固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法及从河鲀中提取活性肽的方法与流程

1.本发明属于活性肽技术领域，尤其涉及一种固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法及从河鲀中提取活性肽的方法。


背景技术：

2.随着社会的进步与发展，人们生活水平逐渐提高，饮食中脂肪与热量的比重逐渐加大，再加上运动量的减少，我国心血管疾病的发病率快速上升，其中高血压占主要地位。
3.河鲀为暖温带及热带近海底层鱼类，栖息于海洋的中、下层，有少数种类进入淡水江河中，当遇到外来危险时使整个身体呈球状浮上水面，同时皮肤上的小刺竖起，借以自卫。
4.血管紧张素转化酶(ace)抑制肽是经过蛋白水解后形成的小分子多肽，它具有显著的降血压作用，更有效的是它与其它普通降压药物比较发现，ace抑制肽无毒副作用，并且对正常的血压无影响。ace在血压调节中起重要作用，经碳端两个氨基酸(his
‑
leu)的切除，能够把原本无活性的血管紧张素ⅰ转变为具有活性的血管紧张素ⅱ，引起血管收缩，使血压上升；ace还会使具有血管舒张功能的舒缓激肤失活，同样又引起血压上升的情形，ace抑制肽能够阻断ace引起的两种生化反应过程，起到降血压的作用。
5.现有制备活性肽需要对酶解后的肽组分进行吸附洗脱处理，其中，吸附柱起到至关重要的作用，尤其是其填料，影响着洗脱效率。
6.现有在从榛子、牦牛乳、贝肉、枸杞等食物中制备活性肽的技术，因此亟需一种以河鲀为原料制备活性肽的技术。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提出一种固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法及从河鲀中提取活性肽的方法，制备的固定化酶凝胶亲和吸附柱用于活性肽的筛选具有筛选快速高效、操作简便易行的特点，可用于活性肽的快速规模化筛选，采用河鲀鱼皮作为原料，获得活性肽氨基酸序列，制备的活性肽具有ace抑制活性和dpp
‑ⅳ
抑制活性，具有良好的降压降血糖效果。
8.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
9.本发明提供的固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法，包括以下步骤：a：将ace溶解于硼酸盐缓冲液制得ace螯合配体溶液,b：往溴化氰活化琼脂糖凝胶4b中加入稀盐酸进行溶胀，过滤后用硼酸盐缓冲液清洗、滤干，除去残余hcl，得溴化氰活化琼脂糖4b填料,c：将ace螯合配体溶液与溴化氰活化琼脂糖4b填料混合，搅拌均匀后螯合过夜，螯合后，用4
‑
6倍溴化氰活化琼脂糖4b填料体积的硼酸盐缓冲液进行清洗和过滤，除去多余的ace,d：将滤干后的溴化氰活化琼脂糖4b填料与tris
‑
hcl缓冲液混匀，进行轻柔振荡后过滤,e：过滤后，采用醋酸盐缓冲液和tris
‑
hcl缓冲液交替清洗过滤3
‑
5次，得ace固定化凝胶填料，将ace固定化
凝胶填料悬浮于硼酸盐缓冲液，装填入层析柱，即为固定化酶凝胶亲和吸附柱。。
10.优选地，ace的酶活力单位为4.5
‑
5.5u/ml。
11.优选地，硼酸盐缓冲液的ph为8.1
‑
8.4，摩尔浓度为0.08
‑
0.12m，除步骤e的硼酸盐缓冲液外，其余步骤的硼酸盐缓冲液均含有0.45
‑
0.55m的nacl，溴化氰活化琼脂糖凝胶4b与稀盐酸的质量体积比为0.8
‑
1.2g：5ml，稀盐酸的摩尔浓度为0.9
‑
1.1mm，螯合过夜的温度条件为0
‑
4℃，tris
‑
hcl缓冲液的ph为7.9
‑
8.1，摩尔浓度为0.08
‑
0.12m，步骤e的tris
‑
hcl缓冲液含有0.45
‑
0.55m的nacl，轻柔振荡的振荡温度为23
‑
27℃，振荡时间为1.8
‑
2.2h，醋酸盐缓冲液的ph为3.8
‑
4.2，摩尔浓度为0.08
‑
0.12m，含有0.45
‑
0.55m的nacl。
12.本发明还提供从河鲀中提取活性肽的方法，包括以下步骤：s0：固定化酶凝胶亲和吸附柱的制备，制备方法采用如上述任一项的固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法，s1：肽组分的制备，取河鲀鲜鱼皮，绞碎后加入水，匀浆形成鱼皮浆料液，加入蛋白酶进行酶解，酶解后进行灭酶处理，冷却后调节ph值至中性，得酶解液，对酶解液进行微滤，然后进行超滤处理，获得分子量小于1kda的肽组分，s2：肽组分的亲和吸附和洗脱，将步骤s1获得的分子量小于1kda的肽组分用步骤s0制得的固定化酶凝胶亲和吸附柱进行亲和吸附和洗脱，并进行紫外检测，紫外检测波长为220nm，收集洗脱峰组分，对洗脱峰组分进行脱盐，减压浓缩后待用，s3：肽的序列鉴定，对步骤s2减压浓缩后的洗脱峰组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到24条氨基酸序列，s4：将24条肽按步骤s3测定的氨基酸序列进行固相合成，验证合成肽的ace抑制活性，筛选得到ace抑制活性高的活性肽。
13.优选地，步骤s1中，采用酶活力单位为5万u/g的碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为碱性蛋白酶添加量为鱼皮浆料液质量的0.8
‑
1.2％，ph值为7.8
‑
8.2，酶解温度为58
‑
62℃，酶解时间为5.8
‑
6.2h。
14.优选地，步骤s1中：绞碎后加入的水为蒸馏水，河鲀鲜鱼皮与蒸馏水的质量体积比为0.9
‑
1.1kg:10l，采用转速为11000
‑
13000rpm/min的组织匀浆器进行匀浆，酶解后通过煮沸加热9
‑
11min进行灭酶处理，采用hcl调节ph值至中性。
15.优选地，步骤s1中，微滤采用φ30mm
×
800mm的陶瓷膜元件，过滤精度为200nm，膜通量为600
‑
1000l/m2h，超滤采用截留分子量为1kda的聚醚砜超滤膜。
16.优选地，步骤s2具体包括：s21：在中压蛋白纯化仪上，安装好步骤s0制得的固定化酶凝胶亲和吸附柱，用摩尔浓度为0.08
‑
0.12m、ph为7.9
‑
8.1的硼酸盐缓冲液进行平衡18
‑
22min，平衡流速0.45
‑
0.55ml/min，并在紫外检测仪检测，紫外检测波长为220nm，s22：平衡后进行步骤s1获得的分子量小于1kda的肽组分的上样吸附，上样量4.5
‑
5.5ml，流动相用摩尔浓度为0.08
‑
0.12m、ph为7.9
‑
8.1的硼酸盐缓冲液，流速0.45
‑
0.55ml/min，观察至检测基线平稳后14
‑
16min，以摩尔浓度为0.08
‑
0.12m、ph为7.9
‑
8.1的硼酸盐缓冲液为洗脱流动相进行洗脱，且硼酸盐缓冲液含有0.8
‑
1.2m的nacl，洗脱流速0.45
‑
0.55ml/min，收集洗脱峰组分，s23:固定化酶凝胶亲和吸附柱用摩尔浓度为0.08
‑
0.12m、ph为7.9
‑
8.1的硼酸盐缓冲液重新进行平衡18
‑
22min后，按步骤s22进行多次的肽组分上样和洗脱，将多次洗脱峰组分合并，采用截留分子量为100d的透析袋对洗脱峰组分进行脱盐，减压浓缩后待用。
17.优选地，步骤s3中，采用lc
‑
ms/ms进行质谱测定，测定条件为：色谱柱为pepmap rplc c
18
,75μm i.d.
×
150mm,3μm，阳离子模式，扫描范围：m/z 300
‑
1500da，发射极喷雾电压2
‑
kv，质谱测定的结果用peaks studio软件进行从头测序de novo sequencing分
8.3，含0.5m nacl)进行清洗和过滤，除去多余的ace。将滤干后的溴化氰活化琼脂糖4b填料与50ml 0.1m tris
‑
hcl缓冲液(ph 8.0)混匀，在25℃下轻柔振荡2h。过滤后，0.1m醋酸盐缓冲液(ph4.0，含0.5m nacl)和0.1m tris
‑
hcl缓冲液(ph8.0，含0.5m nacl)交替清洗过滤3次，得ace固定化凝胶填料。将ace固定化凝胶填料悬浮于0.1m硼酸盐缓冲液(ph 8.3)，装填入柱体积5ml的层析柱(φ0.9
×
1.57cm)，即为固定化酶凝胶亲和吸附柱。
44.本实施例还提供从河鲀中提取活性肽的方法，包括以下步骤：
45.s0：固定化酶凝胶亲和吸附柱的制备，制备方法采用如上述任一项的固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法。
46.s1：肽组分的制备
47.取1000g河鲀鲜鱼皮，绞碎后加入10l蒸馏水，组织匀浆器中12000rpm/min转速匀浆形成鱼皮浆料液，在碱性蛋白酶(5万u/g)添加量为1％，ph值为8.0，酶解温度60℃条件下酶解6h，酶解后煮沸加热10min进行灭酶处理，冷却后用hcl调节ph值至中性。酶解液应用φ30mm
×
800mm的陶瓷膜元件(过滤精度200nm,600
‑
1000l/m2h)进行微滤后，采用的聚醚砜超滤膜(截留分子量1kda)进行超滤处理，获得分子量小于1kda组分。
48.s2：肽组分的亲和吸附和洗脱
49.s21：在中压蛋白纯化仪(akta pure 25)上，安装好步骤s0制得的固定化酶凝胶亲和吸附柱，用0.1m硼酸盐缓冲液(ph 8.3)进行平衡20min，平衡流速0.5ml/min，并在紫外检测仪检测，紫外检测波长为220nm。
50.s22：平衡后进行步骤s1获得的分子量小于1kda的肽组分的上样吸附，上样量5ml,流动相为0.1m硼酸盐缓冲液(ph 8.3)，流速0.5ml/min,观察至检测基线平稳后15min，以0.1m硼酸盐缓冲液(ph 8.3含1m nacl)为洗脱流动相进行洗脱，洗脱流速0.5ml/min，收集洗脱峰组分。
51.s23:固定化酶凝胶亲和吸附柱用0.1m硼酸盐缓冲液(ph 8.3)重新进行平衡20min后，按步骤s22进行多次的肽组分上样和洗脱，将多次洗脱峰组分合并，采用截留分子量为100d的透析袋对洗脱峰组分进行脱盐，减压浓缩后待用。
52.固定化酶凝胶亲和吸附柱对活性肽的亲和洗脱图谱如图1所示。
53.s3：肽的序列鉴定
54.对步骤s2减压浓缩后的洗脱峰组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到24条氨基酸序列，具体的，采用lc
‑
ms/ms进行质谱测定，测定条件为：色谱柱为pepmap rplc c
18
,75μm i.d.
×
150mm,3μm，阳离子模式，扫描范围：m/z 300
‑
1500da，发射极喷雾电压2
‑
kv，质谱测定的结果用peaks studio软件进行从头测序de novo sequencing分析，获得24条高可信活性肽氨基酸序列，其序列测定如表1所示：
[0055][0056][0057]
表1
[0058]
s4：将24条肽按步骤s3测定的氨基酸序列进行固相合成，验证合成肽的ace抑制活性。结果显示，8条活性肽具有良好的ace抑制活性，ic
50
值分别为：
[0059]
tlrfalhgme 0.0229umol/ml；
[0060]
tlfgl 0.0575umol/ml；
[0061]
yvll 0.2560umol/ml；
[0062]
tvll 0.5821umol/ml；
[0063]
saal 0.8829umol/ml；
[0064]
tftga 0.6943umol/ml；
[0065]
vlga 1.3729umol/ml；
[0066]
rstgalal 5.8375umol/ml。
[0067]
将24条合成活性肽分别编号为1
‑
24,ace抑制活性测定如图2所示，上述8条合成活性肽ace抑制ic
50
测定如表2所示：
[0068][0069][0070]
表2
[0071]
上述8条活性肽的浓度对ace抑制率的测定图如图3
‑
10所示。
[0072]
机理研究
[0073]
运用discovery studio软件进行活性最高的活性肽tlrfalhgme、tlfgl、yvll和ace对接机理模拟分析，结果如下：
[0074]
如图11
‑
12所示，tlrfalhgme与ace形成12个氢键作用，这些氢键作用对于二者稳定结合至关重要。与活性肽形成氢键作用的结合口袋残基包括：ala354、his513、lys511、tyr523。此外，亦存在其他疏水作用和静电作用，接触点位较多。
[0075]
如图13
‑
14所示，tlfgl与ace之间形成的氢键网络。二者共有4个氢键相互作用。这些氢键作用，对于活性肽与ace的稳定结合至关重要。与活性肽形成氢键作用的结合口袋残基包括：tyr523,his353等。活性肽gly4骨架酰胺氧原子具有电负性，可以与结合位点的zn
2
形成较强的极性作用，从而破坏zn离子本应有的功能。该活性肽均为疏水残基。这些疏水残基，可以结合口袋残基形成较强的疏水作用和范德华势能。
[0076]
如图15
‑
16所示，yvll与ace之间形成的氢键网络。二者共有8个氢键相互作用。这些氢键作用，对于活性肽与ace的稳定结合至关重要。与活性肽形成氢键作用的结合口袋残基包括：ala356，tyr523，ala354,ala354,gln281,lys511,tyr520,his513等。活性肽val2骨架酰胺氧原子具有电负性，可以与结合位点的zn
2
形成较强的极性作用，从而破坏zn离子本应有的功能。该活性肽均为疏水残基，这些疏水残基，可以结合口袋残基形成较强的疏水作用和范德华势能。
[0077]
动物降血压实验
[0078]
以shr大鼠为动物模型，将tlrfalhgme、tlfgl、yvll分别以10、10、20mg/kg(大鼠体重)剂量进行一次性尾静脉注射实验，卡托普利尾静脉注射剂量为5mg/kg(大鼠体重)作为药物对照组。
[0079]
如图17
‑
19所示，结果显示，tlrfalhgme在尾静脉注射后，在2、4、6、12、24h后收缩压分别为158.1、145.5、144.3、135.5、154.1mmhg，分别降低了16.1％、22.7％、23.4％、
28.1％和18.2％，降血压效果优于卡托普利对照组。其中，12h的收缩压血压值接近正常血压，而且活性肽tlrfalhgme一次注射后，降压效果可持续24h以上。实验表明，tlrfalhgme具有良好的降血压效果。
[0080]
tlfgl在尾静脉注射后，在2、4、6、12、24h后收缩压分别为164.4、149.4、、154.8、131.8、158.8mmhg，分别降低了18.4％、25.9％、23.2％、34.6％、21.3％，降血压效果优于卡托普利对照组。其中，12h的收缩压血压值接近正常血压，而且活性肽tlfgl一次注射后，降压效果可持续24h以上。实验表明，tlfgl具有良好的降血压效果。
[0081]
yvll在尾静脉注射后，在2、4、6、12、24h后收缩压分别为140.7、159.9、147.5、145.1和161.6mmhg，分别降低了30.5％、21.1％、27.2％、28.4％和20.2％，降血压效果优于卡托普利对照组。活性肽yvll一次注射后，降压效果可持续24h以上。实验表明，yvll具有良好的降血压效果。
[0082]
活性肽抑制dpp
‑ⅳ
活性测定
[0083]
dpp
‑ⅳ
抑制剂即二肽基肽酶ⅳ抑制剂，是一类治疗2型糖尿病的药物，该类药物能够抑制胰高血糖素样肽
‑
1(glp
‑
1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌活性肽(gip)的灭活，提高内源性glp
‑
1和gip的水平，促进胰岛β细胞释放胰岛素，同时抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，从而提高胰岛素水平，降低血糖，且不易诱发低血糖和增加体重。
[0084]
分别测定tlrfalhgme、tlfgl、yvll的dpp
‑ⅳ
抑制活性，如图20
‑
22所示，结果显示，3条活性肽具有一定的dpp
‑ⅳ
抑制活性，活性肽tlrfalhgme、tlfgl、yvll的ic
50
值分别为9.55、21.5，1.3mg/ml。
[0085]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。