环状RNAhsa_circ_0007015在制备预防和治疗慢性肾脏病药物中的应用的制作方法

环状rnahsa_circ_0007015在制备预防和治疗慢性肾脏病药物中的应用
(一)技术领域
1.本发明涉及环状rna hsa_circ_0007015在制备预防和治疗慢性肾脏病的药物中的应用。
(二)

背景技术：

2.慢性肾脏病(chronic kidney disease，ckd)定义为各种原因引起慢性肾脏结构或功能损害，在数月至数年的时间内缓慢进展，最终导致慢性肾衰竭甚至死亡的疾病。ckd发病率逐年攀升，是各国共同面临的重大公共健康问题。ckd可继发于高血压、糖尿病、肥胖症以及衰老带来的肾脏损伤。在中国，ckd的患病率已经达到10.8％。ckd4期以上的病人需接受肾脏替代治疗，包括腹透、血透、肾移植，给患者和社会带来巨大压力。所以，对ckd的有效防治将会给患者和社会带来不可估量的益处。
3.近年来，许多研究发现非编码rna在疾病发生发展中有重要的意义。非编码rna中的环状rna(circular rna，circrna)具有重要的生物学功能。环状rna是由线性mrna的部分外显子和/或内含子反向剪切形成闭合的环状结构，这种结构决定了它的稳定性。已有研究显示，环状rna发挥功能可以通过多种方式，包括以分子海绵microrna竞争性抑制、结合蛋白从而调控蛋白，有的环状rna可以通过翻译蛋白质发挥其功能。
4.近年来，许多研究发现非编码rna在疾病发生发展中有重要的意义。非编码rna中的环状rna(circular rna，circrna)，具有重要的生物学功能。环状rna是由线性mrna的部分外显子和/或内含子反向剪切形成闭合的环状结构，这种结构决定了它的稳定性。已有研究显示，环状rna发挥功能可以通过多种方式，包括以分子海绵microrna竞争性抑制、结合蛋白从而调控蛋白，有的环状rna可以作为翻译蛋白质发挥其功能。
5.rna干扰(rna interference，rnai)技术是与靶基因序列同源的双链rna(double
‑
stranded rna，dsrna)所诱导的一种特异性基因沉默现象。使用rnai技术可以特异性降低或关闭特定基因的表达，故该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。细胞内转录的shrna被加工后掺入rna诱导的沉默复合物(rna
‑
induced silencing complex，risc)，引导核酸酶降解靶rna。其中shrna是具有两个短反向重复序列、中间由茎环组成的发夹结构，常用于rna干扰沉默靶基因mrna的表达。病毒shrna载体也可用于rnai干扰，其带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。相较于其它载体，病毒shrna载体可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，转染效果稳定，且可避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。
6.hsa_circ_0007015基因定位于chr1:214625147
‑
214638300，由宿主基因ptpn14的2、3外显子组成，序列长度为498bp。完整序列为：5
’‑
ctatcttccagagggccacactgggcatggacacccttttccctgcctggaggagcacaggtgatagtgtaattttccagtcacgaaactgctaaggccatctcaggggcgtgtgcgccaggataggcgggcggcgtccgaggaccacatagccatgccttttggtctgaagctccgccggacacggcgctacaacgtcctgagcaagaactgctttgtcacacggattcgcctgctggacagcaatgttatcgagtgca
cgctgtcggtggaaagcacagggcaagaatgcctggaggctgtggcccagaggctggagctgcgagagacgcactactttggcctttggtttctcagcaagagccagcaagcacgatgggtggagctggagaaacctctgaagaaacatctggacaaattcgctaatgagcctttgcttttctttggagtcatgttctatgtgccaaatgtgtcatggcttcagcaagaggccacaag
‑3’
目前hsa_circ_0007015基因在肾脏纤维化发生发展中的作用级相关机制还未见报道，在肾脏纤维化基因治疗中的应用还欠明确，因此，研究一种hsa_circ_0007015基因相关药物用于治疗肾脏纤维化有其必要性和独特性
(三)

技术实现要素：

7.基于现有技术中存在的缺陷和市场的需求，本发明提供了环状rna hsa_circ_0007015在制备预防和治疗慢性肾脏病的药物中的应用。
8.本发明采用的技术方案是：
9.环状rna hsa_circ_0007015作为分子标记物在制备慢性肾脏病诊断试剂中的应用。
10.本发明还涉及环状rnahsa_circ_0007015在制备预防和治疗慢性肾脏病的药物中的应用。经实验证明，hsa_circ_0007015基因在肾脏纤维化组织中高表达，通过抑制hsa_circ_0007015基因的表达可以减少肾小管损伤、细胞外基质沉积和胶原产生、减轻肾脏纤维化。
11.具体的，所述应用是hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂在制备预防和治疗慢性肾脏病药物中的应用。
12.所述抑制剂的靶向序列为：5
’‑
ttctccgaacgtgtcacgtaa
‑3’
。
13.所述抑制剂为能够抑制hsa_circ_0007015基因表达的shrna序列，所述shrna模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：
14.正义链：5
’‑
aattcgcaggaggccacaagctgtcttcaagagagacagcttgtggcctcctgttttttg
‑3’
；
15.反义链：5
’‑
gatccaaaaaacaggaggccacaagctgtctctcttgaagacagcttgtggcctcctgcg
‑3’
。
16.本发明利用rna干扰技术研制一种hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂，该抑制剂可与hsa_circ_0007015基因特异性结合使其沉默，从而抑制肾小管损伤、细胞外基质沉积和胶原产生，达到治疗肾脏纤维化的目的。hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂在肾脏纤维化领域发挥重要作用，为临床治疗肾脏纤维化提供新的靶向治疗药物。
17.所述抑制剂可包装至aav9制成腺相关病毒。腺相关病毒(adeno
‑
associated virus，aav)是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm。aav有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，适用于各种体内感染实验，其中aav9对肾脏感染亲和力高。由于aav的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。
18.所述肾脏疾病包括急性肾损伤后修复不良引起的肾脏纤维化。进一步地，所述肾脏疾病包括肾前性及肾后性急性肾脏损伤、原发性肾病及继发性肾病在发展过程中肾脏发生纤维化的初期。
19.所述药物是可以是抑制hsa_circ_0007015基因的重组核酸构建体，所述重组核酸构建体是任何适用于基因治疗的载体，所述载体包括病毒载体或非病毒载体。所述病毒载
体可以为腺病毒载体。
20.所述药物剂型可以是注射剂。所述药物剂量为任何药物治疗学可接受的剂量。
21.本发明的有益效果主要体现在：
22.(1)本发明提供的hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂特异性强，沉默效率高，能有效抑制hsa_circ_0007015基因表达量；
23.(2)本发明通过hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂抑制hsa_circ_0007015基因的表达，保护纤维化刺激因子对肾小管上皮细胞的损伤，减少胶原产生和细胞外基质产生，从而达到防治肾脏纤维化的目的；
24.(3)本发明提供的基于抑制hsa_circ_0007015基因的药物，是临床上尚未研究的hsa_circ_0007015基因，研究hsa_circ_0007015基因相关药物用于治疗肾脏纤维化有其必要性和独特性。
(四)附图说明
25.图1为应用sanger dna测序对hsa_circ_0007015基因环状rna测序鉴定；
26.图2为应用qpcr检测hsa_circ_0007015基因在小鼠单侧输尿管梗阻模型5天及14天、缺血再灌注模型7天和14天中表达升高；
27.图3为qpcr及fish检测应用hsa_circ_0007015基因抑制剂后，肾脏纤维化组织中hsa_circ_0007015基因表达显著降低。
28.图4为免疫荧光检测肾脏组织应用hsa_circ_0007015基因抑制剂，减少肾小管损伤，ltl(绿色)为标记健康近端肾小管刷状缘，kim
‑
1(红色)为标记损伤肾小管腔面；
29.图5为western blot及免疫组化检测应用hsa_circ_0007015基因抑制剂后，肾脏胶原产生减少，细胞外基质沉积减少，α
‑
sma、collagen i和fn为纤维化标志蛋白。
(五)具体实施方式
30.通过下列实例对本发明的内容做进一步说明，但本发明的保护范围，不限于此。
31.在对肾脏纤维化的研究进程中应用到许多动物模型以模拟患者肾脏纤维化的病理发生发展，其中小鼠单侧输尿管梗阻模型是经典的小鼠肾脏纤维化模型，其疾病发生是由于肾后性的梗阻从而引起肾小管及间质的纤维化改变；而缺血再灌注模型是对小鼠的肾脏造成急性损伤，在后续的不良修复与组织再生中逐渐发展成为纤维化的病理模型，可模拟慢性肾脏病在发展过程中肾脏发生纤维化的初期改变。选择以上小鼠模型能够较好的模拟临床疾病中肾脏纤维化病理发展过程。因此，本发明基于上述两种模型，进行了对疾病的干预，研究结果能更好地体现其临床相关性和应用潜力。
32.实施例1：hsa_circ_0007015基因环状rna测序鉴定
33.通过在hsa_circ_0007015反向连接位点两侧设计pcr引物，扩增hsa_circ_0007015环化位点两翼的序列，经过sanger dna测序获得hsa_circ_0007015的准确环化位点。pcr引物序列如下：
34.hsa_circ_0007015_f:5
’‑
tcggagtcatgttctatgtgc
‑3’
35.hsa_circ_0007015_r:5
’‑
cctgagatggccttagtagtttt
‑3’
36.pcr以小鼠肾脏cdna为模板，扩增体系及条件为：2
×
pcr mix(vazyme公司)20ul，
上下游引物(10mm)各1ul，cdna模板2ul，用灭菌水补足40ul体系；94℃2min预变性，35个循环内：98℃30s变性，58℃20s退火，68℃30s延伸，循环后68℃继续延伸5min，后4℃保存。纯化pcr产物，做sanger dna序列测定，确定环状rna hsa_circ_0007015的准确环化接口，如图1所示。
37.通过权威环状rna数据库circbase(http://www.circbase.org)明确环状rna hsa_circ_0007015基因定位于chr1:214625147
‑
214638300，由宿主基因ptpn14的2、3外显子组成；通过在hsa_circ_0007015反向连接位点两侧设计pcr引物，扩增hsa_circ_0007015环化位点两翼的序列，经过sanger dna测序获得hsa_circ_0007015的准确环化位点(图1中junction site)。
38.实施例2：hsa_circ_0007015基因在肾脏纤维化中过表达
39.用qpcr法分别检测hsa_circ_0007015基因在正常小鼠肾脏、两种纤维化造模小鼠肾脏(小鼠缺血再灌注及单侧输尿管梗阻模型)及人肾小管上皮细胞系hk2、经tgfβ刺激后hk2中的表达情况。使用rna提取试剂盒(奕杉公司)提取组织或细胞系总rna，取1ug rna逆转录成cdna，进一步把cdna作为模板进行sybr荧光染料法qpcr检测，使用上述pcr引物序列检测扩增循环数，以gapdh为内参基因进行标准化和比较，结果见图2。结果显示hsa_circ_0007015基因在两种纤维化造模小鼠肾脏中表达升高，提示hsa_circ_0007015基因与肾脏纤维化之间的相关性。同时，经tgfβ刺激后hk2中hsa_circ_0007015基因升高，提示hsa_circ_0007015基因与纤维化的关系并定位于肾小管上皮细胞系。
40.实施例3：针对hsa_circ_0007015基因的靶向抑制aav
‑
9的制备
41.1、aav9
‑
hsa_circ_0007015
‑
shrna的制备
42.aav9
‑
hsa_circ_0007015
‑
shrna载体购自汉恒生物科技(上海)股份有限公司。腺相关病毒包装采用的病毒类型为aav9，在phbaav
‑
u6
‑
mcs
‑
cmv
‑
egfp载体的mcs多克隆位点插入hsa_circ_0007015的shrna序列(正义链：
[0043]5’‑
aattcgcaggaggccacaagctgtcttcaagagagacagcttgtggcctcctgttttttg
‑3’
；反义链：5
’‑
gatccaaaaaacaggaggccacaagctgtctctcttgaagacagcttgtggcctcctgcg
‑3’
)，得到目的载体质粒，然后与paav
‑
rc载体质粒、phelper载体质粒共转染至293t细胞，收集病毒并纯化后得到腺相关病毒aav9
‑
hsa_circ_0007015
‑
shrna。
[0044]
2、aav9
‑
hsa_circ_0007015
‑
shrna体内注射
[0045]
选用spf级8～10周龄c57bl/6j雄性小鼠进行病毒注射，使用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，由后背切口暴露左侧肾脏，使用hamilton微量注射器对肾脏进行原位注射，10ul每注射点，共60ul。病毒的起效时间为3周。3周后对提取该肾脏rna，进行上述qpcr实验，检测hsa_circ_0007015基因表达量，结果见图3。结果显示在注射aav9
‑
hsa_circ_0007015
‑
shrna，即hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂后，hsa_circ_0007015基因表达显著降低，提示成功制备hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂，可针对性抑制hsa_circ_0007015基因的表达。
[0046]
3、荧光原位杂交技术(fish)
[0047]
对上述注射过aav9
‑
hsa_circ_0007015
‑
shrna及对照的小鼠进行荧光原位杂交检测hsa_circ_0007015表达水平，具体步骤为：小鼠到3周后，用异氟烷麻醉，使用无菌pbs灌流，取造模侧肾脏固定于4％pfa，24h后转至30％蔗糖溶液，肾脏沉底后用oct包埋，于冰冻
切片机切片为6um的组织切片。
[0048]
染色：使用basescope试剂盒(acd公司)及hsa_circ_0007015特异性荧光探针，按照试剂盒说明书进行fish实验，完成rna原位杂交后进行肾小管染色，使用肾小管亲和性凝集素ltl和pna分别对肾小管的管腔面和基底面进行染色，完成后用含dapi的封片剂封片，于蔡司共聚焦显微镜拍照，分析数据，结果见图3。共聚焦显微镜结果显示，对比注射对照病毒组，应用aav9
‑
hsa_circ_0007015
‑
shrna后hsa_circ_0007015表达明显降低，说明hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂可针对性抑制hsa_circ_0007015基因的表达。
[0049]
实施例4：在小鼠缺血再灌注损伤和单侧输尿管结扎模型中对hsa_circ_0007015基因的抑制减少肾脏损伤
[0050]
1、缺血再灌注模型
[0051]
选用spf级8～10周龄c57bl/6j雄性小鼠进行造模，造模过程中将小鼠置于37℃加热垫上保持体温，使用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，由后背切口暴露左侧肾脏，分离暴露左侧肾脏血管，用小鼠动脉夹夹闭动静脉30分钟，松夹后确认肾脏颜色恢复，逐层缝合消毒。
[0052]
2、单侧输尿管结扎模型
[0053]
选用spf级8～10周龄c57bl/6j雄性小鼠进行造模，造模过程中将小鼠置于37℃加热垫上保持体温，使用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，由后背切口暴露左侧肾脏，分离暴露左侧输尿管，用4
‑
0丝线结扎输尿管，逐层缝合消毒。
[0054]
3、组织免疫荧光
[0055]
造模小鼠到相应时间点后，用异氟烷麻醉，使用无菌pbs灌流，取造模侧肾脏固定于4％pfa，24h后转至30％蔗糖溶液，肾脏沉底后用oct包埋，于冰冻切片机切片为6um的组织切片。染色：使用pbs洗去切片上的oct，封闭和破膜采用5％驴血清和0.5％tritonx100，室温1小时。用0.5％驴血清以1：500比例稀释kim
‑
1一抗，四度孵育过夜。pbs洗三次后，室温孵育anti
‑
goat二抗和ltl染料1小时，最后用含dapi染料的封片剂封片。于蔡司共聚焦显微镜拍照，分析数据，结果见图4。共聚焦显微镜结果显示，对比假手术对照组及aav9
‑
空载对照组，应用hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂后kim
‑
1表达明显降低，说明hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂可减少肾小管损伤。
[0056]
实施例5：在小鼠缺血再灌注损伤和单侧输尿管结扎模型中对hsa_circ_0007015基因的抑制减少肾脏纤维化
[0057]
1、western blot
[0058]
用ripa蛋白裂解液提取小鼠肾脏总蛋白，bca蛋白定量法对提取的蛋白进行定量；配置5％sds
‑
page浓缩胶、10％sds
‑
page分离胶，上样总蛋白为20微克；采用80v 40分钟、120v 1小时跑蛋白电泳；转膜采用300ma转120分钟；5％的脱脂牛奶封闭30min；α
‑
sma、collagen i、fn和内参β
‑
actin作为一抗，抗体4度孵育过夜；第二天采用anti
‑
rabbit igg二抗常温孵育1h，tbst洗涤3遍每次10min，然后进行后续ecl化学发光，分析数据，结果见图5。wb结果显示使用hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂后α
‑
sma、collagen i、fn的表达量减少，提示肾脏胶原产生减少、细胞外基质沉积减少，减少肾脏纤维化程度。
[0059]
2、组织免疫组化
[0060]
造模小鼠到相应时间点后，用异氟烷麻醉，使用无菌pbs灌流，取造模侧肾脏固定
于4％pfa，24h后转至梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，切成3um的石蜡切片。使用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱苯后，用1.5％过氧化氢阻断内源性过氧化物，使用柠檬酸钠煮沸20min抗原修复，用5％bsa封闭1小时，1％bsa稀释α
‑
sma、fn一抗，4度孵育过夜；第二天采用anti
‑
rabbit igg二抗常温孵育20min，dab显色，苏木素染核，1％盐酸分化，梯度乙醇、二甲苯透明后中性树脂封片，使用leica正置显微镜拍照，分析数据，结果见图5。leica正置显微镜结果显示使用hsa_circ_0007015基因靶向抑制剂后，collagen i、fn的表达量减少，提示肾脏胶原产生减少、细胞外基质沉积减少，减少肾脏纤维化程度。