一种抗Cry3Bb蛋白单域重链抗体及其应用的制作方法

一种抗cry3bb蛋白单域重链抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程抗体和食品生物技术领域，具体涉及一种抗cry3bb蛋白单域重链抗体及其应用。


背景技术：

2.cry蛋白(crystal protein)是一类杀虫蛋白，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫具有高效毒杀作用，被广泛用作生物杀虫剂和转基因杀虫成分，常见的cry蛋白包括cry1ab、cry1ac、cry1c、cry2a和cry3bb等。不同种类的cry蛋白杀虫谱不同，cry3bb主要对鞘翅目昆虫如马铃薯甲虫有毒力。近年来，转基因农作物的种植面积呈快速增长趋势，但转基因农作物的安全性并未得到广泛认同，转基因农作物可能对生态环境和人体健康造成潜在危害。为安全起见，许多国家已经对转基因产品实行了标签制度。因此，对转基因农作物及其产品中的cry蛋白进行有效监控和快速检测是十分必要的。
3.cry蛋白的检测方法主要是基于核酸和蛋白质水平的分析，包括pcr方法和elisa方法。pcr方法具有灵敏度高、准确性高等特点，但不能对表达的cry蛋白进行定量检测，且需要专业的仪器设备和操作人员。而elisa方法具有简便、快速、低耗等特点，适合于农作物和环境中cry蛋白的现场快速定性和定量检测。其中，高特异性、高亲和性抗体的制备是elisa方法建立的前提和关键。
4.单域重链抗体(vhh)，源于驼科动物(骆驼、羊驼等)体内缺失轻链的重链抗体，是目前已知最小的功能性抗体片段，只含有3个互补决定区(complementarity
‑
determining region,cdr)，却具有与普通抗体相同的抗体功能。与普通抗体相比，单域重链抗体的cdr3更长，可以形成凸环结构，能够伸入目标蛋白的凹槽、裂缝等普通抗体难以达到的表位。同时，单域重链抗体还具有高亲和力、高水溶性、易表达等特点。因此，单域重链抗体是一种优良的抗体材料；然而到目前为止，暂未见抗cry3bb蛋白单域重链抗体的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是通过噬菌体展示单域重链抗体库筛选，获得针对cry3bb蛋白的单域重链抗体。
6.本发明提供了一种抗cry3bb蛋白单域重链抗体,其氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明所提及的单域重链抗体包括四个框架区fr和三个互补决定区cdr。其中，框架区(fr1
‑
fr4)的氨基酸序列分别如seq id no.2、seq id no.4、seq id no.6和seq id no.8所示；互补决定区(cdr1
‑
cdr3)的氨基酸序列分别如seq id no.3、seq id no.5和seq id no.7所示。
8.本发明同时提供了编码氨基酸序列如seq id no.1所示抗cry3bb单域重链抗体的核苷酸，其序列如seq id no.9所示。
9.本发明还提供了一种重组表达载体，其含有如seq id no.9所示的核苷酸序列。
10.本发明还提供了一种重组工程菌，其含有所述重组表达载体。
11.本发明还提供了氨基酸序列如seq id no.1所示的单域重链抗体在cry3bb蛋白检测中的应用。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
13.本发明制备的单域重链抗体可替代传统抗体，应用于cry3bb蛋白的免疫学检测分析，该单域重链抗体具有结合活性性高、稳定性高、易规模化制备等特点。
附图说明
14.图1单域重链抗体的氨基酸序列示意图；
15.图2单域重链抗体与cry3bb蛋白的分子对接示意图；
16.图3单域重链抗体结合活性测定结果示意图。
具体实施方式
17.下面结合具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
18.实施例1抗cry3bb单域重链抗体的淘选
19.将cry3bb蛋白用10mm pbs(ph 7.4)稀释至100μg/ml，加入酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜；用pbst(10mm pbs，ph 7.4，含0.1％tween
‑
20)洗涤6次，加入300μl的3％bsa
‑
pbs(3％ova
‑
pbs)，37℃封闭2h；pbst洗板6次，加入100μl的噬菌体展示天然单域重链抗体库(滴度约2.0
×
10
11
pfu)，37℃孵育1h；pbst洗涤6次，加入100μl的glycine
‑
hcl(0.2m,ph 2.2)洗脱8min后，立即加入15μl tris
‑
hcl(1m，ph 9.0)中和，取10μl洗脱噬菌体测滴度，其余的感染处于对数生长期的大肠杆菌tg1进行扩增，扩增噬菌体经peg/nacl纯化后用于下一轮的淘选。
20.随后重复进行3轮淘选，淘选步骤与第一轮基本相同，包被的cry3bb蛋白的浓度分别减少为50μg/ml，25μg/ml和10μg/ml，pbst的洗涤次数分别增加为9次，12次和15次。
21.实施例2抗cry3bb单域重链抗体阳性噬菌体克隆的鉴定
22.从上述实施例1中第三轮和第四轮噬菌体滴度平板上随机挑取48个克隆，接种于2
×
yt
‑
a培养基，37℃振荡培养过夜；按1％接种量(v/v)接种于1ml 2
×
yt
‑
ag培养基，37℃振荡培养至od600约为0.5；加入辅助噬菌体m13k07，37℃振荡培养45min；将培养物3000rpm离心10min后，加入1ml 2
×
yt
‑
ak培养基重悬菌体，30℃200rpm振荡培养4
‑
5h；将培养物于4℃下10000rpm离心10min，收集噬菌体上清，采用phage
‑
elisa进行阳性噬菌体克隆的鉴定。
23.具体方法为：将cry3bb蛋白用10mm pbs稀释至5μg/ml，加入酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜；pbst洗板3次，加入300μl的5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；pbst洗板3次，加入100μl噬菌体，37℃孵育1h；pbst洗板6次，加入100μl的hrp标记m13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；pbst洗板6次，加入100μl tmb底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值。当样品孔od值大于对照孔od值3倍以上时，初步判定为阳性克隆。将阳性噬菌体克隆送生物公司进行测序，获得核苷酸序列如seq id no.9所示。根据核苷酸测序结果及密码子表可翻译获得cry3bb单域重链抗体的氨基酸序列如图1所示。
24.实施例3抗cry3bb单域重链抗体的同源建模及与cry3bb蛋白的分子对接
25.将实施例2中的抗cry3bb单域重链抗体氨基酸序列提交swiss
‑
model网站(网址为http://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模，获得其三维结构模型；从ncbi数据库下载cry3bb蛋白的三维结构模型；随后利用zdock网站(网址为http://zdock.umassmed.edu/)进行两个模型的分子对接，获得抗cry3bb单域重链抗体与cry3bb蛋白的复合物结构模型。三维结构模型采用pymol软件进行分析，抗cry3bb单域重链抗体(vhh)与cry3bb蛋白分子对接分析结果见图2,结果初步表明抗cry3bb单域重链抗体能够与cry3bb蛋白结合。
26.实施例4噬菌体展示单域重链抗体的扩增及活性鉴定
27.(1)噬菌体展示单域重链抗体的扩增
28.将实施例2获得的阳性噬菌体克隆细胞接种于50ml 2
×
yt
‑
ag培养基中，37℃振荡培养至od600约为0.5；加入辅助噬菌体m13k07，37℃振荡培养45min；将培养物10000rpm离心10min后，加入50ml 2
×
yt
‑
ak培养基重悬菌体，30℃200rpm振荡培养过夜；将培养物于4℃下10000rpm离心10min，收集上清，加入1/6体积的peg/nacl，混匀后4℃静置4h；4℃下10000rpm离心10min，弃上清，将沉淀重悬于0.5ml pbs(10mm，ph 7.4)中，再加入0.5ml甘油，即得到扩增后的噬菌体展示单域重链抗体，
‑
80℃保存备用。
29.(2)噬菌体展示单域重链抗体结合活性的鉴定
30.将cry3bb蛋白稀释至1μg/ml，加入酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜；pbst洗板3次，加入300μl的5％bsa，37℃封闭2h；pbst洗板3次，加入100μl倍比稀释的上述噬菌体展示单域重链抗体(1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000)，37℃孵育1h；pbst洗板6次，加入100μl的hrp标记m13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；pbst洗板6次，加入100μltmb底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值。选择吸收值在1.0
‑
1.5之间的稀释倍数为扩增噬菌体展示单域重链抗体的最适稀释倍数。
31.将cry3bb蛋白倍比稀释(1000ng/ml、500g/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml)后加入酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜；pbst洗板3次，加入300μl的5％bsa，37℃封闭2h；pbst洗板3次，加入100μl上述最适稀释倍数的噬菌体展示单域重链抗体，37℃孵育1h；pbst洗板6次，加入100μl的hrp标记m13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；pbst洗板6次，加入100μl tmb底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值，结果如图3所示。从图中可见，噬菌体展示单域重链抗体能够结合cry3bb蛋白，活性测定曲线在15.63ng/ml
‑
1000ng/ml范围内具有较好的线性。
32.实施例5抗cry3bb单域重链抗体在大肠杆菌中的表达及纯化
33.将实施例2中阳性噬菌体克隆携带的单域重链抗体基因亚克隆至表达载体pet
‑
25b中，再将重组表达载体转化至肠杆菌rosetta感受态细胞中，将细胞培养后涂布于lb
‑
a平板，37℃培养过夜；从平板上挑取单菌落接种于5ml lb培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50ml的lb
‑
ag培养基中，37℃，200rpm振荡培养；当培养物菌体浓度od600达到0.5时，向培养物中加入终浓度为0.1mm的iptg，30℃，200rpm振荡培养过夜；将培养物于4℃，8000rpm离心15min收集菌体沉淀；重悬细胞于5ml预冷的pbs溶液，超声破碎10min后，8000rpm离心15min取上清，即得单域重链抗体粗提液；将上清经镍柱进行纯化，得到纯度90％以上的单域重链抗体蛋白。
34.实施例6单域重链抗体在cry3bb免疫检测中的应用
35.(1)标准曲线的建立
36.将抗cry3bb单克隆抗体稀释至1μg/ml，4℃包被过夜；pbst洗涤3次，加入300μl的5％bsa，37℃封闭2h；pbst洗板3次，加入100μl不同浓度的cry3bb蛋白标准品，37℃孵育1h；pbst洗板6次，加入实施例3获得的噬菌体展示单域重链抗体/实施例4获得的单域重链抗体蛋白，37℃孵育1h；pbst洗板6次，加入hrp标记的抗m13二抗/抗his标签二抗，37℃孵育1h；pbst洗板6次，加入100μl tmb底物溶液，显色15min，在450nm波长处读取吸收值，建立elisa标准曲线。
37.(2)样品的检测
38.称取1g待检样品(市售玉米)，粉碎后加入5ml pbs溶液，充分振荡1h；10000rpm离心10min后，取上清液用滤纸进行过滤，取1ml滤液与1ml pbs混匀，即为样品提取液。用样品提取液替代上述cry3bb蛋白标准品，按照标准曲线方法进行操作，根据标准曲线推算出样品中cry3bb的含量。