一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法与流程

1.本发明涉及基因组技术领域，具体涉及一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法。


背景技术：

2.在传统的基因分型，转基因检测，品系检测试验中，人们比较惯用的方法是，采用手工抽提或是购买一般的基因组脱氧核糖核酸(dna)提取试剂盒进行，但是不管是采用手工抽提还是购买试剂盒进行提取，整个提取过程都要取一定量的材料，经过液氮研磨，裂解液裂解，孵育，离心，有机抽提，漂洗晾干溶解这样的过程，最终得到基因组脱氧核糖核酸。
3.而往往这些基因组脱氧核糖核酸仅仅是用作基因鉴定的聚合酶链式反应模板，通过这种操作得到的基因组脱氧核糖核酸纯度和得率都是高的，但是即使不考虑使用液氮研磨时可能冻伤操作者的风险，整个提取过程由于步骤繁琐使用仪器众多，等待时间很长。
4.例如公告号cn101792756b的发明专利中涉及一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法，通过在生物组织中加入裂解液，再加入蛋白酶k进行孵育，在通过离心分离的方法提取脱氧核糖核酸，但是此方法提取到的脱氧核糖核酸容易存有一定小分子的杂质，难以直接应用于检测，且整个提取过程由于步骤繁琐使用仪器众多，等待时间很长。


技术实现要素：

5.本发明要解决的问题是提供一种效果较好、刺激性较弱、产率较好的提取基因组脱氧核糖核酸的方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法，包括以下步骤：
7.步骤一：将生物组织进行研磨、混匀，得到第一浑浊液，采用缓冲液清洗第一浑浊液，离心分离，倒弃上清液，得到细胞沉淀；
8.步骤二：向步骤一中的细胞沉淀中加入裂解液，进行混匀、裂解、孵育，直至溶液无团块，得到悬浮液；
9.步骤三：向步骤二中的悬浮液中加入前处理后的磁性微球，混匀，振摇吸附，在磁场上分离磁性微球并用吸管取出上清液，采用乙醇洗涤磁性微球，得到吸附微球；
10.步骤四：向步骤三中的吸附微球中加入te缓冲液进行脱附，磁场下分离磁性微球获得含有脱氧核糖核酸的洗脱液。
11.进一步的，所述裂解液包括以下组分：体积分数为1
‑
4％的chaps、2
‑
4mol/l的edta、2
‑
4mol/l的盐酸胍或硫氰酸胍、和6
‑
10mol/l尿素，chaps能够破坏蛋白分子的空间结构，并将蛋白酶解成小片段多肽，尿素在溶液中能够与多肽竞争氢键，同时能够破坏蛋白质的二级结构，增大蛋白分子非极性侧链在水中的溶解度，降低三维结构的疏水相互作用，导致其蛋白分子构象的改变，盐酸胍或硫氰酸胍类物质能够诱导蛋白质发生去折叠的作用，增加蛋白的溶解度，edta作为络合剂和洗涤剂能够破坏细胞膜，裂解液能够溶解细胞壁上的蛋白质，形成细胞壁空穴，胞膜也会从细胞壁孔结构进入的裂解液破碎，且能够将与dna
结合的蛋白进行分解，使dna分子暴露出来，溶解在裂解液中。
12.进一步的，所述孵育条件为55
‑
65℃下孵育5
‑
30min，80
‑
95℃加热3
‑
10min。
13.进一步的，所述生物组织包括植物组织、动物组织或细菌的一种。
14.进一步的，所述磁性微球为二氧化硅、壳聚糖或琼脂糖包覆四氧化三铁制成。
15.进一步的，所述磁性微球的表面进行氨基化修饰和羧基化修饰，通过表面进行改性的磁性微球能够吸附dna，具有磁响应性强比表面积大的特点，磁性微球的表面修饰方法为现有技术，可通过表面聚合的方法使磁性微球表面引入具有羧基和氨基的微团，从而使其能够通过羧基与氨基进行特异性吸附。
16.进一步的，所述磁性微球的前处理包括以下步骤：将磁性微球置于离心管中，用缓冲液洗涤、摇匀，将离心管至于磁分离架上分离，并用吸管除去悬浮液。
17.与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：
18.本发明提供的提取基因组脱氧核糖核酸的方法，能够安全快速的获得dna片段，裂解液能够溶解细胞壁上的蛋白质，形成细胞壁空穴，胞膜也会从细胞壁孔结构进入的裂解液破碎，且能够将与dna结合的蛋白进行分解，使dna分子暴露出来，溶解在裂解液中，通过磁分离技术也能将dna吸附到dna表面，且能够通过外加磁场将其从样品中分离出来，不同于传统的方法，本发明方法的操作步骤简单，且不涉及有机抽提，无需使用对人体有害的有机物质，能够节省时间和资源，并获得高纯度的dna片段，从而具有比较好的效果和产率。
具体实施方式
19.为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述。
20.实施例1：
21.步骤一：将植物组织进行研磨、涡旋混匀，得到第一浑浊液，采用缓冲液清洗第一浑浊液，离心分离，倒弃上清液，得到细胞沉淀；
22.步骤二：向步骤一中的细胞沉淀中加入包括体积分数1％chaps、2mol/l的edta、2mol/l的盐酸胍和6mol/l尿素的裂解液，进行混匀，55℃下孵育5min，80℃加热3min，直至溶液无团块，得到悬浮液；
23.步骤三：二氧化硅包覆四氧化三铁制成的磁性微球表面进行氨基化修饰和羧基化修饰，然后置于离心管中，用缓冲液洗涤、摇匀，将离心管至于磁分离架上分离，并用吸管除去悬浮液，向步骤二中的悬浮液中加入前处理后的磁性微球，涡旋混匀，振摇吸附10min，在磁场上分离磁性微球并用吸管取出上清液，采用乙醇洗涤磁性微球，得到吸附微球；
24.步骤四：向步骤三中的吸附微球中加入与裂解液相同体积的te缓冲液进行脱附，磁场下分离磁性微球获得含有脱氧核糖核酸的洗脱液。
25.实施例2：
26.步骤一：将动物组织进行研磨、涡旋混匀，得到第一浑浊液，采用缓冲液清洗第一浑浊液，离心分离，倒弃上清液，得到细胞沉淀；
27.步骤二：向步骤一中的细胞沉淀中加入包括体积分数2％chaps、3mol/l的edta、3mol/l的硫氰酸胍、和8mol/l尿素的裂解液，进行混匀，60℃下孵育22min，90℃加热6min，直至溶液无团块，得到悬浮液；
28.步骤三
‑
步骤四与所述实施例1相同，不同在于磁性微球为壳聚糖包覆四氧化三铁
制成。
29.实施例3：
30.步骤一：将细菌进行研磨、涡旋混匀，得到第一浑浊液，采用缓冲液清洗第一浑浊液，离心分离，倒弃上清液，得到细胞沉淀；
31.步骤二：向步骤一中的细胞沉淀中加入包括体积分数4％chaps、4mol/l的edta、4mol/l的盐酸胍、和10mol/l尿素的裂解液，进行混匀，65℃下孵育30min，95℃加热10min，直至溶液无团块，得到悬浮液；
32.步骤三
‑
步骤四与所述实施例1相同，不同在于磁性微球为琼脂糖包覆四氧化三铁制成。
33.实验例1：
34.该实验例考察了裂解液各成分浓度对的dna产率的影响。
35.空白对照组a：采用的是pbs缓冲液；
36.实验组a、实验组b、实验组c、实验组d、实验组e:按照实施例2的方法提取基因组脱氧核糖核酸，所不同的是chaps的体积分数分别为0％、1％、3％、4％、5％；
37.实验组f、实验组g、实验组h、实验组i：按照实施例2的方法提取基因组脱氧核糖核酸，所不同的是edta的浓度分别为0、2、4、5mol/l；
38.实验组j、实验组k、实验组l、实验组m：按照实施例2的方法提取基因组脱氧核糖核酸，所不同的是盐酸胍的浓度分别为0、2、4、5mol/l；
39.实验组n、实验组o、实验组p、实验组q：按照实施例2的方法提取基因组脱氧核糖核酸，所不同的是尿素的浓度分别为0、6、10、12mol/l。
40.采用紫外分光光度计定量检测洗脱液中dna的浓度，并计算其产率，结果见表1。
41.表1.dna产率的测定(单位：mg/g)
42.组别chaps(％)edta(mol/l)盐酸胍(mol/l)尿素(mol/l)产率(mg/g)空白对照组
‑‑‑‑‑‑‑‑
0.0014实验组a03380.1257实验组b13380.1452实验组c33380.1656实验组d43380.1831实验组e53380.1826实验组f30380.1211实验组g32380.1723实验组h34380.1845实验组i35380.1840实验组j33080.1171实验组k33280.1693实验组l33480.1822实验组m33580.1823实验组n33300.1261实验组o33360.1623
实验组p333100.1831实验组q333120.1833
43.通过dna产量的测定，能够看出实验组a
‑
e中dna的产量随着chaps的体积分数的增加而增加，当chaps的体积分数增加至4％时，达到峰值，当裂解液中不含有chaps时，dna的产率较低；
44.实验组f
‑
i中dna的产量随着edta的浓度的增加而增加，当edta的浓度增加至4mol/l时，达到峰值，当edta的浓度增加至5mol/l时，与4mol/l时差别不大，当裂解液中不含有edta时，dna的产率较低；
45.实验组j
‑
m：中dna的产量随着盐酸胍的浓度的增加而增加，当盐酸胍的浓度增加至4mol/l时，达到峰值，当盐酸胍的浓度增加至5mol/l时，与4mol/l时差别不大，当裂解液中不含有盐酸胍时，dna的产率较低；
46.实验组n
‑
q：中dna的产量随着尿素的浓度的增加而增加，当尿素的浓度增加至10mol/l时，达到峰值，当尿素的浓度增加至12mol/l时，与10mol/l时差别不大，当裂解液中不含有尿素时，dna的产率较低。
47.这是由于chaps能够破坏蛋白分子的空间结构，并将蛋白酶解成小片段多肽，尿素在溶液中能够与多肽竞争氢键，同时能够破坏蛋白质的二级结构，增大蛋白分子非极性侧链在水中的溶解度，降低三维结构的疏水相互作用，导致其蛋白分子构象的改变，盐酸胍或硫氰酸胍类物质能够诱导蛋白质发生去折叠的作用，增加蛋白的溶解度，edta作为络合剂和洗涤剂能够破坏细胞膜，裂解液能够溶解细胞壁上的蛋白质，形成细胞壁空穴，胞膜也会从细胞壁孔结构进入的裂解液破碎，且能够将与dna结合的蛋白进行分解，使dna分子暴露出来，溶解在裂解液中。
48.实验例2：
49.该实验例考察了磁性微球与传统抽提对dna产率的比较。
50.对照组a
‑
c：采用的是传统抽提方法提取的dna，由于传统的抽提方法为现有技术，则不再赘述，所不同的是生物组织分别采用的是杨树叶片、小牛胸腺和酿酒酵母；
51.实验组r、实验组s、实验组t：按照实施例2的方法提取基因组脱氧核糖核酸，所不同的是生物组织分别采用的是杨树叶片、小牛胸腺和酿酒酵母；
52.实验组u、实验组v、实验组w：按照实施例2的方法提取基因组脱氧核糖核酸，所不同的是磁性微球分别采用的是二氧化硅微球、壳聚糖微球和琼脂糖微球。
53.采用紫外分光光度计定量检测洗脱液中dna的浓度，并计算其产率，结果见表2。
54.表2.dna产率的测定(单位：mg/g)
55.组别生物组织磁性微球产率(mg/g)对照组a杨树叶片
‑‑
0.1591对照组b小牛胸腺
‑‑
0.1610对照组c酿酒酵母
‑‑
0.1588实验组r杨树叶片壳聚糖微球0.1626实验组s小牛胸腺壳聚糖微球0.1674实验组t酿酒酵母壳聚糖微球0.1659实验组u小牛胸腺二氧化硅微球0.1677
实验组v小牛胸腺琼脂糖微球0.1667
56.通过dna产量的测定，能够看出实验组r
‑
t与对照组a
‑
c中的仅有提取方式的差别，而dna的产量相差不大，能够看出通过表面进行改性的磁性微球能够吸附dna，且效果略好于传统的抽提的方法，而小牛胸腺的动物材料的效果会略好于植物和细菌，这是由于动物组织不具备细胞壁，而实验组t
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u中能够看出，磁性微球的种类对dna产量几乎没有差别；
57.本发明提供的提取基因组脱氧核糖核酸的方法，能够安全快速的获得dna片段，裂解液能够溶解细胞壁上的蛋白质，形成细胞壁空穴，胞膜也会从细胞壁孔结构进入的裂解液破碎，且能够将与dna结合的蛋白进行分解，使dna分子暴露出来，溶解在裂解液中，通过磁分离技术也能将dna吸附到dna表面，且能够通过外加磁场将其从样品中分离出来，不同于传统的方法，本发明方法的操作步骤简单，且不涉及有机抽提，无需使用对人体有害的有机物质，能够节省时间和资源，并获得高纯度的dna片段，从而具有比较好的效果和产率。
58.以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。