一种除臭降解复合菌剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于微生物应用领域，具体涉及一种除臭降解复合菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.在没有人为调控的情况下，富含有机质的厕所粪污经微生物作用，在好氧条件下会分解产生氨气等刺激性气体，而在缺氧或厌氧条件下会分解产生挥发性低分子脂肪醇、胺、酸等恶臭物质，释放大量恶臭气体，严重影响厕所使用环境。且粪污的自然转化过程较为缓慢。因此需要在粪污恶臭控制和生物降解过程中进行人为调控和强化。
3.在厕所粪污生物处理过程中，关键在于开发出具有高效粪污降解和恶臭控制的功能微生物菌种，将功能菌种进行科学复配，通过复配菌种释放出具有降解有机物功能的高蛋白酶，从而在适宜的外界条件下，将粪污中的大分子有机物降解为糖、脂肪酸和氨基酸等小分子有机物。以此强化调控厕所粪污的生物降解及恶臭控制，实现粪污的无害化与资源化处理。
4.微生物除臭降解复合菌剂具有环境友好、成本低廉等优点，是目前治理恶臭环境的一个重要研究方向。其效果依赖于核心菌株的高效定殖作用，因此获得除臭和降解效果较好的优良菌株以及确保复合菌剂施加后能竞争过土著菌成为优势菌是该技术的关键所在。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种除臭降解复合菌剂及其制备方法和应用。
6.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株毕赤酵母(pichia fermentans)，2021年9月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.23387。
7.相应的，一株毕赤酵母(pichia fermentans)，其18s rdna序列如seq id no:2所示。
8.相应的，所述毕赤酵母在除臭中的应用。
9.相应的，利用所述毕赤酵母制备的除臭剂。
10.优选的，所述除臭剂为微生物复合菌剂，包括植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)。
11.优选的，所述植物乳杆菌保藏编号为：cgmcc no.23388。
12.优选的，按活菌比，所述植物乳杆菌：毕赤酵母＝1～2:1～5。
13.优选的，按活菌比，所述植物乳杆菌：毕赤酵母＝2:3。
14.优选的，除臭剂中的活菌浓度≥4.25
×
108cfu/ml。
15.相应的，所述除臭剂在除臭中的应用，所述除臭剂的用量为：每百克待处理物料中投入含有7
×
4.25
×
108cfu活菌量的除臭剂。
16.本发明具有以下有益效果：本发明筛选出了一株新的植物乳杆菌和新的毕赤酵母。这两株微生物不仅除臭性能优异，而且环境适应能力强：适应温度范围广，可在5℃低温乃至更低温环境下良好生长并保持优良的除臭性能；适应湿度范围广，在潮湿或干燥环境中均生长良好。本发明提供的微生物及制备的复合微生物菌剂可有效抑制产臭菌、病原菌及其他杂菌的生长，高效降解臭气源尤其是厕所粪污所产生氨气、硫化氢、tvoc等恶臭气体，具有显著的恶臭控制及粪污降解效果，且可用于高寒缺氧、冬季易结冰、生态系统较脆弱的特殊环境的除臭处理。
17.具体来说，本发明提供的除臭剂具有明确的针对性，主要针对粪污处理。粪污生物降解过程中会释放氨气、硫化氢和tvoc等恶臭气体，且粪便降解腐熟周期长，粪便中可能存在寄生虫或病原菌以及蚊蚁、蛆大量滋生等。针对粪污上述三大关键问题，本发明提供了一种可高效快速降解粪便、并处理粪污臭气的功能菌株及菌系，并进一步制备为除臭剂。除臭剂包含的两种微生物之间不仅无拮抗，还可协同作用于粪便恶臭源。而且，两株微生物经过有效复配优化，除臭降解效果明显优于单菌株和随机配比。
18.复合菌剂以“共生、共存、共荣”的微生态学原理为指导，构建以高效菌株为核心的除臭降解菌系，可以竞争性抑制腐生微生物及病原菌的生长，通过占据粪便微生态环境的优势生态位控制恶臭产生或直接降解恶臭物质，确保除臭降解效果的稳定持久性，实现在不产生恶臭物质的前提下完成粪污资源化处理。
附图说明
19.图1为植物乳杆菌的系统发育树图；
20.图2为毕赤酵母的系统发育树图；
21.图3为植物乳杆菌的显微镜照片；
22.图4为植物乳杆菌的菌落示意图；
23.图5为毕赤酵母的显微镜照片；
24.图6为毕赤酵母的菌落示意图。
具体实施方式
25.本发明提供了一种可降解恶臭气体、除臭效果优异、应用范围广泛的复合菌剂。所述复合菌剂包括植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)和毕赤酵母(pichiafermentans)。
26.优选的方案为：所述植物乳杆菌为：cgmcc no.23388；所述毕赤酵母为：cgmcc no.23387。
27.优选的方案为：按活菌比，所述植物乳杆菌：毕赤酵母＝2:3。
28.优选的方案为：所述复合菌剂在使用状态下，菌剂中活菌量≥4.25
×
108cfu/ml。
29.本发明还提供了所述复合菌剂的制备工艺，具体包括如下步骤：
30.1、菌株活化。将菌种从保藏状态恢复到室温状态，通过无菌划线接种于固体平板对其进行3代的复壮过程，使其逐渐适应培养环境。植物乳杆菌接入mrs固体培养中活化备用，毕赤酵母接入yped固体培养基中活化备用。
31.2、菌株发酵培育。将活化后的植物乳杆菌接入mrs液体培养基，毕赤酵母接入yped
液体培养基，于30℃、150r/min下发酵培养，植物乳杆菌的培养时间24h以上，发酵毕赤酵母的培养时间48h。
32.3、调节菌株发酵液的初始浓度。将植物乳杆菌和毕赤酵母的初始发酵液浓度调节为od
600
＝0.5，活菌浓度为4.25
×
108cfu/ml。
33.4、菌液的有机复配。将调节后的植物乳杆菌与毕赤酵母按活菌比为2:3进行混匀，即为液态的除臭降解复合菌剂。可根据实际需要，直接使用或制成粉剂或颗粒剂或其他形态的制剂或作为其他与对应微生物无冲突、无抵触的物理或化学除臭剂的组分之一进行使用。
34.本发明还提供了所述复合菌剂的使用方法。将所述复合菌剂直接投放到待处理物料中，与待处理物料混匀即可。也可根据实际情况同时投放木屑、稻壳、秸秆粉等填料一并混匀。需要说明的是：所述复合菌剂的用量与待处理物料的重量相关，每百克待处理物料优选为投入含有7
×
4.25
×
108cfu活菌量的复合菌剂。以液态复合菌剂为例，投放量为7ml复合菌剂/100g待处理物料。
35.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
36.本发明涉及的培养基配方如下：
37.(1)mrs液体培养基：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母膏5g/l，葡萄糖5g/l，乙酸钠5g/l，柠檬酸二铵2g/l，吐温80 1g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.05g/l，磷酸氢二钾2g/l，ph＝6.2。mrs固体培养基则在液体培养基基础上添加琼脂20g/l。
38.(2)yped液体培养基：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，孟加拉红0.03ml/l，ph＝6.0。yped固体培养基则在液体培养基基础上添加琼脂20g/l。
39.实施例一：复合菌剂中微生物的筛选、鉴定与保藏
40.1、微生物的筛选方法：本发明提供的植物乳杆菌和毕赤酵母均是从粪便样品中通过稀释涂布法筛选得到。从大量粪便样品中反复筛选获得如下具有除臭效果的微生物：4株芽孢菌、2株酵母菌和5株产酸菌。进一步试验发现：本发明提供的植物乳杆菌和毕赤酵母均可以在10℃乃至5℃低温下生长且保持良好的除臭性能。同时，所述植物乳杆菌还可耐40℃以上高温并保持良好的除臭和产酸性能。
41.2、微生物分子鉴定及保藏。对所述植物乳杆菌进行16s rrna测序，结果如seq id no:1所示，根据系统发育树(图1)，发现植物乳杆菌与lactobacillus plantarum strain cip 103151(nr 104573.1)的亲缘关系最近，序列相似性99.93％。对所述毕赤酵母进行18s rdna分子鉴定，结果如seq id no:2所示，根据系统发育树(图2)，发现毕赤酵母与pichia fermentans culture cbs:4807(ky 104537.1)的亲缘关系最近，序列相似性99.31％。
42.2021年9月14日，植物乳杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.23388，分类命名为：植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)。2021年9月14日，毕赤酵母保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.23387，分类命名为：发酵毕赤酵母(pichia fermentans)。
43.3、微生物的生理生化鉴定。所述植物乳杆菌的显微镜照片如图3所示，培养皿中培
养的菌落照片如图4所示；所述毕赤酵母的显微镜照片如图5所示，培养皿中培养的菌落照片如图6所示。
44.植物乳杆菌的生理生化鉴定结果如表1所示，毕赤酵母的生理生化鉴定结果如表2所示。表中“ ”代表阳性，
“‑”
代表阴性。
45.表1植物乳杆菌的生理生化鉴定结果
[0046][0047]
表2毕赤酵母的生理生化鉴定结果
[0048][0049]
实施例二：单独微生物和复合菌剂除臭效果对比
[0050]
1、制作容积为10l的模拟装置，装置中装有200g新鲜粪污，装置密闭。设置3个处理，各处理分别向装有200g新鲜粪污的装置中加入6ml菌液，菌液中活菌浓度均为：4.25
×
108cfu/ml。处理1添加菌液为所述植物乳杆菌菌液，处理2添加菌液为所述毕赤酵母菌液，处理3添加菌液为以1:1体积比混合组合的所述植物乳杆菌和所述毕赤酵母混合菌液。同时，以不加菌剂为对照组。每组实验设置三个重复，放置于30℃恒温培养箱培养，环境湿度为60％。
[0051]
2、在处理5d、10d、15d、20d和30d后，分别测定各组挥发性固体(vs)(《水和废水监测分析方法(第四版)》)、氨气浓度(气体快速检测仪)、硫化氢浓度(气体快速检测仪)、总挥发性有机化合物(tvoc)浓度(气体快速检测仪)和综合臭气浓度(ou)(气体快速检测仪)。根据vs的变化情况评价各组菌剂的降解性能，根据氨气浓度、硫化氢浓度、tvoc浓度和综合臭气浓度评价各组菌剂的除臭效果。测定结果如表3所示。表3中对照组的各测定指标展示当前时间下测定的对应指标实际值，各处理组的各测定指标展示当前时间下测定的对应指标去除率；去除率计算方法为：(当前时间下对照组测定值-当前时间下处理组测定值)/当前
时间下对照组测定值
×
100％。表3中，vs的单位均为％，对照组的氨气浓度、硫化氢浓度、tvoc浓度单位均为mg/m3，各处理组的各指标单位均为％(均为去除率)。后续表格中各指标的单位、去除率计算方法与此处相同。
[0052]
表3各组菌剂除臭效果展示
[0053][0054]
从上表可以看出，vs去除率随时间的延长而提高，粪污中残留的有机固形物含量趋于减少，证明本发明提供的微生物对粪污中固形物有降解作用。新鲜粪污在经处理组3处理10天后无臭无味。处理20d和30d的效果差异不大，故后续实验中均最长只体现测试20d的数据。
[0055]
实施例三：制备和使用参数对除臭剂除臭效果的影响
[0056]
1、复合菌剂中微生物用量比例关系的影响。
[0057]
利用与实施例二相同的装置，每个处理的装置中依然装新鲜粪污200g，设置9个处理；同时以不加菌液作为对照组。均放置于30℃恒温培养箱培养，环境湿度为60％。各处理中植物乳杆菌和毕赤酵母组成如表4所示。表4中，各微生物用量数值指相较于粪污质量的体积质量比，例如，1％指200g粪污中使用1％
×
200即2ml的对应微生物发酵液。各微生物发酵液中，活菌浓度为4.25
×
108cfu/ml。后续涉及微生物用量体积质量比的地方，与此相同。
[0058]
表4各组菌剂组成示意表
[0059]
组别植物乳杆菌毕赤酵母组11％1％组21％2％组31％3％组41％4％组51％5％组62％1％组72％3％组82％5％
[0060]
培养10d后(根据实施例二，培养10d基本实现无臭无味，为节省成本，本实施例采用10d)，测定各组vs、氨气浓度、硫化氢浓度、tvoc浓度和ou浓度。测定结果如表5所示。对照组的各测定指标展示当前时间下测定的对应指标实际值，各处理组的各测定指标展示当前时间下测定的对应指标去除率。
[0061]
表5各组菌剂除臭效果展示
[0062][0063][0064]
结果显示：植物乳杆菌与毕赤酵母按活菌量比为2:3混合时，除臭效果最佳。本实施例后续实验中的复合菌剂均使用2:3的比例。
[0065]
本实施例同时测试了复合菌剂的稳定性：将混匀制备好的液态复合菌剂存于室温环境，初始活菌浓度为4.25
×
108cfu/ml，30d后检测，活菌浓度为3.76
×
108cfu/ml(以2:3活菌比组别为例；其余处理组活菌浓度与之差异不显著)。将放置30d后的各组复合菌剂再进行除臭实验，除臭效果与表5差异不显著。证明本发明提供的复合菌剂稳定性较好。
[0066]
2、复合菌剂用量的影响。
[0067]
将植物乳杆菌和发酵毕赤酵母以活菌量比为2:3均匀复配，各微生物发酵液中，活菌浓度为4.25
×
108cfu/ml；再按相较于粪污质量的体积质量比不同设计6个处理，相较于粪污质量，各处理中复合菌剂的添加梯度分别为：1％、3％、5％、7％、10％、15％。均放置于30℃恒温培养箱培养，环境湿度为60％；分别在培养至10d、20d的时候，取样检测。结果如表6所示。对照组的各测定指标展示当前时间下测定的对应指标实际值，各处理组的各测定指标展示当前时间下测定的对应指标去除率。结果显示：添加7％的微生物除臭效果最佳。
[0068]
表6各组菌剂除臭效果展示
[0069][0070][0071]
3、使用方法的影响。
[0072]
将植物乳杆菌和毕赤酵母以活菌量比为2:3均匀复配，各微生物发酵液中，活菌浓度为4.25
×
108cfu/ml；复合菌剂的添加量为7％或相当于液体复合菌剂7％添加量的用量。除变量外，其余情况下温度条件均设置为30℃，湿度为65％，复合菌剂为液体。将各试验装置置于不同环境下，温度条件分别设计为5℃、10℃、20℃、30℃、45℃，湿度条件分别设计为35％、50％、65％、80％、90％，复合菌剂使用形式设计为液体形式、包埋法固定(海藻酸钠包埋法)、喷雾干燥。同时在各个不同的温度、湿度条件下，均设置不添加复合菌剂的空白对照组。同时市购三种不同厂家来源的植物乳杆菌和三种不同厂家来源的毕赤酵母，分别替换本发明筛选的植物乳杆菌或替换本发明筛选的毕赤酵母，或同时替换本发明筛选的植物乳杆菌和毕赤酵母，在其余条件完全相同的情况下同时进行上述实验，作为阳性对照组。阳性对照组的设置方案如表7所示。市购植物乳杆菌包括：cgmcc no.1.2437(植物乳杆菌)、购自江苏绿科生物的植物乳杆菌、购自河北仟盛生物的植物乳杆菌；三种市购毕赤酵母均来自明舟生物。
[0073]
表7阳性对照组设置方案展示
[0074]
[0075][0076]
测定上述各处理组、对照组10d、20d后，挥发性固体vs、氨气浓度、硫化氢浓度、tvoc浓度和ou浓度。温度变化条件下具体结果如表8所示。湿度变化条件下结果如表9所示。制剂形式变化时结果如表10所示。表8、9、10展示的是各处理组及空白对照组的数据。空白对照组的各测定指标展示当前时间下测定的对应指标实际值，各处理组的各测定指标展示当前时间下测定的对应指标去除率。
[0077]
表8不同温度下复合菌剂除臭效果展示
[0078][0079]
表9不同湿度下复合菌剂除臭效果展示
[0080][0081]
表10不同制剂形式下复合菌剂除臭效果展示
[0082][0083]
出于篇幅考虑，各阳性对照组的具体数据不在文中一一体现。在5～10℃范围内，阳性对照组1～6各指标的去除率效果为本发明处理组对应效果的33％～42％，阳性对照组7～15各指标的去除率效果为本发明处理组对应效果的0～12％，阳性对照组7～15在5℃处理效果均为0。在20～30℃范围内，各阳性对照组各指标的去除率效果为本发明对应效果的72％～98％。在45℃时，阳性对照组1～6各指标的去除率效果为本发明处理组对应效果的55％～71％，阳性对照组7～15各指标的去除率效果为本发明处理组对应效果的36％～53％。
[0084]
结果显示：在5℃、45℃极端温度环境下，及35％、90％的极端湿度环境下，本发明提供的复合菌剂中各微生物不仅存活，而且依然具有优异的除臭性能。同时，喷雾干燥的复合菌剂效果仅略弱于液体形式，有效扩展了复合菌剂的应用场景。
[0085]
实施例四：复合菌剂在实践中的除臭效果展示
[0086]
本实施例中所用复合菌剂均为本发明筛选的植物乳杆菌和毕赤酵母按2:3复配获得的液体复合菌剂，菌剂中活菌浓度为4.25
×
108cfu/ml。
[0087]
1、在成都市双流区选一工厂进行人体粪污取样。设置处理组和对照组，每组分别为储存40kg粪污的发酵槽，每组重复3次。处理组加入2.8ml的复合菌剂，对照组加入等量无菌水。分别在5d、10d、15d、20d和30d后取样测定vs、氨气浓度、硫化氢浓度、tvoc浓度和综合臭气浓度，并计算相应的去除率。结果如表11所示(处理组为去除率，对照组为实测值)。
[0088]
表11除臭效果展示表
[0089][0090]
2、在四川遂宁选一较干旱地进行20户旱厕的小批量应用效果测试。分别向其中10户的厕所内投加粪污质量体积比7％的除臭降解复合菌剂，因旱厕下设的储粪槽没有自动搅拌装置，所以复合菌剂分别在2d、12d和22d分批次加入，共计添加粪污质量体积比7％，粪污质量以储粪槽容量估算。以另外10户作为不加菌剂、添加等量无菌水的对照组，分别在5d、10d、15d、20d和30d后取样测定vs、氨气浓度、硫化氢浓度、tvoc浓度和综合臭气浓度，并计算相应的去除率。结果如表12所示。
[0091]
表12除臭效果展示表
[0092]
测定指标vs氨气浓度硫化氢浓度tvoc浓度ou5d86.3265.6459.0560.3562.67对照组90.16399.2640.3585642110d88.7585.4964.7470.3169.63对照组90.86393.3542.2686143015d91.4185.0864.9070.8960.31对照组90.34392.9841.1986042520d89.3585.9764.5971.0471.18对照组90.26393.242.7585942730d90.985.1264.7671.6271.49对照组90.74392.9743.17861430
[0093]
3、在四川阿坝州红原县某旅游景区选择六个移动式公共厕所，其拥有相同容积的储粪箱，向其中三个投加粪污质量体积比7％的复合菌剂，启动装置，投入使用。以其它三个不加菌剂、添加等量无菌水的移动公共厕所作为对照。分别在5d、10d、15d、20d和30d后取样
测定vs、氨气浓度、硫化氢浓度、tvoc浓度和综合臭气浓度，并计算相应的去除率。测定结果如表13所示。
[0094]
表13除臭效果展示表
[0095][0096][0097]
结果显示：在阿坝州地区高寒缺氧、冬季易结冰、生态系统较脆弱的特殊环境条件下，本发明提供的复合菌剂依然能够发挥降解粪便并脱除恶臭的作用，再次证明了该复合菌剂具有很强的环境适应性。
[0098]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。