用于治疗冠状病毒的融合蛋白及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及用于治疗冠状病毒的融合蛋白及其应用。
2.背景
3.冠状病毒为不分节段的单股正链rna病毒，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属，由于病毒包膜上有向四周伸出的突起，形如花冠而得名。2019年发现的新型冠状病毒(sars-cov-2或2019-ncov)属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。目前研究显示，sars-cov-2与sars-cov具有高度同源性。
4.新型冠状病毒肺炎covid-19主要通过呼吸道传染，其也可能通过接触传播。人群普遍易感，老年人及有基础疾病者感染后病情较重，儿童及婴幼儿也有发病。基于目前的流行病学调查，新型冠状病毒的潜伏期一般为1-14天，大多数在3-7天。感染者的主要临床症状是发热、乏力、干咳，而鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。在发病早期，患者的白细胞总数正常或降低，或淋巴细胞数目减少，部分患者出现肝酶、肌酶和肌红蛋白增高的现象。胸部影像显示患者早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显；进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影，严重者可出现肺实变，并逐渐出现呼吸困难，严重者发生急性呼吸窘迫综合征(ards)、休克以及肺组织、心脏、肾脏多种组织损伤和功能障碍。多数轻度感染患者预后良好，重度患者病情常常危重，甚至死亡。
5.近期，有关covid-19的基础、临床及流行病学研究不断发表或者公布，然而仍然缺乏有效的治疗性药物。


技术实现要素：

6.本发明提供一种融合蛋白。融合蛋白中抗体部分或抗原结合片段对sars-cov和sars-cov-2的spike蛋白具有高亲和力，这些抗体可以特异性结合spike蛋白；融合蛋白中多肽可干扰“六螺旋束(6-hb)”的形成。本发明融合蛋白可阻止病毒颗粒和细胞膜融合以及可以介导免疫细胞吞噬、清除病毒颗粒。这些融合蛋白可用于治疗或改善sars和covid-19，也可以用于诊断sars和covid-19。
7.病毒颗粒首先通过其表面的spike蛋白(s蛋白或棘突蛋白)的s1亚基与肺上皮细胞表面的一种称为血管紧张素转化酶2(ace2)进行结合。病毒与受体结合并被蛋白酶水解之后，位于s蛋白n端的s2亚基暴露，并嵌入浆膜或者内吞体膜中。s2亚基中的hr2(heptad repeated 2)结构域与s2亚基中的hr1(heptad repeated 1)结构域结合，形成6-hb融合核心，导致病毒外壳与细胞膜融合，sars-cov或sars-cov-2进入细胞内，并利用细胞为其合成新的病毒颗粒；新的病毒颗粒释放到细胞外，再利用同样的方式侵染周围正常的细胞。融合蛋白中抗体能阻断spike蛋白与ace2的结合，多肽部分阻止了病毒外壳与细胞膜的融合，进而阻断了病毒进入细胞，发挥抗病毒作用；融合蛋白中抗体部分还可介导免疫细胞吞噬和清除病毒。
8.一些实施方案中提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以
及多肽，所述抗体或抗原结合片段特异性结合spike蛋白，并且包含：a)vh cdr1，其包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(b)vh cdr2，其包含如seq id no:2所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(c)vh cdr3，其包含如seq id no:3-38或105中任一项所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；
9.所述抗体或抗原结合片段的c-末端或n-末端通过连接子与多肽进行连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸。
10.一些实施方案中提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述抗体或抗原结合片段特异性结合spike蛋白，并且包含：(a)vh cdr1，其包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(b)vh cdr2，其包含如seq id no:2所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和(c)vh cdr3，其包含如seq id no:3-38或105中任一项所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；
11.所述抗体或抗原结合片段的c-末端或n-末端通过连接子与多肽进行连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸。
12.一些实施方案中提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述抗体或抗原结合片段特异性结合spike蛋白，并且包含：
13.(a)vh cdr1，其包含如seq id no:1所示的氨基酸序列；(b)vh cdr2，其包含如seq id no:2所示的氨基酸序列；和(c)vh cdr3，其包含如seq id no:3-38或105中任一项所示的氨基酸序列；
14.所述抗体或抗原结合片段的c-末端或n-末端通过连接子与多肽进行连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸。
15.一些实施方案中提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述抗体或抗原结合片段特异性结合spike蛋白，并且包含：(a)vh cdr1，其包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(b)vh cdr2，其包含如seq id no:2所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(c)vh cdr3，其包含如seq id no:3-38或105中任一项所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(d)vl cdr1，其包含如seq id no:39所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(e)vl cdr2，其包含如seq id no:40所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(f)vl cdr3，其包含如seq id no:41所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；
16.所述抗体或抗原结合片段的c-末端或n-末端通过连接子与多肽进行连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸。
17.在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述抗体或抗原结合片段特异性结合spike蛋白，并且包含：(a)vh cdr1，其包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(b)vh cdr2，其包含如seq id no:2所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(c)vh cdr3，其包含如seq id no:3-38或105中任一项所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(d)vl cdr1，其包含如seq id no:39所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或
插入的变体；(e)vl cdr2，其包含如seq id no:40所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和(f)vl cdr3，其包含如seq id no:41所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；
18.所述抗体或抗原结合片段的c-末端或n-末端通过连接子与多肽进行连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸。
19.在一些实施方案中，所述取代变体为保守氨基酸取代变体。
20.在一些实施方案中，所述连接子的序列为(g
m
s)
n
，其中每个m独立为2、3、4或5，n为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(ggggs)
n
，所述n为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子为ggggs。在一些实施方案中，所述连接子为(ggggs)2。在一些实施方案中，所述连接子为(ggggs)3。在一些实施方案中，所述连接子为(ggggs)4，如seq id no:59所示。在一些实施方案中，所述连接子为(ggggs)5。
21.在一些实施方案中，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列，与seq id no:58所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:58所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少90％同一性为至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，一或多个保守氨基酸取代为约1个、约2个或约3个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
22.在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述融合蛋白包括以下特征：
23.所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:3-38或105所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3中的一个、两个、三个、四个、五个或全部；和/或
24.所述抗体或抗原结合片段的c-末端通过连接子与多肽进行连接，所述抗体或抗原结合片段的c-末端为抗体或抗原结合片段中重链部分的c-末端或轻链部分的c-末端；和/或
25.所述连接子的序列为(ggggs)
n
，所述n为1、2、3、4或5；和/或
26.所述多肽包含如seq id no:58所示的序列，与seq id no:58所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:58所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
27.在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述融合蛋白包括以下特征：
28.所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:3-38或105中任一项所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3；和/或
29.所述抗体或抗原结合片段的c-末端通过连接子与多肽进行连接，所述抗体或抗原结合片段的c-末端为抗体或抗原结合片段中重链部分的c-末端或轻链部分的c-末端；和/
cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:27所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
57.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:28所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
58.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:29所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
59.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:30所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
60.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:31所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
61.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:32所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
62.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:33所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
63.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:34所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
64.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:35所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
65.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:36所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
66.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:37所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
67.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:38所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
68.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:1所示的vh cdr1、如seq id no:2所示的vh cdr2、如seq id no:105所示的vh cdr3、如seq id no:39所示的vl cdr1、如seq id no:40所示的vl cdr2和如seq id no:41所示的vl cdr3。
69.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链fr1包含seq id no:42所示
的序列，与seq id no:42所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:42所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
70.所述抗体或抗原结合片段的重链fr2包含seq id no:43所示的序列，与seq id no:43所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:43所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
71.所述抗体或抗原结合片段的重链fr3包含seq id no:44所示的序列，与seq id no:44所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:44所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
72.所述抗体或抗原结合片段的重链fr4包含seq id no:45所示的序列，与seq id no:45所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:45所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；
73.所述重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4为重链可变区的框架区。
74.在一些实施方案中，所述重链fr1包含seq id no:42所示的序列，与seq id no:42所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:42所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述重链fr2包含seq id no:43所示的序列，与seq id no:43所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:43所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述重链fr3包含seq id no:44所示的序列，与seq id no:44所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:44所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述重链fr4包含seq id no:45所示的序列，与seq id no:45所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:45所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少90％同一性为至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，一或多个保守氨基酸取代为约1个、约2个或约3个保守氨基酸取代。
75.在一些实施方案中，所述重链fr1包含seq id no:42所示的序列，所述重链fr2包含seq id no:43所示的序列，所述重链fr3包含seq id no:44所示的序列，所述重链fr4包含seq id no:45所示的序列。
76.在一些实施方案中，所述重链可变区包含结构fr1-vh cdr1-fr2-vh cdr2-fr3-vh cdr3-fr4。
77.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:46-49或107任一项所示的序列，与seq id no:46-49或107中任一项所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:46-49或107中任一项所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
78.在一些实施方案中，至少80％同一性为至少约80％同一性、至少约81％同一性、至少约83％同一性、至少约84％同一性、至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
79.在一些实施方案中，一或多个保守氨基酸取代为约1个、约2个、约3个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约12个、约13个、约14个、约15个、约17个、约18个、约19个、约20个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
80.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:50所示的序列，与seq id no:50所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:50所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
81.在一些实施方案中，至少80％同一性为至少约80％同一性、至少约81％同一性、至少约83％同一性、至少约84％同一性、至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
82.在一些实施方案中，一或多个保守氨基酸取代为约1个、约2个、约3个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约12个、约13个、约14个、约15个、约17个、约18个、约19个、约20个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
83.一些实施方案中提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述抗体或抗原结合片段特异性结合spike蛋白，并且包含：a)vh cdr1，其包含如seq id no:60所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(b)vh cdr2，其包含如seq id no:61所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(c)vh cdr3，其包含如seq id no:62-97或106中任一项所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；
84.所述抗体或抗原结合片段的c-末端或n-末端通过连接子与多肽进行连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸。
85.一些实施方案中提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述抗体或抗原结合片段特异性结合spike蛋白，并且包含：
86.(a)vh cdr1，其包含如seq id no:60所示的氨基酸序列；(b)vh cdr2，其包含如seq id no:61所示的氨基酸序列；和(c)vh cdr3，其包含如seq id no:62-97或106中任一项所示的氨基酸序列；
87.所述抗体或抗原结合片段的c-末端或n-末端通过连接子与多肽进行连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸。
88.一些实施方案中提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述抗体或抗原结合片段特异性结合spike蛋白，并且包含：(a)vh cdr1，其包含如seq id no:60所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(b)vh cdr2，其包含如seq id no:61所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(c)vh cdr3，其包含如seq id no:62-97或106中任一项所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(d)vl cdr1，其包含如seq id no:98所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；(e)vl cdr2，其包含如seq id no:99所示的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(f)vl cdr3，其包含如seq id no:100所示
的氨基酸序列，或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；
89.所述抗体或抗原结合片段的c-末端或n-末端通过连接子与多肽进行连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸。
90.在一些实施方案中，所述取代变体为保守氨基酸取代变体。
91.在一些实施方案中，所述连接子的序列为(g
m
s)
n
，其中每个m独立为2、3、4或5，n为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(ggggs)
n
，所述n为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子为ggggs。在一些实施方案中，所述连接子为(ggggs)2。在一些实施方案中，所述连接子为(ggggs)3。在一些实施方案中，所述连接子为(ggggs)4，如seq id no:59所示。在一些实施方案中，所述连接子为(ggggs)5。
92.在一些实施方案中，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列，与seq id no:58所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:58所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少90％同一性为至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，一或多个保守氨基酸取代为约1个、约2个或约3个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
93.在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述融合蛋白包括以下特征：
94.所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:62-97或106中任一项所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3中的一个、两个、三个、四个、五个或全部；和/或
95.所述抗体或抗原结合片段的c-末端通过连接子与多肽进行连接，所述抗体或抗原结合片段的c-末端为抗体或抗原结合片段中重链部分的c-末端或轻链部分的c-末端；和/或
96.所述连接子的序列为(ggggs)
n
，所述n为1、2、3、4或5；和/或
97.所述多肽包含如seq id no:58所示的序列，与seq id no:58所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:58所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
98.在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体或抗原结合片段以及多肽，所述融合蛋白包括以下特征：
99.所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:62-97或106中任一项所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3；和/或
100.所述抗体或抗原结合片段的c-末端通过连接子与多肽进行连接，所述抗体或抗原结合片段的c-末端为抗体或抗原结合片段中重链部分的c-末端或轻链部分的c-末端；和/或
101.所述连接子的序列为(ggggs)
n
，所述n为1、2、3、4或5；和/或
102.所述多肽包含如seq id no:58所示的序列，与seq id no:58所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:58所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
103.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:62-97或106中任一项所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
104.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:62所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
105.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:63所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
106.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:64所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
107.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:65所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
108.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:66所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
109.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:67所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
110.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:68所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
111.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:69所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
112.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:70所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
113.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no71所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
114.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:72所示的vh cdr3、如seq id no:98所
示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
115.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:73所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
116.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:74所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
117.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:75所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
118.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:76所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
119.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:77所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
120.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:78所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
121.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:79所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
122.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:80所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
123.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:81所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
124.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:82所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
125.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:83所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
126.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:84所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
127.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:85所示的vh cdr3、如seq id no:98所
示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
128.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:86所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
129.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:87所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
130.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:88所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
131.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:89所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
132.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:90所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
133.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:91所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
134.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:92所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
135.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:93所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
136.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:94所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
137.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:95所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
138.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:96所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
139.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:97所示的vh cdr3、如seq id no:98所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
140.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含如seq id no:60所示的vh cdr1、如seq id no:61所示的vh cdr2、如seq id no:106所示的vh cdr3、如seq id no:98
所示的vl cdr1、如seq id no:99所示的vl cdr2和如seq id no:100所示的vl cdr3。
141.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链fr1包含seq id no:101所示的序列，与seq id no:101所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:101所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
142.所述抗体或抗原结合片段的重链fr2包含seq id no:102所示的序列，与seq id no:102所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:102所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
143.所述抗体或抗原结合片段的重链fr3包含seq id no:103所示的序列，与seq id no:103所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:103所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
144.所述抗体或抗原结合片段的重链fr4包含seq id no:104所示的序列，与seq id no:104所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:104所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；
145.所述重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4为重链可变区的框架区。
146.在一些实施方案中，所述重链fr1包含seq id no:101所示的序列，所述重链fr2包含seq id no:102所示的序列，所述重链fr3包含seq id no:103所示的序列，所述重链fr4包含seq id no:104所示的序列。
147.在一些实施方案中，所述重链可变区包含结构fr1-vh cdr1-fr2-vh cdr2-fr3-vh cdr3-fr4。
148.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:46-49或107任一项所示的序列，和/或所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:50所示的序列。
149.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:46所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:50所示的序列。
150.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:47所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:50所示的序列。
151.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:48所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:50所示的序列。
152.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:49所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:50所示的序列。
153.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含seq id no:107所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含seq id no:50所示的序列。
154.在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、fc区或其组合。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其片段是igg、igm、iga、ige或igd其中一种同种型。在一些实施方案中，同种型是igg1、igg2、igg3或igg4。没有限制地，抗体或抗原结合片段是嵌合抗体、人源化抗体或是全人源抗体。在某一方面，抗体或抗原结合片段是人源化抗体。
155.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为分离的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为scfv、fab、f(ab)2或igg。在一些实施方案中，
所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体。
156.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:51所示的序列，与seq id no:51所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:51所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
157.所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:52所示的序列，与seq id no:52所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:52所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
158.在一些实施方案中，至少80％同一性为至少约80％同一性、至少约81％同一性、至少约83％同一性、至少约84％同一性、至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，一或多个保守氨基酸取代为约1个、约2个、约3个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约12个、约13个、约14个、约15个、约17个、约18个、约19个、约20个、约22个、约24个、约25个、约27个、约30个、约32个、约33个、约36个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
159.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:51所示的序列，和/或所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:52所示的序列。
160.在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:51所示的序列，所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含氨基酸序列如seq id no:52所示的序列。
161.在一些实施方案中提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括以下特征：
162.所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:53-56或108中任一项所示的序列，与seq id no:53-56或108中任一项所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:53-56或108中任一项所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
163.所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列，与seq id no:57所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:57所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
164.抗体的重链的c-末端或轻链c-末端通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列，与seq id no:58所示序列具有至少90％或至少95％同一性的序列，或与seq id no:58所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的的氨基酸序列。
165.在一些实施方案中，至少80％同一性为至少约80％同一性、至少约81％同一性、至少约83％同一性、至少约84％同一性、至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，一或多个保守氨基酸取代为约1个、约2个、约3个、约5个、约6个、约7个、
约8个、约9个、约10个、约12个、约13个、约14个、约15个、约17个、约18个、约19个、约20个、约22个、约24个、约25个、约27个、约30个、约32个、约33个、约36个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
166.在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体以及通过连接子连接的多肽，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:53所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列；抗体的重链的c-末端(即ch3末端)或轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
167.在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体以及通过连接子连接的多肽，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:54所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列；抗体的重链的c-末端(即ch3末端)或轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
168.在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体以及通过连接子连接的多肽，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:55所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列；抗体的重链的c-末端(即ch3末端)或轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
169.在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体以及通过连接子连接的多肽，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:56所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列；抗体的重链的c-末端(即ch3末端)或轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
170.在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体以及通过连接子连接的多肽，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:108所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列；抗体的重链的c-末端(即ch3末端)或轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
171.在一些实施方案中，融合蛋白包含2条相同重链和2条相同轻链，重链的c-末端通过连接子共价连接所述多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含2条相同重链和2条相同轻链，轻链的c-末端通过连接子共价连接所述多肽。
172.在一些实施方案中，所述融合蛋白中抗体部分或抗原结合片段可以特异性结合spike蛋白，并阻止sars-cov或sars-cov-2病毒颗粒和细胞结合，以及介导免疫细胞吞噬、清除病毒颗粒。在一些实施方案中，所述融合蛋白中抗体或抗原结合片段体可以特异性结合spike蛋白中s1亚基。
173.本发明还提供了一种编码所述的融合蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子为分离的核酸分子。
174.本发明还提供了一种包含所述的核酸分子的载体。在一些实施方案中，所述载体为分离的载体。
175.本发明还提供了一种包含所述的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为分离的宿主细胞。
176.本发明还提供了一种包含所述的载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为分离的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为cho细胞、293细胞，cos1细胞，cos7细胞，cv1细胞，鼠l细胞。
177.本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。
178.本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于治疗或改善sars或covid-19的方法，所述方法包括向患者施用有效剂量的所述的融合蛋白。在一些实施方案中，提供了所述的融合蛋白在治疗或改善sars或covid-19中的应用。在一些实施方案中，提供了所述的融合蛋白在制备用于治疗或改善sars或covid-19的药物中的应用。
179.本发明还提供了诊断方法和用途。在一些实施方案中，提供了检测样品中sars-cov或sars-cov-2表达的方法，使样品与所述的融合蛋白进行接触，使得所述融合蛋白中抗体或抗原结合片段结合spike蛋白，并检测其结合，即样品中spike蛋白的含量。在一些实施方案中，提供了在制备用于诊断sars或covid-19的试剂盒中的应用。在一些实施方案中，提供了一种包含所述融合蛋白的诊断试剂盒。
180.本发明提供了用于治疗冠状病毒的融合蛋白，融合蛋白中多肽与抗体部分或抗原结合片段协同阻止sars-cov或sars-cov-2病毒颗粒和细胞融合，以及介导免疫细胞吞噬、清除病毒颗粒，治疗sars或covid-19；本发明融合蛋白中抗体或抗原结合片段还可以用于诊断检测患者是否感染sars-cov或sars-cov-2。
附图说明
181.图1为部分本发明抗spike蛋白的抗体在elisa实验中抑制sars-cov-2与ace2结合的曲线图，图中横坐标表示浓度，纵坐标表示od值；其中，1表示抗体1，7表示抗体7，8表示抗体8，9表示抗体9，12表示抗体12，18表示抗体18，19表示抗体19，20表示抗体20，21表示抗体21，22表示抗体22。
182.术语
183.除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。
184.定义
185.应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
186.术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生
redundant；genbank embl ddbj pdb genbankcdstranslations swissprotein spupdate pir。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同一性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。
193.多聚核苷酸是由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)，或当多聚核苷酸是rna时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(u)。“多聚核苷酸序列”可以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。
194.术语“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核糖酶、cdna、dsrna、sirna、mirna、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
195.术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。
[0196]“抗体”、“抗原结合片段”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。抗体和抗原结合片段包括但不局限实施例所述的重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(cdr)、重链可变区(vh)、轻链可变区(vl)、重链恒定区(ch)、轻链恒定区(cl)、框架区(fr)或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。cdr区包括轻链的cdr区(vl cdr1-3)和重链的cdr区(vh cdr1-3)。可变区可包含结构fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
[0197]
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的一部分，例如f(ab’)2、f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗原结合片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
[0198]“单链可变片段”或“scfv”是指免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接vh的n端和vl的c端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。scfv分子通常是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
[0199]
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些
亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为igg、igm、iga、igg或ige。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、igg5等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。在一些实施方案中，免疫球蛋白分子为igg种类。igg通常包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链通过二硫键以“y”构型连接，其中轻链从“y”口开始并延续通过可变区包围重链。
[0200]
本发明公开的抗体、抗原结合片段、或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性，全人源、人源化、灵长类化、嵌合抗体，单链抗体、表位结合片段例如fab、fab'和f(ab')2、fd、fvs、单链fvs(scfv)，二硫键连接的fvs(sdfv)，包含vk或vh结构域的片段，或由fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗id)抗体。本发明公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如igg、ige、igm、igd、iga和igy)或种类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或者亚类。
[0201]
轻链可以分为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤，b细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从y构型的叉状末端的n末端延伸至每条链底部的c末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为v
λ
。
[0202]
轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能被使用。轻链(vl)和重链(vh)链部分的可变区决定了抗原识别和特异性。轻链和重链的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。n端部分是可变区，c端部分是恒定区；ch3和cl结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
[0203]
如上所述，可变区使得抗体能够选择性识别和特异性结合抗原上的表位。具体而言，抗体的vl结构域和vh结构域或互补决定区(cdr)的子集结合形成了限定三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成存在于y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由vh和vl链中各自的三个cdr(即vh cdr1、vh cdr2、vh cdr3、vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3)定义。在某些情况下，例如某些来源于骆驼科动物的免疫球蛋白分子或基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，没有轻链。例如参见hamers-casterman et al.，nature，363:446-448(1993)。
[0204]
在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“cdr”是形成抗原结合结构域的短的、非连续的与抗原特异性结合的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“构架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。构架区大部分采用β-折叠构象，cdr形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使cdr定位在正确的方位上。具有特定位置的cdr的抗原结合域形成了与抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其抗原表位的非共价结合。对于给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以通过已知方法鉴定出包含cdr和框架区的氨基酸(参见kabat,e.,et al.,u.s.department of health and human services,sequences of proteins of immunological interest,(1983)和chothia and lesk,j.mol.biol.,196:
901-917(1987))。
[0205]
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“cdr”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在kabat et al.,u.s.dept.of health and human services.，，，，,sequences of proteins of immunological interest(1983)和chothia等在j.mol.biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过引用全部并入本文。
[0206]
根据kabat和chothia定义的cdr包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的cdr都在本发明范围内。包含特定cdr的确切残基编号将根据cdr的序列和大小而变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定出cdr包含哪些特定的残基。
[0207]
kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依赖于序列本身以外的其他实验数据将该“kabat编号”系统应用到任何可变区序列。“kabat编号”是指由kabat et al.,u.s.dept.of health and human services在“sequenceofproteinsof immunological interest”(1983)提出的编号系统。抗体还可以用eu编号系统。
[0208]
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。
[0209]“重链恒定区”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包括ch1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域，或变体或片段中的至少一种。例如，本发明公开的抗体或抗原结合片段包含ch1结构域；包含ch1结构域、至少一部分铰链区以及ch2结构域；包含ch1结构域和ch3结构域；包含ch1结构域以及至少一部分铰链区以及ch3结构域；或包含ch1结构域、至少一部分铰链区以及ch2结构域和ch3结构域。在另一实施方案中，本发明公开的抗体或抗原结合片段包含ch3结构域。此外，本发明中使用的抗体或抗原结合片段可能缺部分或全部ch2结构域。如上所述，本领域普通技术人员应当理解，重链恒定区可以被修饰从而使得它们天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列发生变化。
[0210]
抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自igg1分子的ch1结构域和源自igg3分子的铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自igg1分子和部分源自igg3分子的铰链区。在另一实施方案中，部分重链可以包括部分源自igg1分子和部分源自igg4分子的嵌合铰链区。
[0211]“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的cl结构域和重链的ch1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
[0212]
如上所述，各种免疫球蛋白种类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。“vh结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，“ch1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。ch1结构域与vh结构域相邻，并且是免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。ch2结构域不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然igg分子的
两个ch2结构域之间插入两个n-连接的分支碳水化合物链。还有文献记载，ch3结构域从ch2结构域开始延伸到igg分子的c-末端，大约包含108个残基。“铰链区”包括连接ch1结构域和ch2结构域的部分重链区域。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个n端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(rouxetal.,j.immunol161:4083(1998))。
[0213]“二硫键”指两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸的硫醇基团可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接。在大多数天然存在的igg分子中，ch1和cl区通过二硫键连接，两条重链通过两个二硫键在kabat编号系统中对应的位置239和242(eu编号系统位置226和229)处相连接。
[0214]“嵌合抗体”指其可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施方案中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区来自人源。
[0215]“特异性结合”或“对
……
具有特异性”通常是指抗体或抗原结合片段与特定抗原通过其抗原结合结构域与表位互补性结合形成相对稳定的复合物。“特异性”可以用抗体或抗原结合片段与特定抗原或表位结合的相对亲和力表达。例如，如果抗体“a”比抗体“b”与同一抗原的相对亲和力大，可以认为抗体“a”比抗体“b”对该抗原具有更高的特异性。特异性结合可以用平衡解离常数(kd)来描述，较小的kd意味着较紧密的结合。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振、生物膜层光学干涉测量法等。“特异性结合”spike蛋白的抗体包括与spike蛋白平衡解离常数kd小于或等于约100nm、小于或等于约10nm、小于或等于约5nm、小于或等于约1nm或小于或等于约0.5nm的抗体。
[0216]“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的患者包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。
[0217]“患者”指需要诊断、预后或治疗的任何哺乳动物，包括人类、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠、马、牛等。
[0218]
融合蛋白
[0219]
本发明提供了融合蛋白。融合蛋白中抗体部分或抗原结合片段对sars-cov和sars-cov-2的spike蛋白具有高亲和力，这些抗体可以特异性结合spike蛋白；融合蛋白中多肽可干扰“六螺旋束(6-hb)”的形成。受测抗体表现出有效的结合活性，并可用于治疗和诊断用途。比如，这些抗体或抗原结合片段可以阻止sars-cov和sars-cov-2病毒颗粒和细胞膜融合，以及介导免疫细胞吞噬、清除病毒颗粒。
[0220]
因此，本发明公开的一个实施方案提供了融合蛋白。融合蛋白包括抗spike蛋白的抗体或抗原结合片段，以及连接子、多肽。
[0221]
本发明实施方案公开的融合蛋白的序列见表1，其中序列包括抗体或抗原结合片
段的cdr区、fr区、重链和轻链恒定区、重链和轻链可变区，以及连接子和多肽等；关于抗体或抗原结合片段的cdr区、fr区划分也可按照kabat定义来划分，如表2。
[0222]
在一些实施方案中年，本发明公开的融合蛋白包括多肽以及抗体或抗原结合片段，抗体的重链的c-末端或轻链c-末端通过连接子(如seq id no:59所示的)与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列，与seq id no:58所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:58所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0223]
在一些实施方案中，本发明公开的融合蛋白包括多肽以及抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如seq id no:46、47、48、49或107所示的vh、如seq id no:50所示的vl或其各自的生物学等价物。vh或vl的生物学等价物是包含特定氨基酸的序列，即该序列总体具有约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％的序列同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
[0224]
在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体以及通过连接子连接的多肽，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:53所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列；抗体的重链的c-末端(即ch3末端)或轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
[0225]
在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体以及通过连接子连接的多肽，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:54所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列；抗体的重链的c-末端(即ch3末端)或轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
[0226]
在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体以及通过连接子连接的多肽，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:55所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列；抗体的重链的c-末端(即ch3末端)或轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
[0227]
在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体以及通过连接子连接的多肽，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:56所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列；抗体的重链的c-末端(即ch3末端)或轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
[0228]
在一些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体以及通过连接子连接的多肽，所述抗体的重链包含氨基酸序列如seq id no:108所示的序列，所述抗体的轻链包含氨基酸序列如seq id no:57所示的序列；抗体的重链的c-末端(即ch3末端)或轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
[0229]
在一些实施方案中，抗体的重链的c-末端(即ch3末端)连接子与多肽进行共价连接。在一些实施方案中，抗体的轻链c-末端(即cl末端)通过连接子与多肽进行共价连接。
[0230]
在一些实施方案中，抗体的重链的c-末端(即ch3末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。在一些实施方案中，抗体的轻链c-末端(即cl末端)通过如seq id no:59所示的连接子与多肽进行共价连接，所述多肽包含如seq id no:58所示的序列。
[0231]
在一些实施方案中，融合蛋白例如其中抗体还可连接氨基酸序列或一个或多个修饰基团。例如，本发明公开的融合蛋白例如其中抗体可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性基团(例如peg、药物、毒素或标签)。
[0232]
本发明公开的融合蛋白例如其中抗体、抗原结合片段还包含被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体可以被糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
[0233]
在一些实施方案中，融合蛋白例如其中抗体可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或peg进行缀合。
[0234]
融合蛋白例如其中抗体可以与治疗剂缀合或融合，所述治疗剂可包括可检测标记，如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂、诊断剂、细胞毒性剂、超声增强剂、非放射性标记物及其组合物，和本领域已知的其它此类试剂。
[0235]
融合蛋白例如其中抗体可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗体的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
[0236]
编码抗体的多聚核苷酸和制备抗体的方法
[0237]
本发明还公开了编码本发明所述抗体、抗原结合片段、及其衍生物的多聚核苷酸或核酸分子。本发明公开的多聚核苷酸可以编码重链、轻链、重链可变区、轻链可变区、fc区、部分重链可变区或部分轻链可变区。制备抗体的方法是本领域公知的并且在本发明中有所描述。在某些实施方案中，本发明公开的抗体、抗原结合片段的可变区和恒定区都是全人源的。全人源抗体和抗原结合片段可以使用本领域中公开的技术和本发明所述的技术制备。例如，针对特定抗原的全人源抗体可以通过将抗原施用于转基因动物中来制备，所述转基因动物已经被改良过以响应抗原攻击而产生全人源抗体。可用于制备这种抗体的示例性技术参见美国专利6,458,592；6,420,140，其全部内容通过引用并入本文。
[0238]
在某些实施方案中，制备的抗体不会在待治疗的动物(例如人类)中引起有害的免疫应答。在一实施方案中，本发明公开的抗体、抗原结合片段、或衍生物使用本领域公认的技术修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以被人源化、灵长类化、去免疫化或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低。其可以通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人源的可变区移植到人源的恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(cdr)的至少一部分移植到人源的框架和恒定区中，保留或不保留关键的框架残基；或(c)移植整个非人源的可变区，但通过用类人源的部分置换表面残基从而“隐藏”它们。通常人框架区中的框架残基将被来自cdr供体抗体的相应残基取代，比如能够改善抗原
结合的残基。这些框架替换可以通过本领域公知的方法鉴定，例如通过模拟cdr和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合起重要作用的框架残基和通过序列对比以鉴定特定位置上异常的框架残基。(参考美国专利5,585,089；riechmann et al.,nature 332:323(1988)；其全部内容通过引用并入本文)。可以使用本领域公知的多种技术使抗体人源化，例如cdr移植(ep 239,400；wo 91/09967；美国专利5,225,539,5,530,101和5,585,089)，修复或者表面重排(ep592,106；ep519,596；padlan,et al.,molecular immunology 28(4/5):489-498(1991)；studnicka et al.,protein engineering 7(6):805-814(1994)；roguska,et al.,proc.natl.sci.usa 91:969-973(1994))，以及链的重排(美国专利5,565,332)，其全部内容通过引用并入本文。
[0239]
去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。在本发明中，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰t细胞表位(参见例如wo/9852976a1和wo/0034317a2)。例如，分析来自起始抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列，并产生来自每个可变区的人t细胞表位“图谱”，显示表位相对于互补决定区(cdrs)和序列内其它关键残基的位置。分析来自t细胞表位图的单个t细胞表位，以鉴定具有较低改变抗体活性风险的可选择的氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列可选的重链可变区序列和轻链可变区序列，随后将这些序列掺入到一系列结合多肽中。然后将包含修饰过的可变区和人类恒定区的完整重链和轻链的基因克隆到表达载体中，随后将质粒转入细胞系以产生完整的抗体。然后利用合适的生物化学和生物学实验中比较抗体，鉴定出最佳的抗体。
[0240]
本发明公开的融合蛋白中抗体、抗原结合片段的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、放射免疫实验(ria)或酶联免疫吸附实验(elisa)来检测。
[0241]
或者，用于生产单链单元的技术(美国专利4,694,778；bird,science 242:423-442(1988)、huston et al.,proc.natl.acad.sci.usa 55:5879-5883(1988)和ward et al.,nature334:544-554(1989))可适用于生产本发明公开的单链单元。通过氨基酸桥接fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性fv片段的技术(skerra et al.,science 242:1038-1041(1988))。
[0242]
可用于生产单链fv(scfv)和抗体的技术的实例包括如美国专利4,946,778和5,258,498，以及huston et al.,methods in enzymology 203:46-88(1991)、shu et al.,proc.natl.sci.usa 90:1995-1999(1993)和skerra et al.,science 240:1038-1040(1988)中所述。对于包括在人体内使用抗体和体外检测实验的某些用途，可以使用嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的一类分子，例如具有鼠源单克隆抗体的可变区和人源免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见morrison,science 229:1202(1985)；oi et al.,biotechniques 4:214(1986)；gillies et al.,j.immunol.methods 125:191-202(1989)；neuberger et al.,nature 372:604-608(1984)；takeda et al.,nature 314:452-454(1985)；和美国专利5,807,715、4,816,567和4,816,397，其全部内容通过引用并入本文。
[0243]
此外，在newman,biotechnology 10:1455-1460(1992)中公开了另一种生产重组抗体的高效方法，特别地，该技术能产生含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类抗体，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，该技术也在共同转让的美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中有所提及，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0244]
抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自免疫球蛋白序列的抗体文库进行的噬菌体展示方法。也可参考美国专利4,444,887和4,716,111，以及pct公布文本wo 98/46645、wo 98/50433、wo 98/24893、wo 98/16654、wo 96/34096、wo 96/33735和wo 91/10741，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0245]
对于治疗人类患者来说，全人源抗体是特别理想的。全人源抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，比如可以转基因小鼠来生产人源抗体，所述小鼠不能表达功能性内源性免疫球蛋白但能表达人类免疫球蛋白基因。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机引入或通过同源重组引入到小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人的可变区、恒定区和多样性区域引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链的免疫球蛋白基因可以通过同源重组分别或同时通过引入人免疫球蛋白基因座而丧失功能。例如，jh区域的纯合缺失可以防止内源抗体的产生。将修饰过的胚胎干细胞扩增并显微注射进囊胚中以产生嵌合小鼠。然后培育嵌合小鼠以产生表达人源抗体的纯合后代。用选择出的抗原例如全部或部分目标多肽靶点以常规方式免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得靶向抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在b细胞分化过程中重排，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术可以产生可用于治疗的igg、iga、igm和ige抗体。关于这种生产全人源抗体的技术相关综述，可以参见lonberg and huszar，int.rev.immunol.73:65-93(1995)。关于生产全人源抗体和人单克隆抗体的该技术的详细讨论和生产这种抗体的步骤，参见pct公布文本wo 98/24893、wo 96/34096、wo 96/33735，以及美国专利5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，其全部内容通过引用并入本文。
[0246]
也可以使用被称为“引导选择”的技术来生产识别选择性表位的全人源抗体。在该方法中，使用选择的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)来引导识别相同表位的全人源抗体的筛选(参见美国专利5,565,332，其全部内容通过引用并入本文)。
[0247]
在另一实施方案中，使用常规方法(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以分离编码所需单克隆抗体的dna并对其进行测序。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞可以作为此类dna的来源。一旦分离出来，dna可以被置于表达载体中，然后被转染到原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中。分离的dna(如本文所述可以是合成的)也可用于制备抗体的恒定区和可变区的序列，如美国专利5,658,570中所述，其全部内容通过引用并入本文。该方法从所选细胞中提取rna并转化成cdna，然后使用ig特异性引物通过pcr技术进行扩增。适于此目的的合适的探针在美国专利5,658,570中也有所提及。
[0248]
此外，使用常规重组dna技术，可将本发明的抗体的一个或多个cdr插入框架区，例如插入到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人类框架区(参见chothia et al.,j.mol.biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。一些多核苷酸可以编码框架区和cdr组合产生的与目标抗原的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，可以选择能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。
[0249]
通过使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述。在这方面，下文描述的适合本发明使用的技术参考current protocols in immunology,coligan et al.,eds.,green publishing associates and wiley-interscience,john wiley and sons,new york(1991)，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
[0250]
在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polya尾。其他元件包括增强子，kozak序列及插入序列两侧rna剪接的供体和受体位点。可以通过sv40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如rsv、htlv1、hivi及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pires1neo，pretro-off，pretro-on，plxsn，或者plncx，pcdna3.1( /-)，pcdna/zeo( /-)，pcdna3.1/hygro( /-)，psvl，pmsg，prsvcat，psv2dhfr，pbc12mi和pcs2等。常使用的哺乳动物细胞包括293细胞，cos1细胞，cos7细胞，cv1细胞，鼠l细胞和cho细胞等。
[0251]
在一些实施方案中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶，谷氨酰胺合成酶，新霉素抗性，潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。
[0252]
在一些实施方案中，质粒为pbat，其来源于经改造优化的pcdna3.1(-)，该质粒含有sv40早期启动子控制下的谷氨酰胺合成酶基因。转染成功细胞可以在添加msx(l-氨基亚砜蛋氨酸)不含谷氨酰胺的培养基中进行选择性培养，如cho等这些内源合成谷氨酰胺能力较弱的细胞无法生长，转染成功含目的基因的细胞正常生长。此筛选系统具有产量高、筛选过程快、稳定性高和扩大培养容易成功等优点，被广泛使用。
[0253]
在一些实施方案中，质粒pbat含有用于表达目的基因的rsv(劳斯肉瘤病毒)的强启动子和从人巨细胞病毒(cmv)的增强子片段。该质粒有方便目的基因插入的hindiii、ecori、bsiwi、pvui和noti等限制性内切酶识别位点。该质粒在这些克隆位点之后含有3’内含子和大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化及终止信号。其它高效启动子也可以用于表达，例如人β激动蛋白启动子、sv40早期或晚期启动子或来自于其它逆转录病毒，如hiv和htlvi的长末端重复强启动子。对于mrna的聚腺苷酸化，也可以使用其它基因的信号例如人生长激素或球蛋白基因的聚腺苷酸化信号。携带整合到染色体中的目的基因的稳定细胞系也可以通过用可选择标记如g418或潮霉素等抗性基因而进行选择。在开始时，可以使用g418加氨甲喋呤等一种以上的可选择标记。
[0254]
此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明所述抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和pcr介导的突变。变体(包括衍生物)编码相对于原重链可变区vh cdr1、vh cdr2、vh cdr3和轻链可变区vl cdr1、vl cdr2或vl cdr3来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的替换、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代或少于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列时随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。
[0255]
在一些实施方案中，本文所述取代为保守氨基酸取代。
[0256]
治疗方法
[0257]
本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于治疗或改善sars或covid-19的方法，所述方法包括向患者施用有效剂量的所述的融合蛋白。在一些实施方案中，提供了所述的融合蛋白在治疗或改善sars或covid-19中的应用。在一些实施方案中，提供了所述的融合蛋白在制备用于治疗或改善sars或covid-19的药物中的应用。在一些实施方案中，所述患者为疑似感染sars-cov或sars-cov-2病毒的患者。在一些实施方案中，所述患者为与sars-cov或sars-cov-2病毒携带者有接触的患者。在一些实施方案中，所述患者为确诊感染sars-cov或sars-cov-2病毒的患者。在一些实施方案中，所述患者为有轻微症状的患者。在一些实施方案中，所述患者为有严重症状的患者。在一些实施方案中，所述患者有发热，咳嗽，低血压，缺氧，和/或急性呼吸窘迫综合征(ards)。
[0258]
对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定融合蛋白或衍生物、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。
[0259]
融合蛋白或衍生物的施用方法包括但不限于真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外和口服注射。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明的融合蛋白的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。
[0260]
本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。
[0261]
施用方式可以是全身施用或局部施用。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管连接到如贮液囊(可以是ommaya贮液囊)来辅助注射。也可以通过肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及使用雾化的制剂。
[0262]
本发明的融合蛋白可以局部施用于需要治疗的区域；可以通过但不限于以下方式：手术期间局部输注，例如与手术后伤口敷料联合的局部应用，通过注射，通过导管，借助栓剂或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。
[0263]
在一些实施方案中，本发明组合物包含编码蛋白质的核酸或多聚核苷酸，可以通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分来体内施用所述核酸以促进其编码的蛋白质的表达，然后通过下述方式施用上述部分载体使其变为胞内部分，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；biolistic，dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或者通过与已知进入细胞
核的同源异型盒类肽连接施用(参见例如joliot et al.,1991,proc.natl.acad.sci.usa 88:1864-1868)等等。可选地，核酸可以通过同源重组在引入细胞内并整合至宿主细胞dna中用于表达。
[0264]
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白施用于患者的剂量为0.01mg/kg至100mg/kg患者体重，或0.1mg/kg至20mg/kg患者的体重。在初始剂量之后可随后给予第二剂或多剂该抗体或抗原结合片段，其剂量与初始剂量大致相同或较少，其中该随后的剂量可相隔至少1天至3天；或至少一星期。可以通过例如脂质化等修饰来增强抗体的摄取和组织穿透能力(例如进入脑内)，从而减少本发明抗体的施用的剂量和频率。
[0265]
通常在进行体外测试用于治疗疾病的方法，包括施用本发明所述融合蛋白或衍生物，然后在可接受的动物模型中体内测试期望的治疗性或预防性活性，最后施用于人体。合适的动物模型(包括转基因动物)是本领域普通技术人员所公知的。例如，用于证明本发明所述抗体、抗原结合片段、融合蛋白的治疗用途的体外测定包括抗体对细胞系或患者组织样品的影响。抗体、融合蛋白对细胞系和/或组织样品的作用可以利用本领域技术人员已知的技术进行检测，例如本发明其他部分公开的技术。根据本发明的内容，可用于确定是否施用特异性抗体、融合蛋白的体外测定实验包括体外细胞培养实验，其中患者组织样品在培养物中培养，并暴露于或以其他方式施用化合物，并观察这种化合物对组织样品的影响。
[0266]
各种已知输送系统可用于施用本发明融合蛋白或衍生物或其编码多核苷酸，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如wu and wu,1987,j.biol.chem.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。
[0267]
联合疗法
[0268]
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可以结合其它治疗或预防方案，包括施用一种或多种本发明的融合蛋白以及一种或多种其它治疗剂或方法一起使用或组合使用。对于组合治疗，融合蛋白可以与其它治疗剂可同时或分开施用。当分开施用时，可以在施用另一种其它治疗剂之前或之后施用本发明的融合蛋白。
[0269]
在一些实施方案中，与本发明融合蛋白联合用药的治疗剂至少为以下中的一种：hiv药物、抗疟药、rna聚合酶抑制剂、抗病毒药物和单抗类药。在一些实施方案中，hiv药物包括洛匹那韦/利托那韦，asc09/利托那韦和达芦那韦。在一些实施方案中，抗疟药包括氯喹，羟氯喹和磷酸氯喹。在一些实施方案中，rna聚合酶抑制剂包括瑞德西韦。在一些实施方案中，抗病毒药物包括阿比多尔、法匹拉韦。在一些实施方案中，单抗类药物包括bdb-001。在一些实施方案中，所述抗病毒药物为本发明所述融合蛋白中的抗体或抗原结合片段。
[0270]
一些新型冠状病毒肺炎重型或危重型患者存在细胞因子风暴现象，本发明融合蛋白可与阿达木单抗(adalimumab，例如及其生物类似物，如abrilada
tm
(adalimumab-afzb)，amjevita(adalimumab-att)，cyltezo
tm
(adalimumab-adbm)，hyrimoz
tm
(adalimumab-adaz)，hulio
tm
，(bat1406))或托珠单抗(tochilizumab,例如及其生物类似物，如bat1806)联合用于治疗，其可以减缓tnf-α表达上调导致的炎症反应。在一些实施方案中，本方法治疗的患者被确诊感染新型冠状病毒并且有一种或多种细胞因子(包括肿瘤坏死因子α(tnf-α)，ifn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-7、il-8、il-10、il-12p70、il-13、粒细胞集落刺激因子
(gscf)、干扰素诱导蛋白-10(ip-10)、单核细胞趋化蛋白-1(mcp1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(mip1a))增高。在一些实施方案中，本方法治疗的患者有tnf-α增高。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子高于正常水平至少50％。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子至少为正常水平的2倍、3倍或4倍。在一些实施方案中，本方法治疗前患者有发热，低血压，缺氧，和/或急性呼吸窘迫综合征(ards)。在一些实施方案中，本方法治疗前患者有肺部充满炎性液体(即所谓的“白肺”)。在一些实施方案中，本方法治疗前患者有细胞因子风暴引起的细胞因子释放综合症(cytokine release syndrome，crs)。
[0271]
在一些实施方案中，本发明融合蛋白用于结合icu治疗。在一些实施方案中，本发明融合蛋白结合体外ecmo和/或imv治疗。在一些实施方案中，本发明融合蛋白结合氧疗。在一些实施方案中，本发明抗体或抗原结合片段结合niv/hfnc治疗。在一些实施方案中，治疗后，患者的一种或多种细胞因子比治疗前至少降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％。在一些实施方案中，本方法使患者痊愈。
[0272]
诊断方法
[0273]
在某些样品中观察到spike蛋白的表达，并且具有spike蛋白表达的细胞的患者可能对使用本发明的融合蛋白的治疗有响应。因此，本发明的融合蛋白也可以用于诊断和预后。
[0274]
包含细胞的样品可以从患者体内获得。在选择性地对样品进行预处理之后，可以在允许抗体与可能存在于样品中的spike蛋白相互作用的条件下，将样品与本发明的融合蛋白一起孵育。可以使用诸如elisa的方法，利用融合蛋白中的抗体来检测样品中spike蛋白的存在。
[0275]
样品中spike蛋白的存在(比如含量或浓度)可以用于诊断相关疾病，作为患者适用融合蛋白治疗的指示，或作为患者已经(或没有)对病症治疗作出反应的指示。对于预后方法，可以在开始疾病治疗时在特定阶段进行一次、两次或更多次地检测，以指示治疗的进展。
[0276]
药物组合物
[0277]
本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效剂量的融合蛋白以及药学上可接受的载体。
[0278]
在一些实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由政府的监管机构批准的或其他公认的药典中列出的用于动物(特别是用于人类)的物质。此外，“药学上可接受的载体”通常指是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂等。
[0279]
术语“载体”是指可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，药物组合物还可以含有少量的润湿剂、乳化剂，或ph缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些药物组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、
片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该药物组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在e.w.martin的remington's pharmaceutical sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗原结合片段，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0280]
在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。药物组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
[0281]
本发明的化合物可以配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括衍生自如与盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，以及衍生自如与钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。
[0282]“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其
±
10％、
±
5％或
±
1％的范围。
[0283]“ecmo”即指体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ecmo)，其是一种医疗急救技术设备，主要用于对重症心肺功能衰竭患者提供持续的体外呼吸与循环，以维持患者生命。
[0284]“icu”是指重症加强护理病房(intensive care unit)，治疗、护理、康复均可同步进行，为重症或昏迷患者提供隔离场所和设备，提供最佳护理、综合治疗、医养结合，以及术后早期康复、关节护理运动治疗等服务。
[0285]“imv”即指间歇性指令通气(intermittent mandatory ventilation)，其是根据预先设置的时间间隔即时间触发，来实施周期性的容量或压力通气。这期间允许患者在指令通气期间以任何设定的基础压力水平进行自主呼吸。在自主呼吸时，患者可以在持续气流支持下自主呼吸，或者机器将按需阀门打开以允许自主呼吸。据大多数呼吸机都可以在自主呼吸时提供压力支持。
[0286]“hfnc”即经鼻高流量氧疗(high-flow nasal cannula oxygen therapy)，其是通过无需密封的鼻塞导管直接将一定氧浓度的空氧混合高流量气体输送给患者的一种氧疗方式，作为一种无创呼吸支持的形式，其能迅速地改善氧合。目前可以应用于急性低氧性呼吸衰竭患者、外科手术后患者、呼吸衰竭未行气管插管患者、免疫抑制患者、心功能不全患者等。
[0287]“niv”即指无创通气(non-invasine ventilation)，是指除气管插管、气管切开以外的无创伤的机械通气。
[0288]“ec50”即半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,ec50)是指能引起50％最大效应的浓度。
id.no:43所示的fr2，seq id.no:2所示的vh cdr2，如seq id.no:44所示的fr3，seq id.no:35所示的vh cdr3，如seq id.no:45所示的fr4，抗体1的vl如seq id.no:50所示；
[0313]
抗体22的vh包括如seq id.no:42所示的fr1，seq id.no:1所示的vh cdr1，如seq id.no:43所示的fr2，seq id.no:2所示的vh cdr2，如seq id.no:44所示的fr3，seq id.no:37所示的vh cdr3，如seq id.no:45所示的fr4，抗体1的vl如seq id.no:50所示；
[0314]
抗体23的vh包括如seq id.no:42所示的fr1，seq id.no:1所示的vh cdr1，如seq id.no:43所示的fr2，seq id.no:2所示的vh cdr2，如seq id.no:44所示的fr3，seq id.no:38所示的vh cdr3，如seq id.no:45所示的fr4，抗体1的vl如seq id.no:50所示。
[0315]
抗体24的vh包括如seq id.no:42所示的fr1，seq id.no:1所示的vh cdr1，如seq id.no:43所示的fr2，seq id.no:2所示的vh cdr2，如seq id.no:44所示的fr3，seq id.no:105所示的vh cdr3，如seq id.no:45所示的fr4，抗体1的vl如seq id.no:50所示
[0316]
表1氨基酸序列
[0317]
[0318]
[0319]
[0320]
[0321]
[0322][0323]
表2
[0324]
[0325][0326]
融合蛋白的制备
[0327]
根据本文所述融合蛋白的序列，融合蛋白可以通过以下方法或其他已知方法制备。依照宿主细胞cho密码子偏好性特点进行序列优化，由氨基酸序列得到dna序列。将优化并合成的序列克隆分别克隆入载体，然后分别抽提大量质粒，进行瞬时表达：线性化的表达载体与cho细胞混匀后加入0.4cm电转杯进行电转；电转完成后，按1200个细胞每孔铺到96孔细胞培养板，约2-3周后选择表达量高的母克隆进行96孔到24孔到6孔到摇瓶的细胞扩大培养和表达量检测，选择摇瓶表达量高的克隆进行亚克隆，亚克隆扩大培养和表达鉴定同母克隆，根据表达量情况和细胞株稳定性选择单克隆稳定细胞株，悬浮培养12天左右收获上清，进行proa亲和捕获，阴离子及阳离子层析获得纯度大于95％的抗体。
[0328]
抗体或融合蛋白与sars-cov-2 spike蛋白结合活性的检测
[0329]
针对上述抗体进行elisa检测，检测方法为：将96孔板(corning,9018)用spike-rbd-mfc(sino biologicals)包被，并用胶带密封并储存；将板在清洗缓冲液(pbs,0.05％tween 20)中清洗3次，之后加入封闭溶液(每孔200μl的10mg/ml bsa，溶剂为清洗缓冲液)；孵育(1h，37℃)后，将板用清洗缓冲液洗涤3次，然后每孔添加100μl样品；孵育(1.5h，37℃)
后，将板用清洗缓冲液洗涤，然后加入抗人κ轻链抗体-过氧化物酶偶联物(在封闭溶液中稀释至1:2000，100μl/孔)；将板用清洗缓冲液洗涤，在添加100μl tmb(tetramethylbenzidine，biopanda tmb-s-001)底物/孔之前，将测试样品孵育(1h，37℃)；显色10分钟后，加入100μl/孔0.1m h2so4终止反应，然后在450nm的吸光度下测量96孔板。
[0330]
通过吸光值计算ec50，各种抗体与sars-cov-2 spike蛋白结合的ec50值见表3。
[0331]
同样或类似方法可以测定融合蛋白与sars-cov-2 spike蛋白的结合活性。预期本发明融合蛋白将能特异性结合sars-cov-2 spike蛋白。
[0332]
表3
[0333][0334]
抗体或融合蛋白阻断sars-cov-2 spike蛋白与血管紧张素转化酶2结合的活性检测
[0335]
针对上述某些抗体或融合蛋白进行竞争elisa以检测其阻断spike蛋白与血管紧张素转化酶2(ace2)结合的能力。检测方法为：将96孔板(corning,9018)用spike-rbd-mfc(sino biologicals)包被，并用胶带密封并储存4℃过夜；将板在清洗缓冲液(pbs,0.05％tween 20)中清洗3次，之后加入封闭溶液(每孔200μl的10mg/ml bsa，溶剂为清洗缓冲液)；孵育(2h，22℃)后，将板在清洗缓冲液中清洗3次，加入不同浓度的抗体或融合蛋白样品，然后加入生物素化的血管紧张素转化酶2(50ng/ml)；孵育(1h，22℃)后，将板用清洗缓冲液洗涤3次，然后每孔添加100μl链酶亲和素过氧化物酶偶联物(在封闭溶液中稀释1:10,000)，孵育(1.0h，22℃)后，将板用清洗缓冲液洗涤，加100μl/孔tmb底物；显色10分钟后，加入50μl/孔0.1m h2so4终止反应，在450nm的吸光度下测量吸光值。
[0336]
上述各种抗体阻断covid-19 spike蛋白与ace2结合的曲线图见图1。
[0337]
同样或类似方法可以测定融合蛋白阻断sars-cov-2 spike蛋白与血管紧张素转化酶2结合的活性。预期本发明融合蛋白将能阻断sars-cov-2 spike蛋白与血管紧张素转化酶2结合。
[0338]
抗spike蛋白抗体或融合蛋白与细胞上spike蛋白的结合实验
[0339]
可以通过流式细胞法分析抗spike蛋白抗体、融合蛋白与表达spike蛋白的293t细胞的结合。
[0340]
293t细胞被瞬时转染以表达covid-19的spike蛋白，并在48-72小时后用于facs分析。
[0341]
为了进行结合分析，将表达spike蛋白的293t细胞与各种浓度的抗体或融合蛋白
在4℃下孵育30分钟。将样品洗涤两次，然后与pe偶联的山羊抗人fc检测抗体在4℃孵育30分钟，将样品洗涤两次。使用cytoflex流式细胞仪(beckman coulter)分析样品。结果由flowjo分析。预期本发明抗体、融合蛋白将与表达sars-cov-2 spike的细胞结合。
[0342]
抗spike蛋白抗体或融合蛋白阻断sars-cov-2 spike蛋白与细胞上血管紧张素转化酶2结合的活性检测
[0343]
可以通过facs分析抗体或融合蛋白对spike蛋白与细胞上人ace2的结合的阻断。
[0344]
将1μg/ml的生物素-covid-19 spike蛋白与各种浓度的抗spike蛋白抗体或融合蛋白在冰上预孵育1小时。随后将上述混合物与表达人ace2的细胞在冰上敷育1小时，将样品洗涤两次，然后与avidin-pe缀合物在冰上温育30分钟，将样品洗涤两次。
[0345]
用cytoflex流式细胞仪对细胞进行流式细胞分析。结果由flowjo分析。预期本发明抗体、融合蛋白将阻断表达sars-cov-2 spike蛋白的细胞与血管紧张素转化酶2结合。
[0346]
动物模型
[0347]
以下动物实验可以测试本文所述抗spike蛋白抗体或融合蛋白治疗covid-19的效果。将21只肺上皮细胞表面表达血管紧张素转化酶2的猕猴感染sars-cov-2病毒(10000tcid)。在感染后的第3天，将猕猴随机分为三组，分别通过静脉注射接受治疗(媒介物，3mg/kg抗s蛋白抗体或10mg抗s蛋白抗体，3mg/kg融合蛋白或10mg融合蛋白)。从感染病毒时开始每天监测记录猴子的症状，例如体温，肺功能和氧气含量等。在感染前，感染后第1天、第3天(治疗前后)，第5、7、10、14、20天抽取血样，并测定血浆病毒载量，抗体浓度，细胞因子(如肿瘤坏死因子α(tnf-α)，ifn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-7、il-8、il-10、il-12p70、il-13、粒细胞集落刺激因子(gscf)、干扰素诱导蛋白-10(ip-10)、单核细胞趋化蛋白-1(mcp1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(mip1a))水平。
[0348]
预期本实验将显示与接受媒介物的动物相比，接受本文所述的抗体的动物具有较轻的症状，较低的病毒载量和比较正常的细胞因子水平，并且抗体的作用具有剂量依赖性。
[0349]
预期本实验将显示与接受媒介物的动物相比，接受本文所述的融合蛋白的动物具有较轻的症状，较低的病毒载量和比较正常的细胞因子水平，并且融合蛋白的作用具有剂量依赖性。