武汉三鹰，货号66504-1-ig)，盖玻片上加入200μl稀释后的nrf2抗体在4℃下孵育过夜。然后用tbst溶液(购于赛维尔，货号g0004)洗涤三次，盖玻片上加入150μl的二抗溶液孵育30分钟。再用pbs洗涤三次后，盖玻片上加入dapi溶液(购于西格玛，货号d9542)孵
am染色试剂(购于碧云天，货号c2015m)100μl，37℃避光孵育30-45分钟，孵育结束后更换新鲜的培养基，再避光孵育30分钟，吸出培养基，磷酸盐缓冲液(购于碧云天，货号c0221a)洗2-3遍，然后每孔再加入50μl的pi(购于西格玛，货号p4864)，室温孵育8分钟，然后加入磷酸盐缓冲液(购于碧云天，货号c0221a)洗涤5-6遍，加入无血清培养基置于荧光显微镜下拍照，因为钙黄绿素-am染色的活细胞发出绿色荧光，pi染色的死细胞发出红色荧光，置于荧光显微镜下拍照可以观察活细胞和死细胞数目，并计算活细胞和死细胞的比例。
72.(3)edu细胞增殖检测：每皿细胞的培养基吸弃1ml后再加入1ml混有浓度为20μmol/l的2
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edu(购于碧云天，货号c0081l)的培养基，使edu终浓度为10μmol/l，继续孵育细胞2小时。edu标记细胞完成后，去除培养液，胰酶消化后用培养液重悬放入1.5ml的离心管中，再加入1ml4％的多聚甲醛，室温固定15分钟，去除固定液，每孔用含3％牛血清白蛋白(购于生工，货号a60033)的磷酸盐缓冲液(购于碧云天，货号c0221a)配置成的洗涤液1ml洗涤细胞3次，每次3-5分钟。去除洗涤液，每孔用1ml通透液(购于碧云天，货号p0097)室温孵育10-15分钟。去除通透液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。取edu细胞增殖检测试剂盒(购于碧云天，货号c0081l)中的1.72ml的click reaction buffer、80μl的cuso4、4μl的azide 647和200μl的click additive solution配制成混合液。去除上一步骤中的洗涤液。每个1.5ml的离心管中加入0.5ml的click反应液，轻轻混匀，室温避光孵育30分钟，吸除click反应液，用洗涤液洗涤3次，然后对细胞悬液样品进行流式检测，最大激发波长为650nm，最大发射波长为670nm。
73.(4)细胞划痕检测细胞增殖能力：将对照组和模型组的细胞接种到直径为3.5cm的细胞培养皿中，对照组和模型组细胞的培养环境均为基础培养基(购于康宁，货号10-014-cv)，培养24h后细胞汇合度为95％以上时，吸弃对照组和模型组细胞的培养基，然后对照组细胞在直径为3.5cm的细胞培养皿中加入基础培养基2ml；模型组细胞在直径为3.5cm的细胞培养皿加入基础培养基2ml并补充25mmol/l葡萄糖浓度的溶液50μl，使其培养基中葡萄糖终浓度为50mmol/l，并用10μl的塑料枪头进行划痕，并于磁场处理的第0h、12h、24h和36h时间点使用光学显微镜观察细胞划痕的闭合情况。
74.(5)细胞迁移检测细胞迁移能力：将对照组和模型组的细胞接种到3.5cm皿中，对照组和模型组细胞的培养环境均为基础培养基(购于康宁公司，货号10-014-cv)，培养24h后细胞汇合度为95％以上时用胰酶消化下细胞，将大约5
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104的细胞悬浮在100μl的无血清培养基中，并将其接种到transwell小室(购于康宁，货号3422)的上腔。然后将含20％胎牛血清的细胞培养基(购于clark bioscience，货号fb25015)添加到transwell小室的下腔中，并将小室置于24孔板中，磁场处理48h，然后取出小室，使用棉签擦去小室上腔的细胞，并使用4％的多聚甲醛溶液进行固定，1％结晶紫染色，使用光学显微镜进行拍照。
75.实验结果：
76.(1)如图7所示，在葡萄糖刺激下，n和s极钕铁硼永磁体处理组显著增加了细胞活力。
77.(2)如图8和9所示，在葡萄糖刺激下，n和s极钕铁硼永磁体处理组显著增加了活细胞百分比。
78.(3)如图10所示，在葡萄糖刺激下，n和s极钕铁硼永磁体处理组显著减少了死细胞百分比。
79.(4)如图11和12所示，在葡萄糖刺激下，n和s极钕铁硼永磁体处理组显著增加了细胞增殖和迁移能力。
80.本发明中的磁性体细胞处理装置在调节葡萄糖诱导的离体小鼠胚胎成纤维细胞氧化应激水平后，进一步促进细胞增殖和迁移，能扩展应用在调节细胞增殖、迁移药物研制的领域，为临床研究以及相关药物研制提供帮助。
81.对比例1
82.本对比例与实施例2的区别之处在于：更换磁性体的磁场强度，调整细胞受到的磁场强度为1t，将不同细胞密度的细胞接种到直径为3.5cm的细胞培养皿中，调整细胞培养环境中葡萄糖浓度均为25mm(正常糖培养环境)。
83.如图13所示，该磁场强度下的磁性体装置对细胞ros水平无显著影响。
84.如图14-图16所示，该磁场强度下的磁性体装置对不同细胞密度细胞的增殖、死亡和细胞周期均没有影响，其中相同处理条件下n极和s极效果相同。
85.对比例2
86.本对比例与实施例2的区别之处在于：更换磁性体的磁场强度，调整细胞受到的磁场强度为1t，调整细胞培养环境中葡萄糖浓度分别为5、10、25、50mm。
87.如图17所示，可以看出，磁场强度不同不能调节细胞增殖，在25mm正常糖浓度的培养环境下，1t磁场对细胞增殖没有影响，甚至在1t磁场强度下会抑制高糖环境(50mm)中细胞的增殖，其中相同处理条件下n极和s极效果相同。
88.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。