一种基于mSNP技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法与流程

一种基于msnp技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法
技术领域
1.本发明属于种子纯度检测领域，具体涉及一种基于msnp技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法。


背景技术：

2.西瓜是葫芦科葫芦属一年生草本植物，栽培历史悠久，分布地域广，是世界十大水果之一。我国西瓜的栽培面积和产量均居世界首位。自20世纪80年代西瓜杂交一代在我国推广，杂交种为西瓜的高产、稳产、优质做出巨大贡献，得到广泛的应用。由于国内种子经营渠道多、种子管理法制不健全，使得低纯度的种子在市场上时有销售。随着种植面积的增加，杂交种纯度问题越来越严重，给农业生产造成巨大的损失。
3.种子纯度是种子质量的核心指标，是保证西瓜正常生产的重要因素。种子纯度定义为本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率。目前市场上广泛用的种子为二倍体/三倍体杂交种，根据国家制定的《农作物种子质量标准》(gb16715.1
‑
2010)的规定，西瓜杂交种大田用种的纯度不低于95％。所以西瓜种子在上市之前进行纯度鉴定是质量控制的要求。
4.西瓜杂交种纯度鉴定最直接可靠的方法是田间种植鉴定，但这种方法易受环境的影响，鉴定周期长，且成本较高。西瓜杂交种大量上市一般在11月底，如果大棚种植西瓜想在5月上市，来不及种植鉴定。第二种方法是生化鉴定技术，包括同工酶和蛋白质电泳图谱鉴定。蛋白质电泳方法成熟、结果准确，但是由于西瓜遗传基础狭窄，蛋白种类有限，对亲缘关系很近的西瓜杂交种难以区分。同工酶电泳比蛋白质电泳灵敏度更高、更准确，但是存在时期特异性和器官特异性、需在低温下操作以及在葫芦科作物中同工酶位点非常有限等缺点。第三种方法是分子标记技术，是从dna水平上来反映基因型的差异。这种方法具有其他两种方法不具备的优越性：直接以基因型的结果进行反映，准确可靠；不受发育时期和环境的影响；不存在表达的问题，可以鉴定表型难以区别的品种等。常用的分子标记有rflp、rapd、aflp、ssr等。rflp多态性稳定，但需要的dna量大、费用高且需要用到放射性同位素，严重制约了本方法的应用。rapd操作简单、多态性好、应用范围广；但对反应条件、操作等要求极为严格，重复性差。ssr具有丰富的等位变异、重现性好和共显性遗传特性；但ssr引物开发需要成本较高，给ssr技术的开发和利用带来了一定阻碍。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种基于msnp技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其高效、准确、成本低。
6.为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
7.技术方案一：
8.一种于msnp技术的西瓜种子纯度检测的引物组，其特征在于，其包括引物对1f/r、引物对2f/r、引物对3f/r、引物对4f/r、引物对5f/r、引物对6f/r、引物对7f/r、引物对8f/r、
引物对9f/r、引物对10f/r、引物对11f/r、引物对12f/r、引物对13f/r、引物对14f/r、引物对15f/r、引物对16f/r、引物对17f/r、引物对18f/r、引物对19f/r、引物对20f/r、引物对21f/r、引物对22f/r；其中每条引物对均由正向引物和反应引物组成；
9.所述引物对1f/r中，f引物的序列seqidno.1所示，r引物的序列如seqidno.2所示；
10.所述引物对2f/r中，f引物的序列seqidno.3所示，r引物的序列如seqidno.4所示；
11.所述引物对3f/r中，f引物的序列seqidno.5所示，r引物的序列如seqidno.6所示；
12.所述引物对4f/r中，f引物的序列seqidno.7所示，r引物的序列如seqidno.8所示；
13.所述引物对5f/r中，f引物的序列seqidno.9所示，r引物的序列如seqidno.10所示；
14.所述引物对6f/r中，f引物的序列seqidno.11所示，r引物的序列如seqidno.12所示；
15.所述引物对7f/r中，f引物的序列seqidno.13所示，r引物的序列如seqidno.14所示；
16.所述引物对8f/r中，f引物的序列seqidno.15所示，r引物的序列如seqidno.16所示；
17.所述引物对9f/r中，f引物的序列seqidno.17所示，r引物的序列如seqidno.18所示；
18.所述引物对10f/r中，f引物的序列seqidno.19所示，r引物的序列如seqidno.20所示；
19.所述引物对11f/r中，f引物的序列seqidno.21所示，r引物的序列如seqidno.22所示；
20.所述引物对12f/r中，f引物的序列seqidno.23所示，r引物的序列如seqidno.24所示；
21.所述引物对13f/r中，f引物的序列seqidno.25所示，r引物的序列如seqidno.26所示；
22.所述引物对14f/r中，f引物的序列seqidno.27所示，r引物的序列如seqidno.28所示；
23.所述引物对15f/r中，f引物的序列seqidno.29所示，r引物的序列如seqidno.30所示；
24.所述引物对16f/r中，f引物的序列seqidno.31所示，r引物的序列如seqidno.32所示；
25.所述引物对17f/r中，f引物的序列seqidno.33所示，r引物的序列如seqidno.34所示；
26.所述引物对18f/r中，f引物的序列seqidno.35所示，r引物的序列如seqidno.36所示；
27.所述引物对19f/r中，f引物的序列seqidno.37所示，r引物的序列如seqidno.38所示；
28.所述引物对20f/r中，f引物的序列seqidno.39所示，r引物的序列如seqidno.40所示；
29.所述引物对21f/r中，f引物的序列seqidno.41所示，r引物的序列如seqidno.42所示；所述引物对22f/r中，f引物的序列seqidno.43所示，r引物的序列如seqidno.44所示。
30.进一步的，引物对1f/r～22f/r由msnp技术获得。
31.技术方案二：
32.一种根据上述的引物组检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其包括如下步骤：
33.步骤1、选材：选取1个或多个西瓜品种；每份份西瓜样品至少采用96粒种子；
34.步骤2、对西瓜基因组dna进行准确定量；
35.步骤3、将所述的引物组中进行引物合成，每个引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；然后按照指定的标签组合进行引物的混合制备引物混合液；
36.步骤4、以西瓜基因组dna为模板，用引物混合液分别对西瓜的基因组dna进行一轮pcr扩增，获得目标区域；
37.步骤5、将所获得的pcr扩增产物，进行等量混合；
38.步骤6、混合后的产物进行片段筛选；
39.步骤7、对筛选后所得体系中的单链dna进行消化；
40.步骤8、对消化后的产物进行纯化；
41.步骤9、在步骤8中获得的体系中配置二轮pcr体系；
42.步骤10、对二轮pcr产物进行纯化，完成测序文库的制备；
43.步骤11、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据；
44.步骤12、对获得的测试数据，再次根据标签组合将样本拆分开；
45.步骤13、识别测试样目标位点的基因型结果，通过位点基因型情况判定种子的纯度。
46.进一步的，引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；
47.每个引物对的标签组合中，所述正向引物的标签序列与所述反向引物的标签序列不同。
48.进一步的，步骤3中，每个引物对中，合成的10条带有标签的正向引物中的标签序列分别如seqidno.49～58所示；
49.每个引物对中，合成的10条带有标签的反向引物中的标签序列分别如seqidno.59～68所示。
50.进一步的，每对引物对合成的10条带有标签的引物对中，正向引物和反向引物的标签组合方式选自表1中的任意一种或几种。
51.表1：标签组合方式
52.53.[0054][0055]
进一步的，步骤3中，引物对1f/r～22f/r中的f引物还包括f端通用引物，所述f端通用引物的序列如seqidno.45所示；引物对1f/r～22f/r中的r引物还包括r端通用引物，所述r端通用引物的序列如seqidno.46所示；
[0056]
步骤9中、二轮pcr所用的frimer f的序列如seqidno.47所示，
[0057]
所用的primer r的序列如seqidno.48所示。
[0058]
更进一步的，当西瓜品种为多个时，所述primer r的序列还包括用于区别西瓜品种的条形码序列。
[0059]
进一步的，步骤2中，每个引物对的标签组合中，所述正向引物的标签序列与所述反向引物的标签序列不同。
[0060]
进一步的，在步骤1中，采用西瓜种子基因组dna提取试剂盒对西瓜种子的基因组dna进行提取。
[0061]
进一步的，在步骤4中，所述一轮pcr扩增体系：引物混合液8μl；dna用量100ng；3*t酶15μl；加水补足45μl；
[0062]
所述一轮pcr扩增程序：95℃3min；(95℃30s，60℃4min，72℃30s)28个循环；72℃4min。
[0063]
进一步的，在步骤6中，混合后的产物进行片段筛选，具体操作如下：
[0064]
步骤6.1、加入一轮pcr体积0.4倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
[0065]
步骤6.2、加入一轮pcr体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0066]
步骤6.3、添加一轮pcr体积0.9倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0067]
步骤6.4、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
[0068]
在步骤7中，对筛选后所得体系中的单链dna进行消化，具体操作步骤为：
[0069]
步骤7.1、向所获产物中加入20μl水，混匀磁珠；
[0070]
步骤7.2、吸附磁珠，转移16μl上清至新的ep管中；
[0071]
步骤7.3、向体系中加入exo i 2μl，10
×
reaction buffer 2μl；
[0072]
步骤7.4、消化体系的消化程序为：37℃30min；85℃15min；
[0073]
在步骤8中，对消化后的产物进行纯化的具体操作步骤为：
[0074]
步骤8.1、加入0.9倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0075]
步骤8.2、添加等pcr体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0076]
步骤8.3、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
[0077]
进一步的，在步骤9中，所述二轮pcr体系：3*t酶10μl；primer f；primer r；h2o18μl；
[0078]
所述二轮pcr程序：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃30s)12个循环；72℃4min；
[0079]
进一步的，在步骤10中，对二轮pcr产物进行纯化，利用的是0.80倍的磁珠，具体操作如下：
[0080]
步骤10.1、加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0081]
步骤10.2、添加等pcr体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0082]
步骤10.3、加入100μl的80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净；
[0083]
步骤10.4、加入23μl elution buffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱dna，
将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清dna溶液吸至一新的管中，获得测序文库；所述elution buffer为10mm tris
‑
hcl，ph 8.0
‑
8.5。
[0084]
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：
[0085]
msnp技术：本发明采用msnp技术，一个扩增子内对应多个snp，最大限度的利用了每个扩增子片段所获得的的信息，可以在扩增子不变的情况下检测到尽量多的snp变异。且这些snp之间可构成单倍型，提高了变异的检测效率。这样不仅可以采用msnp位点内和位点间的变异，而且还可以采用单倍型和snp两种方式进行检测，使得遗传变异的检测更加精细，提高了标记鉴定的准确度和灵敏度。本专利中采用了22对引物对，实际检测到的变异信息有300多个，有助于筛选出更多的符合需求的多态性位点用于纯度鉴定分析。与常规snp检测相比，减少了引物对数的使用，降低了成本。
[0086]
成本低：采用msnp技术，扩增子不变的情况下可以检测到更多的snp变异；采用一轮扩增后至少96个测试样产物混样检测的方案，减少二轮扩增工作量的同时降低了测序成本。
[0087]
高效：采用混样检测的方案，一轮扩增后至少96个检测样的产物混样进行后续的扩增和测序，可在一天时间内最多可完成1440粒种子的检测。与其他检测方法相比，操作简单，不用田间种植、不需要工作量大、检测难度大的实验操作等，可以快速进行种子纯度的检测工作。
[0088]
准确：本方法是利用测序技术直接读取单核苷酸多态，通过程序直接进行纯度结果的判读，结果直观，可靠，避免受种子发育期、及结果判读时主观因素的影响。
附图说明
[0089]
图1是本发明混样检测方法的流程图。
具体实施方式
[0090]
实施例1：特异性引物的获得方法
[0091]
本发明特异性引物的获得方法，具体为：
[0092]
利用西瓜的全基因组重测序数据，采用bwa
‑
mem(http://bio
‑
bwa.sourceforge.net/)回贴到西瓜参考基因组上，利用gatk(https://software.broadinstitute.org/gatk/)进行单核苷酸变异鉴定。
[0093]
鉴定出的单核苷酸变异位点集，筛选最小等位变异频率>0.01、杂合率＜10％、缺失率＜20％，将单核苷酸变异位点进行合并，筛选单核苷酸位点数位于大于2的区段，即msnp(多聚单苷酸多态性)位点，相较于传统的snp(单核苷酸多态性)位点，msnp位点可最大限度的利用每个引物对所获得的信息，即在引物对不变的情况下检测到尽可能多的snp位点，且同一引物对内的所有snp还可以组合成单倍型，使其多态性更高。例如一个snp存在a/t两种变异，其可区分的多态为aa、at、tt共计3种，若检测的为msnp位点，假如一个引物对内有3个snp(a/t、g/t、c/a)，则可以存在8种(agc、aga、ata、atc、tgc、tga、tta、ttc)多态。这使得遗传变异的检测更加精细，同时提高了标记鉴定的准确度和灵敏度。本专利筛选多态性比较高的区段共计38个。
[0094]
对38个目标区段进行引物设计，并对引物特异性进行筛选，共获得染色体特异引
物22对，共计389个单核苷酸变异位点。从检测成本和实用角度综合考虑，同样按西瓜样本间5
‑
10％的多样性原则，我们最终选取22对引物混合进行西瓜种子纯度的检测，共计可检测380个左右snp位点。
[0095]
在本发明中，共计获得22组特异性引物对，即引物对1f/r～22f/r，引物对1f/r～22f/r的基因序列如seqidno.1～44所示。
[0096]
实施例2：西瓜种子纯度检测所用引物组
[0097]
西瓜种子纯度检测所用的引物组，包括引物对1f/r～22f/r，在引物对1f/r～22f/r中，不仅包括如seqidno.1～44所示特异性引物序列，还包括通用引物序列，引物对1f/r～22f/r中的f引物的f端通用引物序列如seqidno.45所示；引物对1f/r～22f/r中的r引物的r端通用引物的序列如seqidno.46所示；
[0098]
实施例3：引物混合液的获得方法：
[0099]
获得特异性引物后，设计特异的标签序列，再重新进行引物合成，此时引物合成时会添加上特异的标签序列，本实施例采用96组特异的标签组合，具体为：
[0100]
依据特定标签组合情况，将每条特异性引物合成10条带有不同目标标签的引物，带有目标标签的引物序列形式如表2所示，将带有目标标签的所有f(正向引物)和所有r(反向引物)，每条引物取10μl，定容至10ml；每条引物的浓度0.1μm，本实施例共计制备出含有96组特异标签组合的引物对，即引物混合液；
[0101]
表2引物组
[0102]
[0103][0104]“fff”为f端通用引物序列，所述f端通用引物序列为aacgacatggctacgatccgactt，如seqidno.45所示；
[0105]“rrr”为r端通用引物序列，所述r端通用引物序列为ctaagaccgcttggcctccgactt，如seqidno.46所示。
[0106]
其中“yyy”为标签序列，
[0107]
每个引物对中，合成的10条带有标签的正向引物中的标签序列分别为ccttc、accga、atgtg、aatgc、ttcgg、aaggt、cccat、atgga、acgat、ctctg，即分别如seqidno.49～58所示；
[0108]
每个引物对中，合成的10条带有标签的反向引物中的标签序列分别为atccg、tatcg、actcg、taacc、cttac、tccta、acact、tacgt、tcacg、acgca，即分别如seqidno.59～68所示。
[0109]
每对引物对合成的10条带有标签的引物对中，正向引物和反向引物的标签组合方式选自表2中的任意一种或几种。
[0110]
实施例4：纯种鉴定
[0111]
步骤1、材料的选取，选取2份西瓜(分别选取96粒种子和192粒种子)，分别编号为wm2004006和wm2004007，提取西瓜种子的基因组dna，采用石家庄博瑞迪生物技术有限公司生产的西瓜种子基因组dna提取试剂盒对提取后的dna进行准确定量。
[0112]
步骤2、以西瓜种子基因组dna为模板，用引物混合液进行一轮pcr扩增，获得目标区域；
[0113]
所述一轮pcr扩增体系：实施例3获得的引物混合液8μl；dna用量100ng；3*t酶15μl；加水补足45μl。
[0114]
所述一轮pcr扩增程序：95℃3min；(95℃30s，60℃4min，72℃30s)28个循环；72℃4min。
[0115]
步骤3、将所获得的pcr扩增产物，进行等量混合，只有扩增产物为带有不同组合的特定标签才可进行混合，混合时直接按照体系1:1混合即可。等量混合后，对混合后的产物进行产物纯化即片段筛选，具体步骤为；
[0116]
步骤3.1、加入一轮pcr体积0.4倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
[0117]
步骤3.2、加入一轮pcr体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0118]
步骤3.3添加一轮pcr体积0.9倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0119]
步骤3.4加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净；
[0120]
所述磁珠为：诺唯赞磁珠
[0121]
步骤4、对筛选后所得体系中的单链dna进行消化；
[0122]
在步骤3中获得的含磁珠的体系中，进行如下操作：
[0123]
步骤4.1、向所获产物中加入20μl水，混匀磁珠；
[0124]
步骤4.2、吸附磁珠，转移16μl上清至新的ep管中；
[0125]
步骤4.3、向上述体系中加入exo i 2μl，10*reaction buffer 2μl。
[0126]
步骤4.4、上述体系的消化程序为：37℃30min；85℃15min。
[0127]
步骤5、对消化后的产物进行纯化：
[0128]
步骤5.1、加入0.9倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0129]
步骤5.2、添加等pcr体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0130]
步骤5.3、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
[0131]
步骤6、在步骤5获得的体系中配置二轮pcr体系：
[0132]
在步骤5中获得的含磁珠的体系中，配置二轮pcr体系，进行二轮pcr扩增；
[0133]
所述二轮pcr体系：3*t酶10μl；primer f；primer r；h2o 18μl
[0134]
所述二轮pcr程序：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃30s)12个循环；72℃4min。
[0135]
所述primer f的序列如seqidno.47所示，为gaacgacatggctacgatccgactt；所述primer r的序列如seqidno.48所示，为tgtgagccaaggagttgttgtcttcctaagaccgcttggcctccgactt；
[0136]
由于本实施例采用的是2份西瓜品种，为了对样本进行区分，因此，primer r的序列除包括如seqidno.48所示的序列外，还包括唯一条形码序列barcode；
[0137]
带条形码的primer r的序列为：tgtgagccaaggagttgxxxxxxxxxxttgtcttcctaagaccgcttggcctccgactt；
[0138]
其中“xxxxxxxx”为用于识别样品的唯一条形码barcode，以区分样本。
[0139]
本实施例中2份西瓜品种样本的barcode序列分别为cggctaaa、tccccgtg；即分别如seqidno.69
‑
70所示。
[0140]
步骤7、利用0.80倍的磁珠对二轮pcr扩增产物进行纯化，完成测序文库的制备；
[0141]
步骤7.1加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0142]
步骤7.2添加等pcr体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；
[0143]
步骤7.3加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤。用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。
[0144]
步骤7.4加入23μl elution buffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱dna。将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清dna溶液吸至一新的管中，获得测序文库(elution buffer为10mm tris
‑
hcl，ph 8.0
‑
8.5)；
[0145]
步骤8、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据。
[0146]
步骤9、识别目标dna的基因型结果，从96粒种子中分别选取检测合成的种子用于
后续纯度的判断依据，通过多态性高的位点基因型情况判定这批种子的纯度，本实施例的检测结果见表3。
[0147]
表3检测结果
[0148]
样品编号自交种子数种子纯度结论wm20040060100.00％同常规鉴定结果wm2004007097.87％同常规鉴定结果
[0149]
种子纯度程序判读原则：
[0150]
首先对每个位点是杂交/异交还是自交进行判断，判断标准：计算一批种子在每个位点基因型种类所占的比例。如果这个位点的基因型只有一种且纯合，这个位点舍弃，因为无法判断是自交还是杂交。如果一种杂合基因型的占比超过90％，判断为杂交；一个样本在这个位点的基因型是纯合就判断是自交；如果是其他杂合基因型就判断为异交。
[0151]
然后对样本进行自交、异交和杂交的判定。最后统计这批种子的整体情况。
[0152]
纯度计算，用一批种子纯度百分率表示：
[0153][0154]
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。