一种基于mSNP技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法与流程

技术特征：
1.一种基于msnp技术的西瓜种子纯度检测用引物组，其特征在于，其包括引物对1f/r、引物对2f/r、引物对3f/r、引物对4f/r、引物对5f/r、引物对6f/r、引物对7f/r、引物对8f/r、引物对9f/r、引物对10f/r、引物对11f/r、引物对12f/r、引物对13f/r、引物对14f/r、引物对15f/r、引物对16f/r、引物对17f/r、引物对18f/r、引物对19f/r、引物对20f/r、引物对21f/r、引物对22f/r；其中每条引物对均由正向引物和反应引物组成；所述引物对1f/r中，f引物的序列seq idno.1所示，r引物的序列如seq idno.2所示；所述引物对2f/r中，f引物的序列seq idno.3所示，r引物的序列如seq idno.4所示；所述引物对3f/r中，f引物的序列seq idno.5所示，r引物的序列如seq idno.6所示；所述引物对4f/r中，f引物的序列seq idno.7所示，r引物的序列如seq idno.8所示；所述引物对5f/r中，f引物的序列seq idno.9所示，r引物的序列如seq idno.10所示；所述引物对6f/r中，f引物的序列seq idno.11所示，r引物的序列如seq idno.12所示；所述引物对7f/r中，f引物的序列seq idno.13所示，r引物的序列如seq idno.14所示；所述引物对8f/r中，f引物的序列seq idno.15所示，r引物的序列如seq idno.16所示；所述引物对9f/r中，f引物的序列seq idno.17所示，r引物的序列如seq idno.18所示；所述引物对10f/r中，f引物的序列seq idno.19所示，r引物的序列如seq idno.20所示；所述引物对11f/r中，f引物的序列seq idno.21所示，r引物的序列如seq idno.22所示；所述引物对12f/r中，f引物的序列seq idno.23所示，r引物的序列如seq idno.24所示；所述引物对13f/r中，f引物的序列seq idno.25所示，r引物的序列如seq idno.26所示；所述引物对14f/r中，f引物的序列seq idno.27所示，r引物的序列如seq idno.28所示；所述引物对15f/r中，f引物的序列seq idno.29所示，r引物的序列如seq idno.30所示；所述引物对16f/r中，f引物的序列seq idno.31所示，r引物的序列如seq idno.32所示；所述引物对17f/r中，f引物的序列seq idno.33所示，r引物的序列如seq idno.34所示；所述引物对18f/r中，f引物的序列seq idno.35所示，r引物的序列如seq idno.36所示；所述引物对19f/r中，f引物的序列seq idno.37所示，r引物的序列如seq idno.38所示；所述引物对20f/r中，f引物的序列seq idno.39所示，r引物的序列如seq idno.40所示；所述引物对21f/r中，f引物的序列seq idno.41所示，r引物的序列如seq idno.42所示；所述引物对22f/r中，f引物的序列seq idno.43所示，r引物的序列如seq idno.44所
示。2.一种根据权利要求1所述的引物组检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：步骤1、选材：选取1个或多个西瓜品种；每份西瓜样品至少采用96粒种子；步骤2、对西瓜基因组dna进行准确定量；步骤3、将权利要求1中所述的引物组中进行引物合成，每个引物对中的正向引物和反向引物合成时，均合成10条带有不同目标标签的引物；然后按照指定的标签组合进行引物的混合制备引物混合液；步骤4、以西瓜基因组dna为模板，用引物混合液分别对西瓜的基因组dna进行一轮pcr扩增，获得目标区域；步骤5、将所获得的pcr扩增产物，进行等量混合；步骤6、混合后的产物进行片段筛选；步骤7、对筛选后所得体系中的单链dna进行消化；步骤8、对消化后的产物进行纯化；步骤9、在步骤8中获得的体系中配置二轮pcr体系；步骤10、对二轮pcr产物进行纯化，完成测序文库的制备；步骤11、将测序文库等质量混合后上机测序，获得测序数据；步骤12、对获得的测试数据，再次根据标签组合将样本拆分开；步骤13、识别测试样目标位点的基因型结果，通过位点基因型情况判定种子的纯度。3.根据权利要求2所述一种检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，步骤3中，引物对1f/r～22f/r中的f引物还包括f端通用引物，所述f端通用引物的序列如seq idno.45所示；引物对1f/r～22f/r中的r引物还包括r端通用引物，所述r端通用引物的序列如seq idno.46所示；步骤9中，二轮pcr所用的frimer f的序列如seq idno.47所示；二轮pcr所用的primer r的序列如seq idno.48所示。4.根据权利要求3所述一种检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，当西瓜品种为多个时，所述primer r的序列还包括用于区别西瓜品种的条形码序列。5.根据权利要求2所述一种检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，步骤2中，每个引物对的标签组合中，所述正向引物的标签序列与所述反向引物的标签序列不同。6.根据权利要求2所述一种检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，在步骤1中，采用西瓜种子基因组dna提取试剂盒对西瓜种子的基因组dna进行提取。7.根据权利要求2所述一种检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，在步骤4中，所述一轮pcr扩增体系：引物混合液8μl；dna用量100ng；3*t酶15μl；加水补足45μl；所述一轮pcr扩增程序：95℃3min；(95℃30s，60℃4min，72℃30s)28个循环；72℃4min。8.根据权利要求2所述一种检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，在步骤6中，混合后的产物进行片段筛选，具体操作如下：步骤6.1、加入一轮pcr体积0.4倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，取上清转移至新的管中；
步骤6.2、加入一轮pcr体积0.6倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；步骤6.3、添加一轮pcr体积0.9倍的磁珠悬浮液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；步骤6.4、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。在步骤7中，对筛选后所得体系中的单链dna进行消化，具体操作步骤为：步骤7.1、向所获产物中加入20μl水，混匀磁珠；步骤7.2、吸附磁珠，转移16μl上清至新的ep管中；步骤7.3、向体系中加入exo i 2μl，10
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reaction buffer 2μl；步骤7.4、消化体系的消化程序为：37℃30min；85℃15min；在步骤8中，对消化后的产物进行纯化的具体操作步骤为：步骤8.1、加入0.9倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；步骤8.2、添加等pcr体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；步骤8.3、加入100μl的体积浓度为80％的乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净。9.根据权利要求2所述一种检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，在步骤9中，所述二轮pcr体系：3*t酶10μl；primer f；primer r；h2o 18μl；所述二轮pcr程序：95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃30s)12个循环；72℃4min。10.根据权利要求2所述一种检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其特征在于，在步骤10中，对二轮pcr产物进行纯化，利用的是0.80倍的磁珠，具体操作如下：步骤10.1、加入0.8倍的磁珠，用移液器上下吹打混匀，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；步骤10.2、添加等pcr体积的磁珠重悬液，重悬磁珠，静置2min，用磁力架吸附，至溶液澄清，去除上清；步骤10.3、加入100μl的80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面吸附磁珠，使磁珠得到充分的洗涤，用磁力架吸附2min，去除上清，室温放置至乙醇挥发干净；步骤10.4、加入23μl elution buffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱dna，将磁珠用磁铁吸附，所得到的上清dna溶液吸至一新的管中，获得测序文库；所述elution buffer为10mm tris
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hcl，ph 8.0
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8.5。

技术总结
本发明涉及一种基于mSNP技术检测西瓜种子纯度的混样检测方法，其利用引物对1F/R～22F/R进行，所述引物对1F/R～22F/R的基因序列见SEQ ID No.1～44；本发明采用mSNP技术，在扩增子不变的情况下，可以检测到更多的SNP变异；采用混样的方法进行检测，在减少扩增工作量的同时降低了测序成本，也加快了检测速度，可在一天时间内最多完成1440粒种子的检测。本方法是利用测序技术直接读取单核苷酸多态，通过程序直接进行纯度结果的判读，结果直观，可靠，避免受种子发育期、及结果判读时主观因素的影响。响。


技术研发人员：郝军会 许彦芬 高苗 李凝 刘景艺 张萌 刘田 龚舒 张丛
受保护的技术使用者：石家庄博瑞迪生物技术有限公司
技术研发日：2021.09.29
技术公布日：2021/12/3