以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒3种点突变S基因鉴别试剂盒及其鉴别方法与流程

以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒3种点突变s基因鉴别试剂盒及其鉴别方法
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变s基因鉴别试剂盒及其检测方法及应用。


背景技术：

2.新冠肺炎疫情自爆发以来，给人类社会带来了巨大的灾难，且至今仍未得到有效控制。新型冠状病毒的快速传播不仅严重影响了全球公共卫生事业发展，也对口岸卫生检疫及疫情防控提出了更高的要求。基因突变是病毒在自然演变中常见的现象，已有研究表明新型冠状病毒突变体可能使它们具有更强的传播性，或者产生逃避某些抗体免疫反应的能力。新冠病毒表面的刺突蛋白(spike protein, s)在病毒传播中起着十分重要的作用，对s基因突变病毒的快速鉴定不仅有利于疫情防控，也有助于进一步监控病毒的传播及演化进程。因此，口岸新冠检疫急需发展安全、快速、准确、灵敏的突变基因快速检测方法，以实现新型冠状病毒s基因突变体快速鉴定。
3.近年来，随着分子生物学技术的发展，单链构象异构多态分析技术（sscp）、高效液相色谱法以及一代、二代、三代测序及宏基因组测序等分子手段均已成功应用于已知或未知突变基因的鉴定。然而，这些鉴定方法均有不足之处：sscp虽然灵敏度较高，但只能通过电泳区分正常链及突变链，要确定突变类型及突变基因位点仍需进一步测序，且电泳条件要求比较严格；高效液相色谱法只能检查有无突变，不能检测出突变类型，并且结果判断易出错；测序技术应用广泛，但是耗时长、花费高，并不适用于口岸快速检测的要求。鉴于上述方法的不足，为了安全、快速、准确、灵敏的实现突变基因的分子鉴定，需要探寻新的分子鉴定手段。


技术实现要素：

4.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变s基因鉴别试剂盒可作为突变s基因新的鉴别手段，它以单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线为基础进行突变基因鉴定，操作简单、速度快、低成本、高通量、结果准确、不受检测位点的局限、pcr 产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。
5.本发明是由以下技术方案来实现的：本发明设计了一组以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒n501y、a570d、d1118h位点突变的s基因鉴别引物，引物特异性强，灵敏度高。序列如下：n501y
‑
f：5
’‑
agcacaccttgtaatggtgttgaag
‑3’ꢀ
；n501y
‑
r：5
’‑
tccacaaacagttgctggtgcatgt
‑3’ꢀ
。
6.a570d
‑
f：5
’‑
gtttaacaggcacaggtgttcttac
‑3’ꢀ
；a570d
‑
r：5
’‑
caccaccaaaagaacatggtgtaat
‑3’ꢀ
。
d1118h
‑
f：5
’‑
tgtctttgtttcaaatggcacacac
‑3’ꢀ
；d1118h
‑
r：5
’‑
ggttgcaaaggatcataaactgtgt
‑3’ꢀ
。
7.利用上述的检测引物，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变s基因鉴别试剂盒，包括如下成分：1）针对n501y、a570d、d1118h三个突变位点的s基因特异性鉴别引物。
8.n501y
‑
f：5
’‑
agcacaccttgtaatggtgttgaag
‑3’ꢀ
；n501y
‑
r：5
’‑
tccacaaacagttgctggtgcatgt
‑3’ꢀ
。
9.a570d
‑
f：5
’‑
gtttaacaggcacaggtgttcttac
‑3’ꢀ
；a570d
‑
r：5
’‑
caccaccaaaagaacatggtgtaat
‑3’ꢀ
。d1118h
‑
f：5
’‑
tgtctttgtttcaaatggcacacac
‑3’ꢀ
；d1118h
‑
r：5
’‑
ggttgcaaaggatcataaactgtgt
‑3’ꢀ
。
10.2）pcr混合液：faststart taq dna聚合酶，反应缓冲液，dntp混合液，resolight饱和荧光染料；3）包含n501y、a570d、d1118h突变位点的新型冠状病毒s基因puc57载体重组质粒；4）ddh2o；5）25 mm mgcl2。
11.本发明还提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变s基因鉴别方法，包括如下步骤：1）高分辨率熔解曲线模板：包含n501y、a570d、d1118h三个突变位点的新型冠状病毒s基因puc57载体重组质粒的制备：从ncbi网站获取新型冠状病毒s基因（geneid：43740568）序列，并根据n501y、a570d、d1118h突变位点将突变处基因进行修改。将含有突变位点的s基因序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因合成并构建至puc57质粒，获得突变s基因puc57载体重组质粒。
[0012] 2）高分辨率熔解曲线反应体系：30μl反应体系包括：引物f 0.6 μl（10 μm工作浓度），引物r 0.6 μl（10 μm工作浓度），模板2 μl，反应缓冲液3 μl，faststart taq dna聚合酶0.5 μl，dntp混合液2 μl，mgcl
2 3.6 μl，resolight饱和荧光染料1μl，ddh2o 16.7 μl。
[0013] 3）高分辨率熔解曲线反应程序：94℃预变性3 min。94℃变性30s，52 ℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸3 min。
[0014] pcr结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65℃
‑
95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用lightcycler
®ꢀ
480 gene scanning software 软件分析高分辨率熔解曲线。
[0015]
本发明是一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒3种点突变s基因鉴别试剂盒，其特点是根据新型冠状病毒s基因的3个不同突变位点设计特异性扩增引物，可对新冠病毒s基因区域n501y、a570d、d1118h突变位点进行鉴别，与现有鉴别手段相比，本发明的优势在于：1）可以通过pcr快速区分新型冠状病毒s基因区域n501y、a570d、d1118h突变，无需
进行基因测序。
[0016]
2）本发明设计的引物，灵敏度高，特异性强。
[0017]
3）操作简单、速度快，实验完成即可明确样品s基因区域是否产生以上三种突变。
[0018]
4）pcr产物无需后处理，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的快速检测。
附图说明
[0019]
图1：三种新型冠状病毒突变s基因pcr结果图。
[0020]
图2：三种新型冠状病毒突变s基因多组分图谱。
[0021]
图3：三种新型冠状病毒突变s基因相对于阴性对照的高分辨率熔解曲线图。（横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度），其中三条波动曲线分别为三种突变基因，直线的为阴性对照。
具体实施方式
[0022]
下面利用实例对本发明作进一步描述。
[0023]
本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变s基因鉴别试剂盒，包括如下成分：1）n501y、a570d、d1118h位点突变的s基因特异性鉴别引物。
[0024]
n501y
‑
f：5
’‑
agcacaccttgtaatggtgttgaag
‑3’ꢀ
；n501y
‑
r：5
’‑
tccacaaacagttgctggtgcatgt
‑3’ꢀ
。
[0025]
a570d
‑
f：5
’‑
gtttaacaggcacaggtgttcttac
‑3’ꢀ
；a570d
‑
r：5
’‑
caccaccaaaagaacatggtgtaat
‑3’ꢀ
。d1118h
‑
f：5
’‑
tgtctttgtttcaaatggcacacac
‑3’ꢀ
；d1118h
‑
r：5
’‑
ggttgcaaaggatcataaactgtgt
‑3’ꢀ
。
[0026]
2）pcr混合液：faststart taq dna聚合酶，反应缓冲液，dntp混合液，resolight饱和荧光染料3）包含n501y、a570d、d1118h突变位点的新型冠状病毒s基因puc57载体重组质粒；4）ddh2o；5）25 mm mgcl2。
[0027]
本发明还提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变s基因鉴别方法，包括如下步骤：1）高分辨率熔解曲线模板：包含n501y、a570d、d1118h突变位点的新型冠状病毒s基因puc57载体重组质粒的制备：从ncbi网站获取新型冠状病毒s基因（geneid：43740568）序列，并根据n501y、a570d、d1118h突变位点将突变处基因进行修改。将含有突变位点的s基因序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因合成并构建至puc57质粒，获得突变s基因puc57载体重组质粒。
[0028] 2）高分辨率熔解曲线反应体系：30μl反应体系包括：引物f 0.6 μl（10 μm工作浓度），引物r 0.6 μl（10 μm工作浓
度），模板2 μl，反应缓冲液3 μl，faststart taq dna聚合酶0.5 μl，dntp混合液2 μl，mgcl
2 3.6 μl，resolight饱和荧光染料 1μl，ddh2o 16.7 μl。
[0029] 3）高分辨率熔解曲线反应程序：94℃预变性3 min。94℃变性30s，52 ℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸3 min。
[0030] pcr结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65℃
‑
95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用lightcycler
®ꢀ
480 gene scanning software 软件分析高分辨率熔解曲线。
[0031] 4）结果：如图1，三种新型冠状病毒突变s基因均扩增出条带，基因测序并用ncbi blast比对，比对结果显示相应位点处基因突变正确。利用lightcycler
®ꢀ
480 gene scanning software 软件分析高分辨率熔解曲线，如图2和3，发现三种新型冠状病毒突变s基因的曲线差异明显：d1118h突变s基因的溶解温度为79.1℃，n501y突变s基因的溶解温度为79.6℃, a570d突变s基因的溶解温度为81.6℃。因此通过溶解温度的不同可有效区分3种不同突变的新型冠状病毒s基因。
[0032]
5）结论：本发明首次利用高分辨熔解曲线鉴别三种新型冠状病毒突变s基因，提供了一种通过高分辨熔解曲线快速检测新型冠状病毒突变s基因的新方法。本试剂盒操作简单、速度快、pcr 产物无需后处理，可以通过溶解温度不同区分不同突变、无需基因测序，真正实现闭管操作。
[0033]
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。