一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒及提取方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及石蜡切片样本检测病原微生物宏基因组的方法。


背景技术：

2.高通量测序的宏基因组技术可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，通过数据库序列比对判断所有微生物信息，在临床检测中发挥着重要的作用。而采用基因检测分析方法最重要的是获得新鲜无污染的样本且样本可提取足够纯度和数量的核酸。由于石蜡包埋组织保存时间长，对保存环境要求不高，基于石蜡组织切片样本为材料进行基因检测筛查目前已成为临床诊断的常规手段；但在石蜡切片样本提取核酸过程中，由于组织包埋于石蜡固体中，使得提取核酸dna过程困难，常规石蜡切片提取过程操作复杂，耗时较长，且常规的细胞裂解液包含氯仿等有毒试剂，且裂解细胞存在裂解不充分或是裂解过度，导致很难从细胞中提取出足够量的dna用于做pcr基因型鉴定。


技术实现要素：

3.为解决现有技术问题，本发明的目的是提供一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒及提取方法。针对微量样本建立高效的核酸提取方法，通过充分破碎组织细胞，改善提取核酸质量和含量差的问题，克服包括结核分枝杆菌等真菌细胞壁厚，破碎不充分，提取时间长等问题。为缩短提取时间，提高提取效率，建立基于宏基因组测序的疾病病原体检测和鉴定方法。氧化锆珠具有稳定性好，高强度，高密度、耐高温、耐腐蚀且成本低等优点，在核酸提取过程中使用氧化锆珠可在短时间内破碎裂解样本，可有效避免蛋白质的变性和核酸的降解且真菌检出率高。
4.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒，该试剂盒中包括组织裂解液和细胞裂解液，所述组织裂解液buffer atl包括pmsf 0.1-1mol/l、aprotinin 0.005-0.2umol/l、硫脲1-10mol/l、dtt 0.1-1mol/l、np-40裂解液1％-5％、triton x-100 0.5％-1.5％、pharmalyte 1％-5％、chaps 1％-10％、tris 0.01-0.08mol/l、edta 0.1-1mol/l。
6.所述细胞裂解液buffer al包括硫脲1-10mol/l、脲1-10mol/l、dtt 0.1-1mol/l、chaps 1％-10％、tris 0.01-0.08mol/l。
7.组织裂解液和细胞裂解液中涉及物质的百分比均为质量百分比。
8.一种石蜡组织切片样本提取结核分枝杆菌基因方法，包括了去除石蜡、样本组织破碎、样本dna提取、样本dna吸附、样本dna洗涤和样本dna洗脱。所述石蜡组织切片样本提取结核分枝杆菌基因的提取步骤如下：
9.s1去除石蜡：向装有组织切片的ep管中加入1-2ml二甲苯，振荡混匀，室温离心16000g，2-5min，弃上清，加入1-2ml无水乙醇，室温离心16000g，2-5min，弃上清。重复上述步骤1次后，打开ep管盖，37℃孵育10-20min，直至残余乙醇全部挥发。
10.s2样本组织破碎：在已脱蜡的组织块切片管内加入360ul buffer atl，转移到研磨管内进行研磨；研磨后管中液体转移到新的2ml的离心管中。
11.s3样本dna提取：向管内加入40-60ul蛋白酶k，充分混匀，56℃水浴1-2h；每隔15min颠倒混匀一次。90℃水浴1-2h，短暂离心，迅速加入400ul buffer al和400ul无水乙醇，充分混匀，短暂离心；
12.s4样本dna吸附：小心转移混合物于qiaamp层析柱中，20℃8000rpm离心1min，将柱子放入1个干净的收集管中；重复操作，将剩余混合液转入qiaamp层析柱中，过柱离心。
13.s5样本dna洗涤：小心打开柱子，加入500ul洗涤液i，20℃8000rpm离心3min，将柱子放入一个干净的收集管中，小心打开柱子，加入500ul洗涤液ii，盖上盖子，20℃8000rpm离心3min，将柱子放入一个干净的收集管中，20℃16000rpm离心3min，使膜完全干燥(生物安全柜中静置3min)。
14.s6样本dna洗脱：将柱子放入一个新的1.5ml干净的ep管中，小心打开柱子，加入50ul buffer ae，室温盖上盖子静置5min，20℃16000rpm离心1min，洗脱dna(-20℃保存)。
15.所述步骤s2中，组织裂解液buffer atl配方为：pmsf 0.1-1mol/l、aprotinin 0.005-0.2umol/l、硫脲1-10mol/l、dtt 0.1-1mol/l、np-40裂解液1％-5％、triton x-100 0.5％-1.5％、pharmalyte 1％-5％、chaps 1％-10％、tris 0.01-0.08mol/l、edta 0.1-1mol/l。
16.所述步骤s2中的研磨管，内有3颗3mm氧化锆珠；5颗1mm氧化锆珠，研磨仪机器设置频率为50hz，研磨时间50s。
17.所述步骤s3中，细胞裂解液buffer al配方为：硫脲1-10mol/l、脲1-10mol/l、dtt 0.1-1mol/l、chaps 1％-10％、tris 0.01-0.08mol/l。
18.所述步骤s3中，蛋白酶k浓度为10-40g/l。
19.所述步骤s3中，蛋白酶k提前加到新管中提前56℃预热3min。
20.所述步骤s3中，90℃孵育前如有沉淀，进行10000g，3min进行离心，留上清90℃水浴1h，丢弃沉淀。
21.所述步骤s5中，洗涤液i用于去除蛋白质等杂质成分，ph6-7，1-10mmol/l tris-hcl，0.1-1mol/l nacl，10-50％c2h5oh，0.5-2mol/l ch5n3·
hcl，洗涤液ii用于去除盐类等杂质成分，ph6-7，0.5-2.5nmol/l naac，70-85％c2h5oh。所述步骤s6中，buffer ae 9.5-10.5mmol/l t ris-hcl；0.8-1.2mmol/l edta。与现有技术相比，本发明的有益效果为：去除石蜡过程简单，去除充分，提供的样本组织裂解液和细胞裂解液配方更适合石蜡组织切片样本，样本组织细胞破碎时使用了裂解液的同时增加了使用高强度氧化锆珠研磨的方法，充分释放组织中的遗传物质，克服了包括结核分枝杆菌等真菌细胞壁厚破碎不充分的问题，缩短了提取时间，整个提取过程只需极少的样本即可准确检测到病原微生物基因组序列。
附图说明
22.图1是切片样本xpert的送检结果。
具体实施方式
23.以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
24.实施例1
25.一种石蜡切片宏基因组的提取方法，包括以下步骤：
26.(1)向装有组织切片的ep管中加入1ml二甲苯，振荡混匀，室温离心16000g，2min，弃上清，加入1ml无水乙醇，室温离心16000g，2min，弃上清。重复上述步骤1次后，打开ep管盖，37℃孵育10min，直至残余乙醇全部挥发。
27.(2)在已脱蜡的组织块切片管内加入360ul buffer atl，转移到研磨管内进行研磨；研磨后管中液体转移到新的2ml的离心管中。组织裂解液buffer atl为pmsf 1mol/l、aprotinin 0.2umol/l、硫脲7.8mol/l、dtt 1mol/l、np-40裂解液5％、triton x-100 0.5％、pharmalyte 1％、chaps 1％、tris 0.08mol/l、edta 1mol/l。
28.(3)向管内加入40ul蛋白酶k，充分混匀，56℃水浴1h；每隔15min颠倒混匀一次。90℃水浴1h，短暂离心，迅速加入400ul buffer al和400ul无水乙醇，充分混匀，短暂离心；细胞裂解液buffer al包括硫脲8mol/l、脲8mol/l、dtt 1mol/l、chaps 10％、tris 0.08mol/l。
29.(4)小心转移混合物于qiaamp层析柱中，20℃8000rpm离心1min，将柱子放入1个干净的收集管中；重复操作，将剩余混合液转入qiaamp层析柱中，过柱离心。
30.(5)小心打开柱子，加入500ul洗涤液i，20℃8000rpm离心3min，将柱子放入一个干净的收集管中，小心打开柱子，加入500ul洗涤液ii，盖上盖子，20℃8000rpm离心3min，将柱子放入一个干净的收集管中，20℃16000rpm离心3min，使膜完全干燥(生物安全柜中静置3min)。洗涤液i的包括为10mmol/l tris-hcl，0.1mol/l nacl，50％c2h5oh，2mol/l ch5n3·
hcl，ph为7；洗涤液ii的包括为2.5nmol/l naac，80％c2h5oh，ph为7。
31.(6)将柱子放入一个新的1.5ml干净的ep管中，小心打开柱子，加入50ulbuffer ae，室温盖上盖子静置5min，20℃16000rpm离心1min，洗脱dna(-20℃保存)。buffer ae为9.5mmol/l t ris-hcl；0.8mmol/l edta。
[0032][0033][0034]
表1石蜡切片样本基因组快速提取效果对比
[0035]
注：对比例1、对比例2为普通提取方法(对比例1和对比例2使用的细胞裂解液为不同厂家产品对比例1为abs9230的1
×
ripa裂解液，对比例2为abs9228的1
×
ripa裂解液，提
取过程不使用氧化锆珠)
[0036]
表2石蜡切片样本宏基因组测序结果1
[0037] 类型中文名称拉丁名称相对丰度序列数实施例1g 结核分枝杆菌复合群mycobacterium tuberculosis9.28％1280对比例1/////对比例2/////
[0038]
表3石蜡切片样本宏基因组测序结果2
[0039] 类型中文名称拉丁名称相对丰度序列数实施例1g 烟曲霉aspergillus fumigatus0.764％13652对比例1g 烟曲霉aspergillus fumigatus0.026％2430对比例2g 烟曲霉aspergillus fumigatus0.0013％156
[0040]
表4不同方法检出的微生物类型占比％
[0041][0042][0043]
结果显示本发明方法所得石蜡组织切片样本提取的dna浓度高且浓度均一，a260/a280比值均在1.8-2.0范围内，以样本1为例，实施例1提取核酸经测序检出结核分枝杆菌群，对比例1和对比例2未检出，为验证准确性将切片样本送检xpert，回报阳性。发现实施例烟曲霉菌检出相对丰度和序列数均高于对比例。本发明提取石蜡组织切片样本经宏基因组测序分析显示真菌检出率高于对比例。说明使用本发明的裂解液和氧化锆珠可提高提取石蜡组织切片样本浓度高，纯度好，后续高通量测序结果真菌检出率高且与临床对应。
[0044]
实施例2
[0045]
一种石蜡切片宏基因组的提取方法，包括以下步骤：
[0046]
(1)向装有组织切片的ep管中加入1ml二甲苯，振荡混匀，室温离心16000g，2min，弃上清，加入1ml无水乙醇，室温离心16000g，2min，弃上清。重复上述步骤1次后，打开ep管盖，37℃孵育10min，直至残余乙醇全部挥发。
[0047]
(2)在已脱蜡的组织块切片管内加入360ul buffer atl，转移到研磨管内进行研磨；研磨后管中液体转移到新的2ml的离心管中。组织裂解液buffer atl包括pmsf 0.5mol/l、aprotinin 0.005umol/l、硫脲5mol/l、dtt 0.5mol/l、np-40裂解液2％-、triton x-100 0.5％、pharmalyte 1％、chaps 1.5％、tris 0.05mol/l、edta 0.5mol/l。
[0048]
(3)向管内加入40ul蛋白酶k，充分混匀，56℃水浴1h；每隔15min颠倒混匀一次。90
℃水浴1h，短暂离心，迅速加入400ul buffer al和400ul无水乙醇，充分混匀，短暂离心；细胞裂解液buffer al包括硫脲2mol/l、脲2.5mol/l、dtt 0.5mol/l、chaps 2.5％、tris 0.03mol/l。
[0049]
(4)小心转移混合物于qiaamp层析柱中，20℃8000rpm离心1min，将柱子放入1个干净的收集管中；重复操作，将剩余混合液转入qiaamp层析柱中，过柱离心。
[0050]
(5)小心打开柱子，加入500ul洗涤液i，20℃8000rpm离心3min，将柱子放入一个干净的收集管中，小心打开柱子，加入500ul洗涤液ii，盖上盖子，20℃8000rpm离心3min，将柱子放入一个干净的收集管中，20℃16000rpm离心3min，使膜完全干燥(生物安全柜中静置3min)。洗涤液i的包括为4mmol/l tris-hcl，0.5mol/l nacl，40％c2h5oh，0.5mol/l ch5n3·
hcl，ph为6.3；洗涤液ii的包括为1.0nmol/l naac，75％c2h5oh，ph为6.3。
[0051]
(6)将柱子放入一个新的1.5ml干净的ep管中，小心打开柱子，加入50ulbuffer ae，室温盖上盖子静置5min，20℃16000rpm离心1min，洗脱dna(-20℃保存)。buffer ae为9.5mmol/l tris-hcl；0.8mmol/l edta。
[0052]
表5石蜡组织切片样本基因组快速提取效果对比
[0053][0054][0055]
注：对比例1、对比例2为普通提取方法(对比例1和对比例2细胞裂解液为直接购买并非本公司发明，对比例1为abs9230的1
×
ripa裂解液，对比例2为abs9228的1
×
ripa裂解液，提取过程使用氧化锆珠)
[0056]
表6石蜡切片样本宏基因组测序结果1
[0057] 类型中文名称拉丁名称相对丰度序列数实施例1g 结核分枝杆菌复合群mycobacterium tuberculosis9.28％1280对比例1/////对比例2/////
[0058]
表7石蜡切片样本宏基因组测序结果2
[0059] 类型中文名称拉丁名称相对丰度序列数实施例1g 烟曲霉aspergillus fumigatus0.764％13652对比例1g 烟曲霉aspergillus fumigatus0.0456％2630对比例2g 烟曲霉aspergillus fumigatus0.0035％228
[0060]
表1结果显示本发明方法所得石蜡组织切片样本提取的dna浓度高且浓度均一，a260/a280比值均在1.8-2.0范围内，经宏基因组测序，以样本1为例说明，实施例1提取核酸
经测序检出结核分枝杆菌群，对比例1和对比例2未检出。发现实施例烟曲霉菌检出相对丰度和序列数均高于对比例，说明使用本发明的氧化锆珠可提高提取石蜡组织切片样本浓度和纯度。
[0061]
实施例3
[0062]
一种石蜡切片宏基因组的提取方法，包括以下步骤：
[0063]
(1)向装有组织切片的ep管中加入1ml二甲苯，振荡混匀，室温离心16000g，2min，弃上清，加入1ml无水乙醇，室温离心16000g，2min，弃上清。重复上述步骤1次后，打开ep管盖，37℃孵育10min，直至残余乙醇全部挥发。
[0064]
(2)在已脱蜡的组织块切片管内加入360ul buffer atl，转移到研磨管内进行研磨；研磨后管中液体转移到新的2ml的离心管中。组织裂解液buffer atl包括pmsf 0.5mol/l、aprotinin 0.1umol/l、硫脲2.5mol/l、dtt 0.5mol/l、np-40裂解液5％、triton x-100 0.5％、pharmalyte 1.8％、chaps 5％％、tris 0.05mol/l、edta 0.5mol/l。
[0065]
(3)向管内加入40ul蛋白酶k，充分混匀，56℃水浴1h；每隔15min颠倒混匀一次。90℃水浴1h，短暂离心，迅速加入400ul buffer al和400ul无水乙醇，充分混匀，短暂离心；细胞裂解液buffer al包括硫脲2.5mol/l、脲2.5mol/l、dtt 0.5mol/l、chaps 5％、tris 0.05mol/l。
[0066]
(4)小心转移混合物于qiaamp层析柱中，20℃8000rpm离心1min，将柱子放入1个干净的收集管中；重复操作，将剩余混合液转入qiaamp层析柱中，过柱离心。
[0067]
(5)小心打开柱子，加入500ul洗涤液i，20℃8000rpm离心3min，将柱子放入一个干净的收集管中，小心打开柱子，加入500ul洗涤液ii，盖上盖子，20℃8000rpm离心3min，将柱子放入一个干净的收集管中，20℃16000rpm离心3min，使膜完全干燥(生物安全柜中静置3min)。洗涤液i的包括为6mmol/l tris-hcl，1mol/l nacl，45％c2h5oh，1.5mol/l ch5n3·
hcl，ph为7；洗涤液ii的包括为1.5nmol/l naac，85％c2h5oh，ph为7。
[0068]
(6)将柱子放入一个新的1.5ml干净的ep管中，小心打开柱子，加入50ul buffer ae，室温盖上盖子静置5min，20℃16000rpm离心1min，洗脱dna(-20℃保存)。buffer ae为9.5mmol/l t ris-hcl；0.8mmol/l edta。
[0069]
表8石蜡组织切片样本基因组快速提取效果对比
[0070][0071]
注：对比例1细胞裂解液为本公司发明，提取过程不使用氧化锆珠。
[0072]
表9石蜡切片样本宏基因组测序结果1
[0073] 类型中文名称拉丁名称相对丰度序列数实施例1g 结核分枝杆菌复合群mycobacterium tuberculosis9.28％1280对比例1g 结核分枝杆菌复合群mycobacterium tuberculosis0.921％111
[0074]
表10石蜡切片样本宏基因组测序结果2
[0075] 类型中文名称拉丁名称相对丰度序列数实施例1g 烟曲霉aspergillus fumigatus0.764％13652对比例1g 烟曲霉aspergillus fumigatus0.146％5430
[0076]
表1结果显示使用本发明的细胞裂解液所得石蜡组织切片样本提取的dna浓度高且浓度均一，a260/a280比值均在1.8-2.0范围内，经宏基因组测序，以样本1为例说明，实施例1和对比例1均经测序检出结核分枝杆菌群，但对比例1相对丰度和序列数较低。发现烟曲霉菌检出相对丰度和序列数均高于对比例，说明使用本发明的裂解液可提高提取石蜡组织切片样本浓度和纯度。
[0077]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。