工程化免疫细胞及其用途的制作方法

1.本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及一种工程化免疫细胞，其表达(i)嵌合受体，和(ii)外源性的ccl3、ccl4和/或ccl5基因。更优选地，所述嵌合受体是嵌合抗原受体或t细胞受体。


背景技术：

2.肿瘤免疫治疗主要是通过调节人体免疫系统和肿瘤微环境，最终依靠自身免疫来清除肿瘤细胞。免疫系统是一个统一的整体，固有免疫在肿瘤免疫中也起到十分重要的作用。
3.一些抗原递呈细胞，如树突状细胞及巨噬细胞是固有免疫和获得性免疫的连接桥梁。抗原递呈细胞可以对肿瘤抗原进行识别并递呈给获得性免疫系统，激活肿瘤特异性t细胞，进而对肿瘤进行清除。因而通过增强抗原递呈过程来增加免疫系统杀伤肿瘤的效果是肿瘤免疫的重要研究方向。
4.car细胞治疗是重要的肿瘤细胞免疫疗法。car细胞成功控制肿瘤一般而言需要经过以下几个过程：免疫系统激活、car细胞的活化和扩增、活化的car细胞浸润肿瘤组织并杀死肿瘤细胞。然而，目前car细胞疗法普遍存在一个问题，即肿瘤微环境对car细胞有抑制作用，使得car细胞无法浸润肿瘤组织。因此，如何降低肿瘤微环境对car细胞的抑制作用，提高car细胞的存活时间，或者招募其他免疫细胞与car细胞协同作用，对于提高car细胞的治疗效果非常重要。
5.传统1型树突状细胞(conventional dc1，cdc1)是树突状细胞的一类亚群，是呈递肿瘤抗原的主要免疫细胞。研究结果显示，cdc1可以有效递呈肿瘤相关抗原，尤其是坏死细胞相关抗原，有效诱导抗原特异性cd8 t细胞应答，在体内肿瘤杀伤过程中发挥极其重要的作用。在小鼠及人的研究中均显示，cdc1在肿瘤微环境中的分布与抗肿瘤免疫应答呈正相关，是一个重要的肿瘤相关免疫评分的评价参数。cdc1在小鼠及人体内分布较少，在肿瘤免疫应答率低的小鼠及人肿瘤微环境中几乎不可见。优化cdc1在肿瘤治疗中的作用是提高肿瘤免疫治疗效果的一个重要研究方向。
6.炎症趋化因子在招募相关免疫细胞进入肿瘤微环境、驱动细胞相互作用和分子信号级联反应等方面起着重要作用，决定着宿主抗肿瘤免疫反应的最终结果。研究表明，巨噬细胞炎性蛋白(mip)-1家族及相关蛋白，由ccl3(mip-1a)、ccl4(mip-1b)和ccl5(rantes)组成，可通过直接招募抗原呈递细胞(例如招募树突状细胞到肿瘤部位)而成为某些肿瘤免疫细胞浸润的主要决定因素。另外据报道，肿瘤部位富集的mip-1家族相关蛋白可以通过募集自然杀伤细胞(nk)至肿瘤部位，进而促进cd103

cdc在肿瘤部位的积累，并增加趋化因子cxcl9和cxcl10的产生，有效抑制肿瘤进展。
7.因此，需要一种新的免疫治疗手段，可以有效分化或招募cdc1树突状细胞，以提高肿瘤抗原呈递效率，诱导机体过继性免疫反应，从而提高car细胞治疗的疗效。


技术实现要素：

8.在第一个方面，本发明提供一种新的工程化免疫细胞，其表达(i)嵌合受体，和(ii)外源性的ccl3、ccl4和/或ccl5基因。
9.在一个实施方案中，ccl3基因与seq id no：77或79所示的核酸序列具有至少90％同一性，或者所述ccl3基因编码的多肽与seq id no：78或80所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
10.在一个实施方案中，ccl4基因与seq id no：81或83所示的核酸序列具有至少90％同一性，或者所述ccl4基因编码的多肽与seq id no：82或84所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
11.在一个实施方案中，ccl5基因与seq id no：85或87所示的核酸序列具有至少90％同一性，或者所述ccl5基因编码的多肽与seq id no：86或88所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
12.在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞进一步表达(iii)外源性的白细胞介素。
13.在一个实施方案中，所述白细胞介素是il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、il-17、il-18、il-23、il33、或其亚基、或其组合、或其亚基的组合，优选是il-7。
14.在一个实施方案中，其中所述白细胞介素的编码基因与seq id no：41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75所示的核酸序列具有至少90％同一性，或者所述白细胞介素与seq id no：42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。
15.在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞表达的白细胞介素、ccl4或ccl5是可以抵抗蛋白酶水解的融合蛋白或者突变体。
16.在一个实施方案中，所述嵌合受体是嵌合抗原受体或t细胞受体。优选地，所述嵌合受体是嵌合抗原受体，其包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。其中，配体结合结构域可以选自免疫球蛋白分子、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、scfv、二硫键-连接的fv(sdfv)、抗体的重链可变区(vh)或轻链可变区(vl)、由vh和ch1结构域组成的fd片段、线性抗体、单结构域抗体、纳米抗体，以及非免疫球蛋白抗原结合支架
17.在一个实施方案中，所述嵌合受体与选自以下的靶标结合：tshr、cd19、cd123、cd22、baff-r、cd30、cd171、cs-1、cll-1、cd33、egfrviii、gd2、gd3、bcma、gprc5d、tn ag、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd38、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、间皮素、il-l lra、psca、prss21、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-β、ssea-4、cd20、afp、folate受体α、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、cs1、cd138、ncam、claudin18.2、prostase、pap、elf2m、ephrin b2、igf-i受体、caix、lmp2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、fucosyl gml、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、o-乙酰基-gd2、folate受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、gprc5d、cxorf61、cd97、cd 179a、alk、多聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-1、upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-la、mage-a1、豆荚蛋白、hpv e6、e7、mage al、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie 2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、pcta-l/galectin 8、melana/martl、ras突变体、htert、肉瘤易位断点、ml-iap、erg(tmprss2 ets融合基因)、na17、pax3、雄激素受体、cyclin bl、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b1、boris、sart3、pax5、oy-tes 1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒酶逆
转录酶、ru1、ru2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emr2、ly75、gpc3、fcrl5、igll1、pd1、pdl1、pdl2、tgfβ、april、nkg2d和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd123、cd138、cd171、muc1、afp、folate受体α、cea、psca、psma、her2、egfr、il13ra2、gd2、nkg2d、egfrviii、cs1、bcma、间皮素和它们的任意组合。
18.在一个实施方案中，所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζ亚基、cd3ε亚基、cd3γ亚基、cd3δ亚基、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154。优选地，跨膜结构域选自cd8α、cd4、cd28和cd278的跨膜结构域。
19.在一个实施方案中，所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。优选地，所述胞内信号传导结构域是包含cd3ζ的信号传导结构域。
20.在一个实施方案中，所述共刺激结构域是一个或多个选自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd8、cd18(lfa-1)、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd270(hvem)、cd272(btla)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)、cd357(gitr)、dap10、dap12、lat、nkg2c、slp76、pd-1、light、trim、cd94、ltb、zap70以及它们的组合。优选地，所述共刺激结构域是cd27、cd28、cd134、cd137或cd278的共刺激信号传导结构域或它们的组合。
21.在一个实施方案中，外源性的白细胞介素、ccl3、ccl4和/或ccl5的表达或活性是组成型表达。在另一个实施方案中，外源性的白细胞介素、ccl3、ccl4和/或ccl5的表达或活性是条件型表达。例如，通过将外源性基因与诱导型、阻遏型或组织特异性启动子可操作连接从而实现条件型表达。
22.在一个实施方案中，白细胞介素、ccl3、ccl4和/或ccl5可以与定位结构域可操作连接，所述定位结构域可以将本发明的外源性基因定位在特定的细胞位置上表达，例如细胞膜、细胞质中的特定细胞器例如内质网、高尔基体、细胞核等。定位结构域包括但不限于核定位信号、引导肽、跨膜结构域等。在一个实施方案中，本发明的外源性基因白细胞介素、ccl3、ccl4和/或ccl5与跨膜结构域可操作连接，从而锚定在工程化免疫细胞的表面表达。
23.在一个实施方案中，所述免疫细胞是选自t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞或nkt细胞。优选地，所述t细胞是cd4 /cd8 t细胞、cd4 辅助t细胞、cd8 t细胞、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞或αβ-t细胞。在一个实施方案中，免疫细胞衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等。
24.在第二个方面，本发明提供一种核酸分子，(i)编码嵌合受体的核酸序列，和(ii)编码ccl3、ccl4和/或ccl5的核酸序列。优选地，所述嵌合受体是嵌合抗原受体或t细胞受体，更优选嵌合抗原受体。
25.在一个实施方案中，核酸分子进一步包含编码白细胞介素的核酸序列。优选地，所述白细胞介素是il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、il-17、il-18、il-23、il33、或其亚基、或其组合、或其亚基的组合，更优选是il-7、其亚基或其组合。优选地，所述核酸是dna或rna。
26.本发明还提供包含上述核酸分子的载体。具体地，所述载体选自质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(rsv)、多瘤病毒和腺相关病毒(aav)。在一些实施方案中，该载体还包含在免疫细胞中自主复制的起点、选择标记、限制酶切割位点、启动子、多聚腺苷酸尾(polya)、3’utr、5’utr、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。
27.在一个实施方案中，本发明还提供一种试剂盒，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体。
28.在一个实施方案中，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体，和一种多种药学上可接受的赋型剂。
29.在第三个方面，本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞、核酸分子、载体或药物组合物。
30.在一个实施方案中，所述癌症是实体瘤或血液肿瘤。更具体地，所述癌症选自：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和cns癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(gbm)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌、waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，例如b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)、小淋巴细胞性(sl)nhl、中间级/滤泡性nhl、中间级扩散性nhl、高级成免疫细胞性nhl、高级成淋巴细胞性nhl、高级小型非裂化细胞性nhl、大肿块病nhl)、套细胞淋巴瘤、aids相关淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、malt淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤等)、白血病(包括急性白血病，例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病诸如急性粒细胞白血病(包括未分化型和部分分化型)、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、红白血病、急性巨核细胞白血病；慢性白血病，例如慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病；和其他特殊类型的白血病例如毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、浆细胞白血病、成人t细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病等)、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、恶性淋巴组织增生疾病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(ptld)。
31.在一个实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。
32.在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于i型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。
33.本发明的工程化免疫细胞的优势之处在于，共表达的ccl3、ccl4和/或ccl5以及任
选的白细胞介素例如il7能够有效募集dc细胞至肿瘤部位，增加工程化免疫细胞的增殖及存活时间，从而一方面降低肿瘤微环境对工程化免疫细胞的抑制作用，提高工程化免疫细胞的肿瘤杀伤能力，另一方面募集的dc细胞能够激活机体自身t细胞的过继性免疫识别，与工程化免疫细胞形成协同效应，最终增强对肿瘤的抑制。
附图说明
34.图1：panc02-mcd19细胞的cd19表达率。
35.图2：通过流式细胞术测定的car-t细胞的car表达水平。
36.图3：通过elisa测定的car-t细胞的il-7表达水平。
37.图4：通过elisa测定的car-t细胞的ccl4表达水平。
38.图5：通过elisa测定的car-t细胞的ccl5表达水平。
39.图6：car-t细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养后的ifn-γ释放水平。
40.图7：用表达ccl4或ccl5的car-t细胞治疗小鼠胰腺癌后，小鼠的体重变化曲线。
41.图8：用表达ccl4或ccl5的car-t细胞治疗小鼠胰腺癌后，小鼠的肿瘤生长曲线。
42.图9：用表达ccl3的car-t细胞治疗小鼠胰腺癌后，小鼠的体重变化曲线。
43.图10.用表达ccl3的car-t细胞治疗小鼠胰腺癌后，小鼠的肿瘤生长曲线。
44.发明详述
45.除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。
46.嵌合受体
47.如本文所用，术语“嵌合受体”是指在细胞表面表达的能够与靶分子(例如配体)特异性结合的分子。此类分子一般包含能够与配体特异性结合的配体结合结构域、将表面分子锚定在细胞表面的跨膜结构域，以及负责信号传递的胞内结构域。常见的此类嵌合受体的实例包括例如t细胞受体或嵌合抗原受体。
48.如本文所用，术语“t细胞受体”或“tcr”是指响应于抗原呈递并参与t细胞活化的膜蛋白复合体。tcr的刺激由抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体分子(mhc)触发，所述抗原呈递细胞将抗原肽呈递至t细胞并且结合至tcr复合体以诱发一系列胞内信号传导。tcr由分别形成异二聚体的六条肽链组成，其一般分为αβ型和γδ型。每条肽链包括恒定区和可变区，其中可变区负责结合特异性的特定的抗原和mhc分子。tcr的可变区可以包含配体结合结构域或与配体结合结构域可操作连接，其中配体结合结构域的定义如下所述。
49.如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，各个结构域之间通过接头连接。car能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非mhc限制性的方式将t细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。非mhc限制性的抗原识别给予car细胞与抗原处理无关的识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在t细胞内表达时，car有利地不与内源性t细胞受体(tcr)的α链和β链二聚化。
50.如本文所用，“配体结合结构域”是指可以与配体(例如抗原)结合的任何结构或其功能性变体。配体结合结构域可以是抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重
组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其功能性片段。配体结合结构域的实例包括但不限于免疫球蛋白分子、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、scfv、二硫键-连接的fv(sdfv)、抗体的重链可变区(vh)或轻链可变区(vl)、由vh和ch1结构域组成的fd片段、线性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、以及非免疫球蛋白抗原结合支架，例如重组纤连蛋白结构域、darpin、亲合体、affilin、adnectin、affitin、obodies、repebody、fynomer、alpha body、avimer、atrimer、centyrin、pronectin、anticalin、kunitz型结构域、armadillo重复蛋白等。优选地，配体结合结构域选自fab、scfv、单结构域抗体、纳米抗体，或其功能性片段。在本发明中，配体结合结构域可以是单价或二价，且可以是包含一个或多个配体结合结构域的单特异性、双特异性或多特异性的抗体。
[0051]“fab”是指免疫球蛋白分子被木瓜蛋白酶裂解后产生的两个相同片段中的任一个，由通过二硫键连接的完整轻链和重链n端部分组成，其中重链n端部分包括重链可变区和ch1。与完整的igg相比，fab没有fc片段，流动性和组织穿透能力较高，并且无需介导抗体效应即可单价结合抗原。
[0052]“单链抗体”或“scfv”是由抗体重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)通过接头连接而成的抗体。可以选择接头的最佳长度和/或氨基酸组成。接头的长度会明显影响scfv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的接头(例如在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。关于接头的大小和组成的选择，参见例如，hollinger等人,1993proc natl acad.sci.u.s.a.90:6444-6448；美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及pct公布号wo2006/020258和wo2007/024715，其全文通过引用并入本文。scfv可以包含以任何顺序连接的vh和vl，例如vh-接头-vl或vl-接头-vh。
[0053]“单结构域抗体”或“sdab”是指一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2与ch3区，也称为“重链抗体”。
[0054]“纳米抗体”或“nb”是指单独克隆并表达出来的vhh结构，其具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。
[0055]
术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰优选是保守型修饰。
[0056]
如本文所用，术语“保守性修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和pcr介导的诱变而引入本发明的嵌合抗原受体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。
[0057]
因此，“功能性变体”或“功能性片段”与亲本氨基酸序列具有至少75％，优选至少
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且保留亲本氨基酸的生物活性，例如结合活性。
[0058]
如本文所用，术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如blast(altschul等(1997)nucleic acids res.25：3389-3402)、blast2(altschul等(1990)j.mol.biol.215：403-410)、smith-waterman(smith等(1981)j.mol.biol.147：195-197)和clustalw。
[0059]
配体结合结构域的选择取决于待识别的与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记，例如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。因此，在一个实施方案中，本发明的配体结合结构域与选自以下的一个或多个靶标结合：tshr、cd19、cd123、cd22、cd30、cd171、cs-1、cll-1、cd33、egfrviii、gd2、gd3、bcma、tn ag、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd38、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、间皮素、il-l lra、psca、prss21、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-β、ssea-4、cd20、folate受体α、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、ncam、prostase、pap、elf2m、ephrin b2、igf-i受体、caix、lmp2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、fucosyl gml、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、o-乙酰基-gd2、folate受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、gprc5d、cxorf61、cd97、cd 179a、alk、多聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-1、upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-la、mage-a1、豆荚蛋白、hpv e6、e7、mage al、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie 2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、pcta-l/galectin 8、melana/martl、ras突变体、htert、肉瘤易位断点、ml-iap、erg(tmprss2 ets融合基因)、na17、pax3、雄激素受体、cyclin bl、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b 1、boris、sart3、pax5、oy-tes 1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emr2、ly75、gpc3、fcrl5、igll1、pd1、pdl1、pdl2、tgfβ、april、nkg2d和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自：cd19、cd20、cd22、baff-r、cd33、egfrviii、bcma、gprc5d、psma、ror1、fap、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、caix、wt1、ny-eso-1、cd79a、cd79b、gpc3、claudin18.2、nkg2d和它们的任意组合。根据待靶向的抗原，本发明的car可以被设计为包括对该抗原具有特异性的配体结合结构域。例如，如果cd19是待靶向的抗原，则cd19抗体可用作本发明的配体结合结构域。
[0060]
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体靶向cd19、cd22或其组合。在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含抗cd19抗体，其包含与seq id no：1第1-107位或seq id no：25第1-107位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列和与seq id no：1第123-242位或seq id no：25第123-238位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列。在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含抗cd22抗体，其包含与seq id no：27第1-124位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列和与seq id no：27第143-249位所示的氨基酸序列具有至少70％，优
选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列。
[0061]
如本文所用，术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞(例如淋巴细胞、nk细胞或nkt细胞)表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζ亚基、cd3ε亚基、cd3γ亚基、cd3δ亚基、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154及其功能性片段。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自cd8α链或cd28，其与seq id no:3、5或30所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与seq id no:4、6或29所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0062]
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含位于配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。如本文所用，术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至配体结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为配体结合结构域提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自cd8、cd4或cd28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链区包含cd8α链、fcγriiiα受体、igg4或igg1的铰链区部分，更优选来自cd8α、cd28或igg4的铰链，其与seq id no:19、21、23或36所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或者其编码序列与seq id no:20、22、24或35所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0063]
如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分。胞内信号传导结构域负责在配体结合结构域结合抗原以后的细胞内初级信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达car的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
[0064]
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的胞内信号传导结构域可以是t细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发初级信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞内信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,itam)。本发明的胞内信号传导结构域的非限制性施例包括但不限于源自fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。在优选的实施方式中，本发明car的信号传导结构域可以包含cd3ζ信号传导结构域，该信号传导结构域与seq id no:11、13或34所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与seq id no:12、14或33所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的
序列同一性。
[0065]
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能片段。“共刺激分子”是指在t细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导t细胞的共刺激反应(例如增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于1类mhc分子、btla和toll配体受体。本发明的共刺激结构域的非限制性施例包括但不限于源自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd8、cd18(lfa-1)、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd270(hvem)、cd272(btla)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)、cd357(gitr)、dap10、dap12、lat、nkg2c、slp76、pd-1、light、trim、cd94、ltb以及zap70。优选地，本发明car的共刺激结构域来自4-1bb、cd28、cd27、ox40或其组合。在一个实施方案中，本发明的car包含的共刺激结构域与seq id no:7或9所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或该共刺激结构域的编码序列与seq id no:8或10所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0066]
在一个实施方案中，本发明的car还可以包含信号肽，使得当其在细胞例如t细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自cd8α、igg1、gm-csfrα、b2m等的信号肽。在一个实施方案中，可用于本发明的信号肽与seq id no:15、17或40所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或该信号肽的编码序列与seq id no:16、18或39所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0067]
在一个实施方案中，本发明的car还可以包含开关结构，以调控car的表达时间。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外结合结构域，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构域分别连接结合结构域和信号传导结构域，仅当开关结构域互相结合(例如在诱导化合物的存在下)时，结合结构域和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外结合结构域，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外结合结构域，使其成为一个“普通”的car结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。
[0068]
在一个实施方案中，本发明的car还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时(例如产生严重的毒副作用时)清除car细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如cd20表位、rqr8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除car细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)，该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是icaspase-9，可以通过化学诱导药物如ap1903、ap20187等诱导icaspase-9发生二聚化，从而激活下游的
caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。
[0069]
cc趋化因子
[0070]
趋化因子根据其n端半胱氨酸的排列方式，可分为cxc、cc、c和cx3c四个亚族，其中cc趋化因子因含有两个相邻的半胱氨酸-半胱氨酸(cys-cys或c-c)残基而得名。cc趋化因子的实例是与ccr1和ccr5结合的那些，包括mip-1α、mip-1β、ccl5、mcp-1、mcp-2、mcp-3、i-309等。
[0071]
巨噬细胞炎性蛋白(mip)具有两种主要的形式：α(mip-1α，也称为ccl3)和β(mip-1β，也称为ccl4),最先分离自由脂多醣所活化的巨噬细胞培养液。这两者具有相似的序列和活性，主要由巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞等产生，均通过与细胞表面的趋化因子受体5(ccr5)的结合来参与对炎症和感染的免疫应答。已有研究表明，ccl3和ccl4参与肺结核等许多传染病的宿主防御反应，介导免疫细胞的定向迁移。
[0072]
ccl5也称为rantes，是一种分子量为8000的小分子蛋白,人ccl5蛋白的基因定位于17q11-21。cll5以单体、二聚体、多聚体等多种形式存在。ccl5主要表达于巨噬细胞、活化的t细胞、成纤维细胞、胶质细胞、上皮细胞、内皮细胞、血小板和特定的肿瘤细胞,对多种白细胞如单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、t淋巴细胞、自然杀伤细胞等具有趋化或刺激作用。
[0073]
ccl3、ccl4和ccl5均与ccr5结合，从而募集免疫细胞，例如未成熟的骨髓树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、th1、treg、nk和浆细胞样树突细胞等定向迁移至炎性部位或肿瘤部位。
[0074]
在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞表达(i)嵌合受体,和(ii)外源性的ccl3、ccl4和/或ccl5基因。更优选地，本发明的工程化免疫细胞表达(i)嵌合抗原受体,和(ii)外源性的ccl4和/或ccl5基因。
[0075]
在一个实施方案中，本发明使用的ccl3与seq id no：78或80所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或ccl3的编码序列与seq id no：77或79所示的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0076]
在一个实施方案中，本发明使用的ccl4与seq id no：82或84所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或ccl4的编码序列与seq id no：81或83所示的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0077]
在一个实施方案中，本发明使用的ccl5与seq id no：86或88所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或ccl5的编码序列与seq id no：85或87所示的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0078]
白细胞介素
[0079]
白细胞介素是由白细胞产生，且在白细胞间发挥功能的一类细胞因子，在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导t、b细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。一般而言，白细胞介素的生物学效应通过其与相应受体的结合来实现，例如il-7的生物学特性通过il-7与其受体il-7r的结合来实现。
[0080]
在一个实施方案中，可用于本发明的白细胞介素包括但不限于il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、il-17、il-18、il-23、il33、或其亚基、或其组合、或其亚基的组合，更优选il-7或其亚基。il-2主要由t细胞产生，通过自分泌和旁分泌的方式发挥作用。il-2不仅能维持t细胞生长，促进细胞因子的产生，而且能够诱导cd8 t细胞和cd4 t细胞发挥细胞毒性作用。此外，il-2还能够刺激nk细胞增殖，增强nk杀伤活性，促进nk细胞产生ifnγ、tnfβ、tgfβ等因子，以及激活巨噬细胞，增强巨噬细胞的抗原呈递能力和靶细胞杀伤能力。il-7主要由骨髓及胸腺基质细胞产生，其主要功能涉及以下几个方面：促进前体b细胞生长；抑制外周t细胞凋亡，诱导细胞增殖、持续存活；以及影响树突状细胞、巨噬细胞的发育和功能，诱导巨噬细胞分泌多种细胞因子。il-12主要作用于t细胞和nk细胞。具体而言，il-12可以刺激活化型t细胞增殖，促进th0细胞向th1细胞分化；诱导ctl和nk细胞的细胞毒性活性并促进其分泌ifnγ、tnfα、gmcsf等细胞因子；促进nk细胞和il-2rα、tnf受体以及cd56的表达，增强对肿瘤细胞的adcc效应。il-15可由活化的巨噬细胞、表皮细胞和呈现为细胞等多种细胞产生。由于il-15的分子结构与il-2比较相似，可以利用il-2r的β链和γ链与靶细胞结合，发挥与il-2类似的生物学活性，例如刺激t细胞和nk细胞的增殖，诱导b细胞增殖和分化等。il-21由活化的cd4 t细胞、nkt细胞、tfh细胞和th17细胞产生，与il-2、il-15均具有较高的同源性。il-21具有广泛的免疫调节功能，激活它可以增强活化型cd8 t细胞的增殖，增强nk细胞的细胞毒性活性，促进b细胞的增殖与分化。il-17由th17细胞分泌，为促炎性分子，能够抑制调节性t细胞，并且招募和激活中性粒细胞和巨噬细胞。il-18同样为促炎性分子，由t细胞和nk细胞分泌，激活的巨噬细胞也会分泌大量il-18。有报道显示，il-18在固有免疫和过继性免疫过程中发挥重要作用。il-23同样由t细胞和nk细胞分泌，il-23可以促进th17细胞分化。树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞同样表达低水平il-23受体，可被il-23激活。il-33的序列与il-18相似，其通过il-1受体辅助蛋白il-racp与受体st2结合，三者形成异二聚体，激活nf-κb、mapk等信号通路，强烈诱导前炎性因子和趋化因子的产生，从而发挥生物学效应。il-33在多种细胞中表达，包括上皮细胞、纤维母细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。研究表明，il-33可以刺激未成熟的树突状细胞产生treg，促进th1细胞分泌ifn-γ，增加cd69的表达，从而激活nk、nkt细胞和cd8 t细胞，促进抗肿瘤免疫。研究表明，这些白细胞介素单独或组合(例如il-33和il-12、il-7 il-12、il-7 il15等)能够发挥有效的抗肿瘤作用。
[0081]
在一个实施方案中，本发明使用的白细胞介素与seq id no：42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与seq id no：41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75所示的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0082]
外源基因的表达
[0083]
本发明中的外源性基因，例如白细胞介素、ccl3、ccl4、ccl5的表达可以是组成型表达或条件型表达。
[0084]
在一个实施方案中，外源性的白细胞介素、ccl3、ccl4、ccl5的表达是条件型表达。例如，根据需要，可以将本发明的外源基因与诱导型、阻遏型或组织特异性启动子可操作连接，从而在特定的时间或特定的组织、细胞类型内调控引入的外源基因的表达水平。在一个
实施方案中中，启动子是诱导型启动子，即，仅在特定环境条件、发育条件或诱导物存在下启动转录的启动子。此类环境条件包括例如肿瘤酸性微环境、肿瘤低氧微环境等。此类诱导物包括例如西环素、四环素或其类似物，四环素的类似物包括例如金霉素、土霉素、去甲基氯四环素、甲烯土霉素、多西环素和米诺环素。诱导型启动子包括例如lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列等。在另一个实施方案中，启动子是阻遏型启动子，即，在存在对阻遏型启动子具有特异性的阻遏物的情况下，外源基因在细胞中的表达被抑制或不表达。阻遏型启动子包括例如lac阻遏型元件或四环素阻遏型元件。本领域技术人源熟知的诱导型/阻遏型表达系统可用于本发明，包括但不限于tet-on系统、tet-off系统、cre/loxp系统等。
[0085]
在一个实施方案中，白细胞介素、ccl3、ccl4、ccl5可以与定位结构域可操作连接，所述定位结构域可以将本发明的外源性基因定位在特定的细胞位置上表达，例如细胞膜、细胞质中的特定细胞器例如内质网、高尔基体、细胞核等。定位结构域包括但不限于核定位信号、引导肽、跨膜结构域等。在一个实施方案中，本发明的外源性基因白细胞介素、ccl3、ccl4、ccl5与跨膜结构域可操作连接，从而锚定在工程化免疫细胞的表面表达。
[0086]
在一个实施方案中，本发明中的外源性基因，例如白细胞介素、ccl3、ccl4、ccl5蛋白可以是野生型或具有特定性能(例如抵抗蛋白酶水解)的融合蛋白或者突变体。
[0087]
核酸
[0088]
本发明还提供一种核酸分子，其包含(i)编码嵌合受体的核酸序列，和(ii)编码ccl3、ccl4和/或ccl5的核酸序列。
[0089]
在一个实施方案中，核酸分子进一步包含(iii)编码白细胞介素的核酸序列。优选地，所述白细胞介素包括但不限于il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、il-17、il-18、il-23、il33、或其亚基、或其组合、或其亚基的组合，更优选il-7或其亚基。
[0090]
在一个实施方案中，所述嵌合受体是t细胞受体或嵌合抗原受体，优选嵌合抗原受体。嵌合抗原受体的定义如上所述。
[0091]
如本文所用，术语“核酸分子”包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的rna或dna，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括dna(比如dsdna、ssdna、cdna)、rna(比如dsrna、ssrna、mrna、ivtrna)，它们的组合或衍生物(比如pna)。优选地，所述核酸是dna或rna，更优选mrna。
[0092]
核酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，比如在肽核酸(pna)中发现的)。本发明的核酸还可含有一种或多种经修饰的碱基，比如，例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基(比如肌苷)。也可以想到其它修饰，包括化学、酶促或代谢修饰，只要本发明的多链car可以从多核苷酸表达即可。核酸可以以分离的形式提供。在一个实施方案中，核酸也可以包括调节序列，比如转录控制元件(包括启动子、增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号)、核糖体结合位点、内含子等。
[0093]
可以对本发明的核酸序列进行密码子优化以在所需的宿主细胞(如，免疫细胞)中进行最佳表达；或者用于在细菌、酵母菌或昆虫细胞中表达。密码子优化是指将目标序列中存在的在给定物种的高度表达的基因中一般罕见的密码子替换为在这类物种的高度表达的基因中一般常见的密码子，而替换前后的密码子编码相同的氨基酸。因此，最佳密码子的
选择取决于宿主基因组的密码子使用偏好。
[0094]
载体
[0095]
本发明还提供一种载体，包含如本发明所述的核酸。其中，编码嵌合受体的核酸序列、任选的编码il-7的核酸序列、编码ccl3的核酸、ccl4的核酸和/或编码ccl5的核酸序列可以位于一个或多个载体中。
[0096]
如本文所用，术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。
[0097]
载体一般包括靶向载体和表达载体。“靶向载体”是通过例如同源重组或使用特异性靶向位点处序列的杂合重组酶将分离的核酸递送至细胞内部的介质。“表达载体”是用于异源核酸序列(例如编码本发明的嵌合抗原受体多肽的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mrna的翻译的载体。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一个实施方案中，本发明的载体包括但不限于质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(rsv、多瘤病毒和腺相关病毒(aav)等)、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括bac和yac)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的dna序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常还包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，mcs)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾(polya)、3’utr、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。
[0098]
工程化免疫细胞及其制备方法
[0099]
本发明还提供一种工程化免疫细胞，其包含本发明的核酸或载体。换言之，本发明的工程化免疫细胞表达嵌合受体(例如嵌合抗原受体)、ccl3、ccl4和/或ccl5基因，以及任选的白细胞介素，例如il-7。
[0100]
如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导adcc和/或cdc)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞和/或nkt细胞，或者是衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等的免疫细胞。优选地，免疫细胞是t细胞。t细胞可以是任何t细胞，如体外培养的t细胞，例如原代t细胞，或者来自体外培养的t细胞系例如jurkat、supt1等的t细胞，或获得自受试者的t细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。t细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。t细胞也可以被浓缩或纯化。t细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，cd4 /cd8 t细胞、cd4 辅助t细胞(例如th1和th2细胞)、cd8 t细胞(例如，细胞毒性t细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞、αβ-t细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是人t细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如ficoll分离从受试者的血液获得t细胞。在本发明中，免疫细胞被工程化以表达嵌合抗原受体以及外源性的ccl3、ccl4和/或ccl5基因，以及任选的白细胞介素，例如il-7。
[0101]
采用本领域已知的常规方法(如通过转导、转染、转化等)可以将编码嵌合受体(例
如嵌合抗原受体)多肽的核酸序列以及ccl3、ccl4和/或ccl5基因，以及任选的白细胞介素基因，例如il-7引入免疫细胞。“转染”是将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。一个例子是rna转染，即将rna(比如体外转录的rna，ivtrna)引入宿主细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时的孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/dna共沉淀)、显微注射和电穿孔。术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中、也向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其通过细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传材料(核酸分子)而产生。转化可以通过人工手段实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态的状态。对于原核转化，技术可包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。
[0102]
因此，本发明还提供一种制备工程化免疫细胞的方法，包括将以下引入所述免疫细胞：(a)编码嵌合受体的第一核酸序列或其编码的嵌合受体；b)编码ccl3、ccl4和/或ccl5的第二核酸序列或其编码的ccl3、ccl4和/或ccl5蛋白；和任选的(c)编码白细胞介素的第三核酸序列或其编码的白细胞介素。
[0103]
在一个实施方案中，可以将上述组分(a)、(b)和(c)以任何顺序先后依次引入免疫细胞。在另一个实施方案中，可以将上述组分(a)、(b)和(c)同时引入免疫细胞，例如将(a)、(b)和(c)克隆在一个或多个载体中。
[0104]
将核酸或载体引入免疫细胞后，本领域技术人员可以通过常规技术对所得免疫细胞进行扩增和活化。
[0105]
在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞还可以包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：cd52、gr、dck、tcr/cd3基因(例如trac、trbc、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ)、mhc相关基因(hla-a、hla-b、hla-c、b2m、hla-dpa、hla-dq、hla-dra、tap1、tap2、lmp2、lmp7、rfx5、rfxap、rfxank、ciita)和免疫检查点基因，如pd1、lag3、tim3、ctla4、ppp2ca、ppp2cb、ptpn6、ptpn22、pdcd1、havcr2、btla、cd160、tigit、cd96、crtam、tnfrsf10b、tnfrsf10a、casp8、casp10、casp3、casp6、casp7、fadd、fas、tgfbrii、tgfrbri、smad2、smad3、smad4、smad10、ski、skil、tgif1、il10ra、il10rb、hmox2、il6r、il6st、eif2ak4、csk、pag1、sit、foxp3、prdm1、batf、gucy1a2、gucy1a3、gucy1b2和gucy1b3。
[0106]
抑制基因表达或使基因沉默的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以使用反义rna、rna诱饵、rna适体、sirna、shrna/mirna、反式显性阴性蛋白(tnp)、嵌合/融合蛋白、趋化因子配体、抗感染性细胞蛋白、细胞内抗体(sfv)、核苷类似物(nrti)、非核苷类似物(nnrti)、整合酶抑制剂(寡核苷酸、二核苷酸和化学剂)和蛋白酶抑制剂来抑制基因的表达。另外，也可以通过例如大范围核酸酶、锌指核酸酶、tale核酸酶或crispr系统中的cas酶介导dna断裂，从而使基因沉默。
[0107]
试剂盒和药物组合物
[0108]
本发明该提供一种试剂盒，其包含本发明的工程化免疫细胞、核酸分子或载体。
[0109]
在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含说明书。
[0110]
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体作为活性剂，和一种多种药学上可接受的赋型剂。因此，本发明还涵盖所述核酸分子、载体或工程化免疫细胞在制备药物组合物或药物中的用途。
[0111]
如本文所用，术语“药学上可接受的赋型剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容(即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用)的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19th ed.pennsylvania:mack publishing company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。
[0112]
根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。
[0113]
根据本发明的药物组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊、糖浆、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的免疫细胞的药物组合物通常以溶液形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。
[0114]
根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂组合施用。适用于组合的药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠ii(sorfimer sodiumphotofrin ii)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奥利斯他汀e(auristatin e)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素a、dna酶和rna酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗cd3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。此外，本发明的药物组合物也可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。
[0115]
治疗应用
[0116]
本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞或药物组合物。因此，本发明还涵盖所述核酸分子、载体、工程化免疫细胞以及药物组合物在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。
[0117]
在一个实施方案中，直接向受试者施用有效量的本发明的免疫细胞和/或药物组合物。
[0118]
在另一个实施方案中，本发明的治疗方法是离体治疗。具体地，该方法包括以下步骤：(a)提供样品，所述样品包含免疫细胞；(b)在体外将本发明的嵌合受体(例如嵌合抗原受体)以及待表达的外源性基因引入所述免疫细胞，获得经修饰的免疫细胞，(c)向有此需要的受试者施用所述经修饰的免疫细胞。优选地，步骤(a)中提供的免疫细胞选自巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、t细胞、nk细胞和/或nkt细胞；并且所述免疫细胞可以通过本领域已知的常规方法从受试者的样品(特别是血液样品)中获得。然而，也可以使用能够表达本发明的嵌合抗原受体和外源性基因并发挥如本文所述的所需生物效应功能的其它免疫细胞。此外，通常选择的免疫细胞与受试者的免疫系统相容，即优选所述免疫细胞不引发免疫原性响应。例如，可以使用“通用接受体细胞”，即发挥所需生物效应功能的普遍相容的可在体外生长和扩增的淋巴细胞。使用此类细胞将不需要获得和/或提供受试者自身淋巴细胞。步骤(c)的离体引入可以通过经由电穿孔将本文所述的核酸或载体引入免疫细胞或通过用病毒载体感染免疫细胞来实施，所述病毒载体为如前所述的慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。其它可想到的方法包括使用转染试剂(比如脂质体)或瞬时rna转染。
[0119]
在一个实施方案中，所述免疫细胞是自体或同种异体的细胞，优选t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞和/或nkt细胞，更优选t细胞、nk细胞或nkt细胞。
[0120]
如本文所用，术语“自体”是指来源于个体的任何材料稍后将被再引入该相同个体中。
[0121]
如本文所用，术语“同种异体”是指任何材料来源于与引入该材料的个体相同物种的不同动物或不同患者。当在一个或多个基因座处的基因不同时，认为两个或更多个体彼此为同种异体的。在一些情况下，来自同一物种的各个体的同种异体材料在基因上的不同可能足以发生抗原相互作用。
[0122]
如本文所用，术语“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。优选地，所述受试者是人。
[0123]
在一个实施方案中，所述癌症是与配体结合结构域结合的靶标表达有关的癌症。例如，所述癌症包括但不限于：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和cns癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(gbm)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌以及其它癌和肉瘤、以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)、小淋巴细胞性(sl)nhl、中间级/滤泡性nhl、中间级扩散性nhl、高级成免疫细胞性nhl、高级成淋巴细胞性nhl、高级小型非裂化细胞性nhl、大肿块病nhl)、套细胞淋巴瘤、aids相关淋巴瘤、以及waldenstrom巨球蛋白
血症、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)、b细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(cml)、恶性淋巴组织增生疾病、malt淋巴瘤、毛细胞白血病、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、浆母细胞性淋巴瘤、白血病前期、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(ptld)；以及其他与靶标表达有关的疾病。优选地，可以用本发明的工程化免疫细胞或药物组合物治疗的疾病选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌等。
[0124]
在一个实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。
[0125]
在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于i型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。
[0126]
在一个实施方案中，所述方法还进一步包括向所述受试者施用一种或多种额外的化疗剂、生物制剂、药物或治疗。在该实施方案中，化疗剂、生物制剂、药物或治疗选自放射疗法、手术、抗体试剂和/或小分子和它们的任意组合。
[0127]
下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式
[0128]
实施例1构建小鼠胰腺癌细胞系panc02-mcd19
[0129]
1.制备plv-mcd19质粒
[0130]
以小鼠脾脏总mrna为模板，通过反转录pcr得到小鼠脾脏总cdna序列后，再通过pcr获得含有xbai及sali酶切位点的小鼠mcd19序列。然后，将mcd19基因重组至plvx载体(ppl，cat no.:ppl00157-4a)中，得到plv-mcd19质粒。
[0131]
2.慢病毒包装
[0132]
在t175培养瓶中，以30
×
106个细胞/瓶的密度将293t细胞接种于30ml含有10％胎牛血清的dmem培养基中，于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。
[0133]
在无菌管中加入3ml opti-mem(gibco，货号31985-070)、34μg plv-mcd19质粒、8.5μg pmd2.g载体(addgene，货号12259)和17μg pspax2载体(addgene，货号12260)。然后加入120μl x-treme gene hp dna转染试剂(roche，货号06366236001)，立即混匀，室温孵育15min。然后将该质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到预先准备好的293t细胞的培养瓶中，于37℃，5％co2条件下培养过夜。在转染后24小时和48小时收集培养物，合并后超速离心(25000g，4℃，2.5h)，获得浓缩的plv-mcd19慢病毒，将其保存于-80℃。
[0134]
3.筛选panc02-mcd19细胞系
[0135]
在6孔细胞培养板的每个孔中，加入含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基(gibco，货号c12430500bt)、1
×
106个小鼠胰腺癌细胞panc02(来自中国药科大学实验室馈赠)和200μl plv-mcd19慢病毒，于37℃、5％co2条件下孵育48h。然后用0.25％胰酶将细胞消化成
单细胞悬液，并将细胞稀释后转移至96孔板中继续培养，直至出现单克隆细胞。挑选单克隆细胞，再次用0.25％胰酶消化成单细胞，并用200μl opti-mem培养基重悬细胞。用apc anti-mouse cd19抗体(biolegend，货号115512)，通过流式细胞术检测感染效率，并筛选出cd19阳性克隆。将阳性克隆传代3-4次后，再用流式细胞术检测cd19表达水平。未经病毒感染的panc02细胞用作对照。
[0136]
结果如图1所示。最后筛选的panc02-mcd19细胞系中，cd19表达率为100％。
[0137]
实施例2.制备car-t细胞
[0138]
1.构建逆转录病毒质粒
[0139]
人工合成依次连接的cd19-scfv(seq id no：26)、cd8a铰链区及跨膜区(seq id no：35和29)、41bb胞内域(seq id no：31)和cd3ζ胞内域(seq id no：33)的编码序列片段，并在两端加入xhoi/ecori酶切位点。将片段克隆入mscv载体，获得mscv-mcd19-car质粒。
[0140]
人工合成依次连接t2a(seq id no：37)和il-7(seq id no：43)的编码序列片段，并在两端加入ecori/sali酶切位点。将片段克隆入mscv-mcd19-car载体，获得mscv-mcd19-car-il-7质粒。
[0141]
人工合成依次连接t2a(seq id no：37)和ccl4(seq id no：83)的编码序列片段，并在两端加入ecori/sali酶切位点。将片段克隆入mscv-mcd19-car载体，获得mscv-mcd19-car-ccl4质粒。
[0142]
人工合成依次连接t2a(seq id no：37)和ccl5(seq id no：87)的编码序列片段，并在两端加入ecori/sali酶切位点。将片段克隆入mscv-mcd19-car载体，获得mscv-mcd19-car-ccl5质粒。
[0143]
2.制备逆转录病毒
[0144]
在t175培养瓶中，以30
×
106个细胞/瓶的密度将293t细胞接种于30ml含有10％胎牛血清的dmem培养基中，于37℃、5％co2培养箱中培养过夜，用于病毒包装。
[0145]
在无菌管中加入3ml opti-mem(gibco，货号31985-070)、45μg逆转录病毒质粒(mscv-mcd19-car质粒、mscv-mcd19-car-il-7质粒、mscv-mcd19-car-ccl4质粒或mscv-mcd19-car-ccl5质粒)和15μg包装载体pcl-eco(上海禾午生物科技有限公司，货号p3029)。然后加入120μl x-treme gene hp dna转染试剂(roche，货号06366236001)，立即混匀，室温孵育15min。然后将该质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到预先准备好的293t细胞的培养瓶中，于37℃，5％co2条件下培养过夜。在转染后72小时收集培养物，离心(2000g，4℃，10分钟)，获得逆转录病毒上清液。
[0146]
3.制备car-t细胞
[0147]
从小鼠脾脏分离t淋巴细胞，并用dynabeads cd3/cd28 cts
tm
(gibco,货号40203d)激活t细胞，然后在37℃和5％co2下培养1天。
[0148]
以每孔3
×
106个细胞/ml的密度将激活的t细胞接种至预先用retronectin包被过夜的24孔板中，然后分别加入500μl完全培养基(nt，对照)、mscv-mcd19-car病毒、mscv-mcd19-car-ccl4病毒、mscv-mcd19-car-ccl5病毒、mscv-mcd19-car-il-7病毒 mscv-mcd19-car-ccl4病毒，或mscv-mcd19-car-il-7病毒 mscv-mcd19-car-ccl5病毒，并补充完全培养基至2ml。
[0149]
将24孔板放于离心机进行离心感染，于32℃，2000g离心2h。然后，立刻将24孔板放
置于37℃、co2培养箱静置培养。第二天更换新鲜培养基，并调整细胞密度为1
×
106个细胞/ml。感染三天后，收集细胞用于后续分析。收集的细胞即为nt细胞、mcd19-car细胞、mcd19-car ccl4细胞、mcd19-car ccl5细胞、mcd19-car il7 ccl4细胞、和mcd19-car il7 ccl5细胞。
[0150]
实施例3.检测car-t细胞的表达
[0151]
1.细胞表面car的表达水平
[0152]
取出实施例2制备的2
×
105个car-t细胞，用goat anti-rat igg(h&l)biotin(biovision,货号6910-250)作为一抗，apc streptavidin(bd pharmingen，货号554067)作为二抗，通过流式细胞术检测car t细胞上的car的表达水平，结果如图2所示。
[0153]
可以看出，与对照相比，mcd19-car细胞、mcd19-car ccl4细胞、mcd19-car ccl5细胞、mcd19-car il7 ccl4细胞、和mcd19-car il7 ccl5细胞中的car阳性效率均为60％左右，表明这些细胞均可有效表达car。
[0154]
2.il-7的表达水平
[0155]
收集实施例2制备的car-t细胞的上清液，根据制造商的建议，用mouse il-7 duoset elisa kit试剂盒(r&d systems,货号dy407)检测细胞中的il-7分泌水平，结果如图3所示。
[0156]
可以看出，用mscv-mcd19-car-il-7病毒转染的两种car t细胞均可有效表达il-7。
[0157]
3.ccl4的表达水平
[0158]
收集实施例2制备的car-t细胞的上清液，根据制造商的建议，用mouse ccl4 duoset elisa kit试剂盒(r&d systems,货号dy451)检测细胞中的ccl4分泌水平，结果如图4所示。
[0159]
可以看出，用mscv-mcd19-car-ccl4病毒转染的两种car t细胞可有效表达ccl4。
[0160]
4.ccl5的表达水平
[0161]
收集实施例2制备的car-t细胞的上清液，根据制造商的建议，用mouse ccl5 duoset elisa kit试剂盒(r&d systems,货号dy478)检测细胞中的ccl5分泌水平，结果如图5所示。
[0162]
可以看出，用mscv-mcd19-car-ccl5病毒转染的两种car t细胞可有效表达ccl5。
[0163]
实施例4.检测car-t细胞的ifn-γ分泌水平
[0164]
在96孔圆底板中以2
×
105个细胞/100μl的浓度分别加入nt细胞、mcd19-car细胞、mcd19-car il-7细胞、mcd19-car ccl4细胞、mcd19-car ccl5细胞、mcd19-car il7 ccl4细胞、和mcd19-car il7 ccl5细胞。然后在各孔中以1
×
104个细胞/100μl的浓度分别加入靶标panc02-mcd19细胞或非靶标panc02细胞。在37℃培养24h后，收集培养物上清液。根据制造商的建议，用mouse ifn-gamma duoset elisa试剂盒(r&d，货号dy485)检测培养物上清液中ifn-γ的表达水平。
[0165]
检测结果如图6所示。可以看出，在非靶细胞panc02中均没有检测到ifn-γ的释放，且nt细胞不表达ifn-γ，表明本实施例中的car t细胞的杀伤都是特异性的。并且，在杀伤靶细胞时，与仅表达car的t细胞相比，额外表达单独的ccl4或ccl5降低了ifn-γ的释放水平，而表达il-7 ccl4或il-7 ccl5则增加了ifn-γ的释放水平。
[0166]
实施例5.car-t细胞的肿瘤抑制效果验证
[0167]
在健康c57bl/6小鼠的左前肢腋下部位，经皮下接种5
×
105个实施例1制备的panc02-mcd19胰腺癌细胞。
[0168]
将接种了胰腺癌细胞的小鼠随机分为6组，每组5只。待肿瘤体积生长至100mm3时，向每只小鼠经尾静脉注射1
×
106个实施例2制备的nt细胞、mcd19-car细胞、mcd19-car ccl4细胞、mcd19-car ccl5细胞、mcd19-car il7 ccl4细胞和mcd19-car il7 ccl5细胞。
[0169]
监测小鼠的体重和肿瘤体积变化，直至实验结束。
[0170]
小鼠的体重变化如图7所示。可以看出，施用car-t细胞后，各组小鼠的体重与对照组相比没有显著差异，且在观察周期中，当小鼠肿瘤未超过1500mm3时，小鼠行动活泼，毛色正常，这表明，施用car-t细胞不会对小鼠有明显的毒副反应。
[0171]
小鼠的肿瘤体积变化如图8所示。可以看出，与nt细胞和常规car-t细胞相比，仅表达ccl4或ccl5的car-t细胞能增强抗肿瘤效果，表明单独的ccl4或ccl5可与car-t细胞产生协同作用。此外，发明人还出乎意料地发现，进一步表达il-7可以显著增加ccl4对car-t细胞的促进作用，从而更显著地抑制肿瘤生长。与此相比，il-7对于ccl5的促进作用低于对ccl4的作用，但il-7 ccl5 car的组合对肿瘤的抑制效果仍然略微优于单独的car。
[0172]
以上结果表明，共表达ccl4、ccl5或其与il-7的组合能够有效增强表达car的工程化免疫细胞对靶标胰腺癌细胞的抑制效果。
[0173]
实施例6.表达ccl3的car-t细胞的肿瘤抑制效果验证
[0174]
根据实施例2所述的方法制备表达ccl3的car-t细胞，其中将t2a(seq id no：37)和ccl3(seq id no：79)的编码序列片段克隆入mscv-mcd19-car载体，获得mscv-mcd19-car-ccl3质粒并将其包装为逆转录病毒。用该病毒转染激活的t细胞，获得mcd19-car ccl3细胞。用mscv-mcd19-car-ccl3病毒和mscv-mcd19-car-il-7病毒同时转染激活的t细胞，获得mcd19-car il7 ccl3细胞。
[0175]
根据实施例5所述的方法验证car-t细胞对肿瘤的体内抑制效果。图9示出了小鼠的体重变化，表明施用car-t细胞不会对小鼠有明显的毒副反应。图10示出了小鼠的肿瘤体积变化。可以看出，单独的ccl3可与car-t细胞产生协同作用，而进一步表达il7则可以显著增加ccl3对car-t细胞的促进作用，从而更显著地抑制肿瘤生长。
[0176]
需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。