采用HPLC分离测定塞来昔布中杂质D含量的方法及其应用与流程

采用hplc分离测定塞来昔布中杂质d含量的方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及药物检测技术领域，特别涉及一种采用hplc分离测定塞来昔布中杂质d含量的方法及其应用。


背景技术：

2.任何影响药物纯度的物质统称为杂质，药品中的杂质泛指在药品的生产与储运过程中产生的工艺杂质或降解产物等。药品在临床使用中产生的不良反应除了与主成分的药理活性有关外，与药品中存在的杂质也有很大关系，药品中杂质的控制是药品研发的一个重要方面，也是临床使用安全性的保障。因此，为了保证药物的安全有效，同时也要考虑到生产实际情况，国内外在药物的研究过程中均将杂质检测作为控制药品质量的重要指标。药品杂质检测研究是目前我国药品研发中的薄弱点之一。要全面提升我国药品研发的水平、切实保证公众用药的安全性，必须重视并加强药品中有关杂质的研究。
3.塞来昔布，即4[5-4(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1氢-1-吡唑-1-基]苯磺酰胺，是第一个选择性cox-2抑制剂，也是目前全球处方量最大的非甾体类抗炎镇痛药(nsaids)，不仅具有显著镇痛疗效，能显著减轻关节触痛、疼痛和关节肿胀，而且对人体内的胃肠道十分安全。已知塞来昔布原料药生过程中可生成杂质d，塞来昔布与塞来昔布杂质d的结构式如下：
[0004][0005]
上述杂质化合物具有基因毒性杂质警示结构苯肼结构，被ich m7定义为3类基因毒性杂质，即具有警示结构、与原料药结构无关和无致突变性数据，按照ich规定人体每天摄入基因毒性杂质的量不能超过1.5μg，需要对其进行严格的限度控制，更好地监控塞来昔布产品的质量，并实现塞来昔布及反应副产物的有效分离。
[0006]
但由于此类杂质检测在灵敏度、选择性、待测物稳定性、基因复杂性等方面呈现特殊要求，因此在分析方法开发和选择上带来了与其他药物杂质检测更大的挑战。


技术实现要素：

[0007]
本发明目的在于为克服现有的技术缺陷，提供一种采用hplc分离测定塞来昔布中杂质d含量的方法，通过建立塞来昔布杂质d的hplc-uv测定法，对塞来昔布中可能存在的杂质d进行检测分离，以更好的控制塞来昔布原料及其制剂的产品质量。
[0008]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0009]
一种采用hplc分离测定塞来昔布中杂质d含量的方法，包括如下步骤：
[0010]
取塞来昔布加入有机溶剂制成供试品溶液；
[0011]
采用高效液相色谱仪对供试品溶液进行检测，并采用紫外检测器作为监测器，色谱条件如下：
[0012]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
[0013]
波长：320nm～340nm；
[0014]
流动相a：0.05％～0.15％磷酸溶液；
[0015]
流动相b：甲醇-乙腈-水溶液；
[0016]
所述流动相a和所述流动相b按程序进行梯度洗脱：
[0017]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)050502040602530703059560595625050705050。
[0018]
进一步地，所述有机溶剂为甲醇溶液和乙腈溶液中的一种或多种的混合物。
[0019]
进一步地，所述高效液相色谱仪检测波长为330nm。
[0020]
进一步地，所述流动相a为0.1％磷酸溶液。
[0021]
进一步地，所述流动相b中甲醇:乙腈:水的含量比为50:20:30。
[0022]
进一步地，所述高效液相色谱法的柱温为25℃～40℃，流速为0.8～1.2ml/min。
[0023]
进一步地，所述柱温为30℃，所述流速为1.0ml/min。
[0024]
本发明的另一目的还在于提供一种上述方法在控制塞来昔布质量中的应用，所述方法用于分离及定量测定塞来昔布原料或制剂中杂质d的含量，以控制药品的质量。
[0025]
进一步地，所述塞来昔布原料或制剂中杂质d的含量小于2.5ppm，以利于更好控制塞来昔布原料及制剂的质量。
[0026]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0027]
1、本发明采用高效液相色谱仪测定塞来昔布中杂质d的含量，具有分离效率高、分析速度快和灵敏度高的优点；利用紫外检测器作为监测器以检测塞来昔布中杂质d的含量，检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，其特点是灵敏度较高、线性范围宽、噪声低和适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测塞来昔布中杂质d的含量后也不会破坏样品，以利于更好地控制塞来昔布的质量；利用流动相a和流动相b的梯度洗脱程序，提高杂质d分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。
[0028]
2、本发明通过检测塞来昔布胶囊中杂质d的含量，控制每粒塞来昔布胶囊中杂质d不得超过2.5ppm，以利于更好控制塞来昔布胶囊的质量。
附图说明
[0029]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]
图1为施例1中空白溶液的hplc图；
[0031]
图2为施例1中对照品溶液的hplc图；
[0032]
图3为实施例1中供试品溶液的hplc图；
[0033]
图4为实施例2中空白溶液的hplc图；
[0034]
图5为实施例2中灵敏度溶液的hplc图；
[0035]
图6为实施例2中对照品溶液的hplc图；
[0036]
图7为实施例2中供试品溶液的hplc图；
[0037]
图8为实施例6的线性回归图。
具体实施方式
[0038]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039]
本发明实施例中所需材料均采购自市售渠道；所述色谱柱选用默克公司生产的purospher star rp-18e(4.0mm
×
5.5cm，3μm)；实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
[0040]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0041]
色谱系统的实验条件的确定
[0042]
实施例1：
[0043]
仪器：高效液相色谱仪，pda检测器；
[0044]
色谱柱：苯基键合硅胶；
[0045]
流动相成分含量比例为乙腈:水＝35:65；
[0046]
流速设置如下表1。
[0047]
表1：
[0048]
时间(min)流速(ml/min)0-300.830-501.5
[0049]
波长：205nm
[0050]
柱温：30℃
[0051]
进样量：20μl
[0052]
溶剂：乙腈-水(用1mol/l氢氧化钠调节ph至8.5)＝80:20；
[0053]
供试品溶液：取塞来昔布约0.56g，精密称定，置25ml量瓶中，加5ml甲醇使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0054]
对照品溶液：取塞来昔布杂质d对照品约56mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀得到溶液i；精密量取溶液i1ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀得到溶液ii，再精密量取溶液ii 1ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0055]
进样程序：取上述待测溶液各20μl，注入液相色谱仪，分别记录色谱图。
[0056]
空白溶液(溶剂)对杂质d检测无干扰；对照品溶液色谱图中杂质d在23.2min处出峰；供试品溶液未检出杂质d，在22.2min、24.0min处疑似有有干扰峰。色谱图详见图1、图2和图3。
[0057]
结论：以苯基键合硅胶填料为固定相，35％乙腈为流动相，采用上述流速梯度检测杂质d，在该方法条件下，供试品溶液中杂质d出峰处有相邻杂质峰干扰，且以加大流速的方式来洗脱强保留组分存在未洗脱完全的风险，该方法的缺陷明显，故不采用此方法。
[0058]
实施例2：
[0059]
仪器：高效液相色谱仪，紫外检测器；
[0060]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
[0061]
流速：1ml/min；
[0062]
流动相a：0.10％磷酸溶液；
[0063]
流动相b：甲醇-乙腈-水(50:20:30)
[0064]
流动相a和流动相b的梯度洗脱程序如表2：
[0065]
表2：
[0066][0067][0068]
波长：330nm
[0069]
柱温：30℃
[0070]
进样量：20μl
[0071]
稀释液：取甲醇800ml、乙腈200ml，混匀，即得。
[0072]
对照品溶液：取塞来昔布杂质d对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得到溶液i；精密量取溶液i1ml，转移至100ml量瓶中，用稀释液稀
释至刻度，摇匀得到溶液ii；再精密量取溶液ii 3ml，转移至10ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。
[0073]
灵敏度溶液：取杂质d对照品溶液4.0ml至25ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。
[0074]
供试品溶液：取塞来昔布胶囊内容物约2.2g(相当于塞来昔布1.6g)，精密称定，置20ml量瓶中，加稀释液溶解(如有必要超声处理)并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
[0075]
进样程序：取上述待测溶液各20μl，注入液相色谱仪。分别记录色谱图。
[0076]
由图4和图6可知，空白溶液(稀释液)对杂质检测无干扰，对照品溶液的hplc图中，杂质d在22.0min处出峰；由图5的基线波动高度和峰高可知，灵敏度溶液信噪比为81.4，远大于定量限信噪比须大于10的要求，符合实验要求；由图7可知，供试品溶液在杂质d的22.0min出峰处无干扰。
[0077]
经过试验，实施例2中的柱温还可采用25～40℃中的其他温度，流速还可采用0.8～1.2ml/min中的其他流速。
[0078]
结论：由实施例1和实施例2对比可知，以苯基键合硅胶填料为固定相，35％乙腈为流动相，采用流速梯度的方法检测分离杂质d，在该方法条件下，供试品溶液的hplc图中杂质d处存在相邻的杂质峰干扰，故实施例1中以加大流速的方式来洗脱杂质，存在未洗脱完全的风险，所以实施例1的方法缺陷明显，故不采用此方法；而实施例2中以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，磷酸溶液为流动相a、甲醇-乙腈-水溶液为流动相b，采用梯度洗脱的方式检测分离杂质，在该方法条件下，空白溶液对杂质检测无干扰，对照溶液色谱图中杂质d在22.0min处出峰；由基线的波动高度和峰高可知，灵敏度溶液信噪比为81.4，远大于定量限信噪比须大于10的要求，符合实验要求；供试品溶液中未检出杂质d，且无相邻杂质峰干扰，该方法可得到基线平整的供试品溶液色谱图，且具有灵敏度高的特点，因此实施例2的方法适用于分离检测塞来昔布中的杂质d。
[0079]
系统精密度试验
[0080]
实施例3：
[0081]
按实施例2的液相色谱实验方法，取6份对照品溶液各20μl，连续进样6次，记录6次色谱图中杂质d的峰面积，计算其平均峰面积和相对标准偏差，相对标准偏差应不大于5.0％。其试验结果如下表3所示：
[0082]
表3：系统适用性试验结果
[0083][0084]
结论：系统适用性试验连续进样6次对照品溶液，根据色谱结果计算得杂质d的峰面积相对标准偏差为0.25％(要求≤5.0％)，表明实施例2的液相色谱实验方法精密度良好。
[0085]
系统重现性试验
[0086]
实施例4：
[0087]
按实施例2的液相色谱实验方法，配制6份塞来昔布胶囊样品，每个样品分别进样1次，记录色谱图。计算杂质d含量并求得相对标准偏差，相对标准偏差应不大于5％。试验结果如表4所示：
[0088]
表4：精密度试验结果
[0089][0090]
结论：系统重现性试验结果表明，6次液相色谱实验中塞来昔布胶囊均未检出杂质d，表明该方法重现性良好。
[0091]
准确度试验
[0092]
实施例5：
[0093]
称取9份塞来昔布胶囊，每份2.2g(相当于塞来昔布1.6g)，分别置于20ml量瓶中，将9份塞来昔布胶囊分为3组，每组3份，每组分别用含有240ng/ml、300ng/ml、360ng/ml杂质d的甲醇溶液稀释至刻度，制得相当于含杂质d80％、100％、120％限度水平的加标回收溶液，加标回收率是指在没有被测物质的空白样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值，将制备好的溶液按实施例2的方法分别测定，每个样品分别进样1次，记录色谱图得到杂质d的含量，按下式计算回收率，回收率应在75％～120％之间，其试验结果见表5。
[0094][0095]
表5：回收率试验结果
[0096]
[0097][0098]
结论：准确度试验结果表明，9份加标回收溶液单个回收率在92.18％～99.31％之间，符合回收率要求，相对标准偏差为2.92％，不大于5％，综上所述该方法准确度良好。
[0099]
线性和范围
[0100]
实施例6：
[0101]
取浓度为30.75ng/ml、153.75ng/ml、246.00ng/ml、307.50ng/ml、369.00ng/ml、461.25ng/ml杂质d溶液，分别作为10％、50％、80％、100％、120％、150％限度的对照品溶液，按实施例2的方法分别测定，每个浓度重复进样3次，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作线性回归图，得到线性回归方程、相关系数r和线性图，要求相关系数r不得小于0.990。其试验结果如表6所示，相应的线性回归图如图8所示。
[0102]
表6：杂质d线性试验结果
[0103][0104]
结论：由线性和范围试验结果和线性回归图表明，杂质d回归方程为y＝0.0448x-0.1103，r＝0.9998，相关系数r符合不小于0.990的要求；综上所述，杂质d在浓度范围为30.75ng/ml～461.25ng/ml的进样浓度与峰面积有良好的线性关系。
[0105]
检测限与定量限
[0106]
实施例7：
[0107]
取实施例6中限度浓度为10％的对照品溶液作为定量限溶液，取定量限溶液3.0ml加蒸馏水稀释至10ml作为检测限溶液，按实施例2的方法分别测定，定量限溶液重复进样6次，检测限溶液进样1次，记录色谱图，检测限和定量限试验结果如表7所示：
[0108]
表7：检测限和定量限试验结果
[0109][0110]
结论：检测限与定量限试验结果表明，当杂质d的定量限溶液浓度为30.75ng/ml，重复进样6次，得到的色谱图中峰面积相对标准偏差为1.46％，符合检测实验要求，实验要求定量限溶液信噪比s/n≥10，测得定量限溶液信噪比为50，符合检测实验要求；检测限溶液要求为信噪比s/n≥3，而本实验中检测限溶液的信噪比为14，综上所述，该方法的检测限和定量限均满足检测要求。
[0111]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。