固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法及从河鲀中提取活性肽的方法与流程

技术特征：
1.固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a：将ace溶解于硼酸盐缓冲液制得ace螯合配体溶液；b：往溴化氰活化琼脂糖凝胶4b中加入稀盐酸进行溶胀，过滤后用硼酸盐缓冲液清洗、滤干，除去残余hcl，得溴化氰活化琼脂糖4b填料；c：将ace螯合配体溶液与溴化氰活化琼脂糖4b填料混合，搅拌均匀后螯合过夜，螯合后，用4
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6倍溴化氰活化琼脂糖4b填料体积的硼酸盐缓冲液进行清洗和过滤，除去多余的ace；d：将滤干后的溴化氰活化琼脂糖4b填料与tris
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hcl缓冲液混匀，进行轻柔振荡后过滤；e：过滤后，采用醋酸盐缓冲液和tris
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hcl缓冲液交替清洗过滤3
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5次，得ace固定化凝胶填料，将ace固定化凝胶填料悬浮于硼酸盐缓冲液，装填入层析柱，即为固定化酶凝胶亲和吸附柱。2.根据权利要求1所述的固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法，其特征在于，ace的酶活力单位为4.5
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5.5u/ml。3.根据权利要求1所述的固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法，其特征在于，硼酸盐缓冲液的ph为8.1
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8.4，摩尔浓度为0.08
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0.12m，除步骤e的硼酸盐缓冲液外，其余步骤的硼酸盐缓冲液均含有0.45
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0.55m的nacl；溴化氰活化琼脂糖凝胶4b与稀盐酸的质量体积比为0.8
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1.2g：5ml，稀盐酸的摩尔浓度为0.9
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1.1mm；螯合过夜的温度条件为0
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4℃；tris
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hcl缓冲液的ph为7.9
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8.1，摩尔浓度为0.08
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0.12m，步骤e的tris
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hcl缓冲液含有0.45
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0.55m的nacl；轻柔振荡的振荡温度为23
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27℃，振荡时间为1.8
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2.2h；醋酸盐缓冲液的ph为3.8
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4.2，摩尔浓度为0.08
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0.12m，含有0.45
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0.55m的nacl。4.从河鲀中提取活性肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：s0：固定化酶凝胶亲和吸附柱的制备，制备方法采用如权利要求1
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3任一项所述的固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法；s1：肽组分的制备，取河鲀鲜鱼皮，绞碎后加入水，匀浆形成鱼皮浆料液，加入蛋白酶进行酶解，酶解后进行灭酶处理，冷却后调节ph值至中性，得酶解液，对酶解液进行微滤，然后进行超滤处理，获得分子量小于1kda的肽组分；s2：肽组分的亲和吸附和洗脱，将所述步骤s1获得的分子量小于1kda的肽组分用所述步骤s0制得的固定化酶凝胶亲和吸附柱进行亲和吸附和洗脱，并进行紫外检测，紫外检测波长为220nm，收集洗脱峰组分，对洗脱峰组分进行脱盐，减压浓缩后待用；s3：肽的序列鉴定，对步骤s2减压浓缩后的洗脱峰组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到多条氨基酸序列；s4：将多条肽按步骤s3测定的氨基酸序列进行固相合成，验证合成肽的ace抑制活性，筛选得到ace抑制活性高的活性肽。5.根据权利要求4所述的从河鲀中提取活性肽的方法，其特征在于，所述步骤s1中，采用酶活力单位为5万u/g的碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为碱性蛋
白酶添加量为鱼皮浆料液质量的0.8
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1.2％，ph值为7.8
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8.2，酶解温度为58
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62℃，酶解时间为5.8
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6.2h。6.根据权利要求4所述的从河鲀中提取活性肽的方法，其特征在于，所述步骤s1中：绞碎后加入的水为蒸馏水，河鲀鲜鱼皮与蒸馏水的质量体积比为0.9
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1.1kg:10l；采用转速为11000
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13000rpm/min的组织匀浆器进行匀浆；酶解后通过煮沸加热9
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11min进行灭酶处理，采用hcl调节ph值至中性。7.根据权利要求4所述的从河鲀中提取活性肽的方法，其特征在于，所述步骤s1中，微滤采用φ30mm
×
800mm的陶瓷膜元件，过滤精度为200nm，膜通量为600
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1000l/m2h，超滤采用截留分子量为1kda的聚醚砜超滤膜。8.根据权利要求4所述的从河鲀中提取活性肽的方法，其特征在于，所述步骤s2具体包括：s21：在中压蛋白纯化仪上，安装好所述步骤s0制得的固定化酶凝胶亲和吸附柱，用摩尔浓度为0.08
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0.12m、ph为7.9
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8.1的硼酸盐缓冲液进行平衡18
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22min，平衡流速0.45
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0.55ml/min，并在紫外检测仪检测，紫外检测波长为220nm；s22：平衡后进行所述步骤s1获得的分子量小于1kda的肽组分的上样吸附，上样量4.5
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5.5ml，流动相用摩尔浓度为0.08
‑
0.12m、ph为7.9
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8.1的硼酸盐缓冲液，流速0.45
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0.55ml/min，观察至检测基线平稳后14
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16min，以摩尔浓度为0.08
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0.12m、ph为7.9
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8.1的硼酸盐缓冲液为洗脱流动相进行洗脱，且硼酸盐缓冲液含有0.8
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1.2m的nacl，洗脱流速0.45
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0.55ml/min，收集洗脱峰组分；s23:固定化酶凝胶亲和吸附柱用摩尔浓度为0.08
‑
0.12m、ph为7.9
‑
8.1的硼酸盐缓冲液重新进行平衡18
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22min后，按步骤s22进行多次的肽组分上样和洗脱，将多次洗脱峰组分合并，采用截留分子量为100d的透析袋对洗脱峰组分进行脱盐，减压浓缩后待用。9.根据权利要求4所述的从河鲀中提取活性肽的方法，其特征在于，所述步骤s3中，采用lc
‑
ms/ms进行质谱测定，测定条件为：色谱柱为pepmap rplc c
18
,75μm i.d.
×
150mm,3μm，阳离子模式，扫描范围：m/z 300
‑
1500da，发射极喷雾电压2
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kv，质谱测定的结果用peaks studio软件进行从头测序de novo sequencing分析，获得多条高可信活性肽氨基酸序列。

技术总结
本发明公开了固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法及从河鲀中提取活性肽的方法，属于活性肽技术领域，包括以下步骤：a：制得ACE螯合配体溶液，b：除去残余HCl，c：将ACE螯合配体溶液与溴化氰活化琼脂糖4B填料混合，除去多余的ACE，d：轻柔振荡后过滤，e：过滤后，采用醋酸盐缓冲液和Tris


技术研发人员：刘智禹 苏永昌 刘淑集 陈贝 乔琨 许旻 陈晓婷
受保护的技术使用者：福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）
技术研发日：2021.08.09
技术公布日：2021/11/9