原人参二醇衍生物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种原人参二醇衍生物及其制备方法和用途，以及所述原人参二醇衍生物和pd-l1/pd-l2抗体在制备治疗癌症的药物中的应用。


背景技术：

2.程序性死亡受体-1(programmed death-1，pd-1)是t细胞上的一种跨膜受体，最早是在凋亡的t细胞杂交瘤中利用消减法得到的。因其参与细胞凋亡，故被命名。pd-1能够与配体pd-l1、pd-l2相互作用，抑制t细胞增殖。pd-l1、pd-l2主要表达于抗原递呈细胞(如dc细胞、巨噬细胞)上。虽然pd-l1与pd-1的单克隆抗体临床应用取得了不俗的成绩，但到目前为止，癌症患者对pd-l1与pd-1的单克隆抗体的响应率仅为20-30％左右。寻找提高pd-l1与pd-1的单克隆抗体临床响应率的联合用药成为目前癌症药物研究的重中之重。
3.人参为传统中药中最重要的“补气药”，其主要有效成分为人参皂苷。人参皂苷根据苷元结构不同分为二醇组皂苷和三醇组皂苷。口服人参二醇组皂苷主要入血成分和主要活性代谢产物为rh2；compound k和原人参二醇，有关原人参二醇的抗癌作用，已有诸多文献报道，中国专利cn1418633a公布了一种以20(s)-原人参二醇为有效成分的抗癌辅助药物及应用。中国专利cn102366417a公布了原人参二醇作为抗癌药的可能，根据专利数据，原人参二醇对不同细胞株的50％生长抑制浓度ic50值介于3.34-918μm之间。从现有技术可以看出，在原人参二醇及其衍生物基础上，进一步对其结构进行研究，开发更有效的抗癌产品，是现阶段研发相关产品的重点。


技术实现要素：

4.针对现阶段相关pd-1、原人参二醇及其衍生物研发的重点，本发明对原人参二醇的结构进一步研究，发现更有效抗癌化合物，即原人参二醇新的衍生物。
5.本发明所涉及的原人参二醇衍生物，具有式ⅰ和ⅱ的通式，式ⅰ和ⅱ为：
[0006][0007]
式ⅰ中r1＝h或者val；r2＝h或者val，其中val表示缬氨酸。
[0008]
本发明所涉及的原人参二醇衍生物的制备方法为：
[0009][0010]
a,取原人参二醇、dmap，edci，boc保护的缬氨酸，按照当量比为1：3：4：4的当量进行混合，溶剂选为吡啶，40℃下搅拌10个小时，随后将反应液浓缩除去部分吡啶，反应液加入乙酸乙酯，随后10％盐酸洗两次，饱和碳酸钠溶液洗两次，饱和食盐水溶液洗一次，有机层干燥后浓缩，得到boc保护的原人参二醇缬氨酸酯。
[0011]
b,将上一步中得到的产物、甲磺酸按照当量比为1：1.8进行反应，溶剂选为甲苯和异丙醇混合溶剂，50℃下搅拌8个小时，随后加入乙酸乙酯，饱和碳酸氢钠溶液洗三次，饱和食盐水溶液洗一次，有机层干燥后浓缩得到粘稠状淡黄色液体，经硅胶柱层析，乙酸乙酯/石油醚(16％
–
50％)洗脱，得到3-val-ppd和c-20位脱水的3-val-ppd原人参二醇缬氨酸衍生物。
[0012]
c,将纯化过后的3-val-ppd和c-20位脱水的3-val-ppd原人参二醇缬氨酸衍生物溶于乙酸乙酯中，加入hcl的乙酸乙酯溶液，析出沉淀，抽滤，得到原人参二醇缬氨酸衍生物盐酸盐。
[0013]
本发明公开了原人参二醇衍生物能提高单克隆抗体pd-1/pdl-1的抑瘤效果。
[0014]
本发明同时发现所述原人参二醇衍生物在小鼠体内具有明显的抑瘤效果，与pd1/pdl1联用时抑瘤效果显著增加。
[0015]
本发明使用原人参二醇衍生物与pd1/pdl1联用，使用动物非小细胞肺癌模型，验证原人参二醇衍生物的抗癌效果。原人参二醇衍生物剂量为50mg/kg，pdl1/pdl2的剂量为10mg/kg。
[0016]
本发明提供一种原人参二醇衍生物的制备方法，及其在制备治疗抗癌药物中的应用。
附图说明
[0017]
图1是3-val-ppd的核磁共振氢谱(溶剂：cd3cl3)。
[0018]
图2是3-val-ppd的质谱(esi-ms)。
[0019]
图3是c20-dehydrated 3-val-ppd的质谱(esi-ms)。
[0020]
图4是3,12-val-ppd的质谱(esi-ms)。
[0021]
图5是处死后解剖肿瘤大小及重量
[0022]
图6是各组生存期
具体实施方式
[0023]
下面的实施例用以解释本发明，但是并非对本发明实质内容的限制。
[0024]
实施例1.boc保护的原人参二醇缬氨酸酯的制备
[0025][0026]
将1.89g boc保护的缬氨酸溶于40ml的py中，随后将1.66g edci加入其中，在室温下活化半个小时后，随后依次加入0.80g dmap、1g原人参二醇，添加完毕后升温至40℃进行反应。反应10个小时后，减压浓缩反应液，除去部分吡啶，剩余粘稠物加入50ml ea，然后用50ml 10％稀盐酸洗2次，50ml饱和na2co3溶液洗2次，40ml饱和食盐水洗一次，有机层无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩，得到黄色固体1.8g。
[0027]
实施例2.原人参二醇缬氨酸酯的制备
[0028][0029]
将0.8g上一步中得到的固体溶于6ml甲苯和4.5ml异丙醇混合溶剂中，置换氩气保护，降温到-10℃后滴加0.2ml甲磺酸，50℃下反应八个小时后，加入10ml ea，随后10ml饱和碳酸钠溶液洗三次，10ml饱和食盐水洗一次，有机层无水硫酸钠干燥。抽滤，减压浓缩，得到粗品0.6g，经硅胶柱层析，乙酸乙酯/石油醚(16％
–
50％)洗脱，得到3-val-ppd原人参二醇缬氨酸衍生物0.3g，收率为44％，和c
20
位脱水的3-val-ppd原人参二醇缬氨酸衍生物0.35g。收率为50％。
[0030]
实施例3.原人参二醇缬氨酸酯盐酸盐的制备
[0031][0032]
将纯化过后的0.3g 3-val-ppd和c
20
位脱水的0.35g 3-val-ppd原人参二醇缬氨酸衍生物溶于乙酸乙酯中，加入hcl的乙酸乙酯溶液，析出沉淀，抽滤，得到相对应的原人参二醇缬氨酸衍生物盐酸盐0.3g和c
20
位脱水的原人参二醇缬氨酸衍生物0.35g。
[0033]
3-val-ppd氢谱和质谱数据如下：
[0034]1h-nmr(600mhz,cdcl3):δ5.17(t,j＝7.2hz,1h),4.53(dd,j1＝11.6hz,j2＝4.9hz,1h),3.60(td,j1＝10.4hz,j2＝5.2hz,1h),3.33-3.26(m,1h),2.17(s,1h),2.14-1.99(m,4h),1.91-1.80(m,2h),1.70(s,3h),1.64(s,3h),1.58-1.38(m,7h),1.33-1.24(m,6h),1.20(s,3h),1.16-1.06(m,3h),1.03-0.98(m,6h),0.92-0.86(m,15h).esi-ms(m/z):560.5[m h]

.
[0035]
c
20-dehydrated 3-val-ppd：esi-ms(m/z):542.4[m h]

.
[0036]
3,12-dival-ppd：esi-ms(m/z):659.6[m h]

.
[0037]
效果实施例1.原人参二醇及其衍生物的抗癌效果
[0038]
1.1材料
[0039]
1.1.1细胞培养
[0040]
lewis鼠源性肺腺癌细胞(llc)，购自自中国医学科学院细胞培养中心(cell culture centerof chinese academy of medical sciences；cams；中华人民共和国，北京)。90％的dmem培养基(dulbecco's modified eagle's medium，gibco brl,usa)，10％fbs胎牛血清(fetal bovine serum，gibco brl,usa),在含有5％co2、95％o2的恒温恒湿37℃培养箱中培养。每隔2到3天更换培养液一次或根据细胞密度判定是否传代。
[0041]
1.1.2实验动物
[0042]
采用健康spf级雌性c57bl/6小鼠，购自中华人民共和国北京cams的实验动物科学研究院(institute of laboratoryanimal science)，50只，6周龄。用无菌水和北京keaoxieli啮齿动物饲料(合格)自由(ad libitum)进行喂养。在开始实验前使所有动物适应环境一周。
[0043]
1.2方法
[0044]
1.2.1肿瘤细胞接种
[0045]
c57bl/6小鼠适应性喂养1周，llc细胞数量足够后，进行接种造模。将100ul的5
×
10^5个/ml llc细胞皮下注射到小鼠右侧腋下，接种当天为第0天。
[0046]
1.2.2实验分组及给药
[0047]
将接种成功的50只c57bl/6小鼠随机分为5组，每组10只，通过剪脚趾进行编号。分组后，每组每日均正常饲养。实验动物分组如下：
[0048]
(1)模型组(组4)：10mg igg抗体溶于10ml buffer中，即1000ug/ml，每只小鼠腹腔注射0.2ml(200ug)，治疗第1,3,6,8,11天时腹腔注射0.2ml igg溶液。
[0049]
(2)pd-l1/pd-l2抗体组(组3)：50mg pd-l1抗体(鼠源pd-l1抗体，bioxcell)溶于50ml buffer中，即1000ug/ml，每只小鼠腹腔注射0.2ml(200ug)，治疗第1,3,6,8,11天时腹腔注射0.2ml pd-l1/pd-l2溶液。
[0050]
(3)原人参二醇衍生物(原人参二醇缬氨酸酯盐酸盐)单药组(组2)：治疗第1-12天，每天腹腔注射200ul，每天一次。
[0051]
(4)pd-l1/pd-l2 原人参二醇衍生物(原人参二醇缬氨酸酯盐酸盐)联合给药组(组1)：按上述两组给药时间和方式同时对小鼠进行给药。
[0052]
1.2.3肿瘤尺寸及重量评估
[0053]
从给药当天开始，每天称量一次小鼠重量，并用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径来测量试验动物的肿瘤大小，并通过下式计算。
[0054]
肿瘤大小＝长径*短径*短径2
[0055]
1.2.4给药完成后进行处死，并解剖肿瘤进行称量统计。
[0056]
1.3数据处理
[0057]
1.3.1处死后解剖肿瘤大小，对肿瘤重量原始数据统计如下表：
[0058][0059]
图5为小鼠肿瘤大小与重量。
[0060]
1.3.2各组生存期如图6所示。
[0061]
1.4实验结果
[0062]
1.4.1与模型组相比，原人参二醇衍生物(10mg/kg/小鼠)对c57bl/6j小鼠非小细胞肺腺癌肿瘤具有显著抑制作用。
[0063]
1.4.2与模型组相比，原人参二醇衍生物(10mg/kg/小鼠)与pd-l1/pd-l2组合给药组对小鼠肿瘤的大小更具有显著性，确认了联合组肿瘤的显著抑制效果。
[0064]
由以上发现，当给予pd-l1/pd-l2抗体时，通过组合使用原人参二醇衍生物，通过两者的协同效应验证了c57bl/6j小鼠肿瘤的显著抑制作用。