基于纳米金颗粒的微生物浓度指示液、微生物浓度指示装置及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于微生物浓度指示技术领域，尤其是一种基于纳米金颗粒的微生物浓度指示液、微生物浓度指示装置及其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前在城市用水、医疗、工业以及食品用水方面，为了保证用水安全卫士，需要对水质进行检测。另外，在医疗器械清洗消毒灭菌的效果检测方面等，传统的检测方法，如采用细菌培养法进行检测，需要48h后才能判读检测结果，存在检测不及时的缺陷；而现有技术中采用生物指示器进行检测的方法，则需要配备一套专门的检测设备，但其价格高，而且需要在特定地方进行检测，操作更复杂、使用不便。
3.纳米金颗粒是指直径在1～100nm的金的微小颗粒，其颜色依直径大小而呈红色至紫色。此外，其具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。例如，大量研究表明胶体金能够稳定而迅速地吸附蛋白质，而且蛋白质的生物活性不发生明显改变。它可以作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位，具体的，如验孕试纸中就含有胶体金，其通过纳米金粒子静电吸附人绒毛膜促性腺激素(hcg)的物质而聚集沉淀后，呈现出红色，从而起到指示作用；再如，胶体金在传染性病毒方面的检测，通过检测人体中是否出现了针对该传染性病毒的特异性抗体，从而得知是否被该传染性病毒感染的结果。但上述检测原理都是采用胶体金吸附蛋白质从而聚集沉积形成粒径更大的颗粒，发生颜色变化来达到检测目的。其上述纳米金颗粒一般是采用氯金酸之类的金盐在还原剂的作用下制成的，这样制成的纳米金颗粒表面带有负电荷，它们可以分散形成无色胶体，当其通过静电吸附和各种生物大分子结合起来后会发生颜色变化。但采用现有方法制备或采用外购形式购买得到的这种表面带负电荷的纳米金颗粒，在细菌或真菌等表面带负电荷的微生物浓度的检测中，该类纳米金胶体就无法吸附此类微生物，则检测溶液颜色不发生变化，无法起到检测指示作用。此外，现有技术中也并无将纳米金颗粒应用于细菌或真菌检测中的相关报道。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种操作方便且快速可判读的基于纳米金颗粒的微生物浓度指示液，该微生物浓度指示液针对表面带负电荷的微生物浓度检测方面还具有便利和低成本的优点。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于纳米金颗粒的微生物浓度指示液，其特征在于：包括可内置于封闭容器内的纳米金指示液，纳米金指示液包括粒径为20
‑
90nm的纳米金颗粒，该纳米金颗粒表面带有正电荷，所述纳米金指示液指示浓度为100cfu/ml
‑
1000cfu/ml。
6.进一步的，所述纳米金指示液的原料包括摩尔比为1：(10
‑
1000)：(1
‑
2000)的氯金
酸溶液、保护剂、还原剂。保护剂包括或仅有n，n，n
‑
三甲基
‑
(11
‑
巯基十一烷基)氯化铵。
7.进一步的，所述纳米金指示液的原料包括氯金酸溶液、保护剂和还原剂，所述保护剂包括n，n，n
‑
三甲基
‑
(11
‑
巯基十一烷基)氯化铵，所述保护剂还包括11
‑
巯基十一烷酸、十六烷基胺、聚乙烯吡咯烷酮中的0
‑
3种。保护剂可以单独采用n，n，n
‑
三甲基
‑
(11
‑
巯基十一烷基)氯化铵，或者采用n，n，n
‑
三甲基
‑
(11
‑
巯基十一烷基)氯化铵与11
‑
巯基十一烷酸、十六烷基胺、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种进行复配。
8.进一步的，所述纳米金指示液的原料包括氯金酸溶液、保护剂和还原剂，所述还原剂为硼氢化钠、vc中的至少一种。
9.再一发明目的：本发明还提供了一种基于纳米金颗粒的微生物浓度指示装置，其特征在于：包括可内置于封闭容器内的纳米金指示液，纳米金指示液包括粒径为20
‑
90nm的纳米金颗粒，该纳米金颗粒表面带有正电荷，所述纳米金指示液指示浓度为100cfu/ml
‑
1000cfu/ml。
10.进一步的，还包括封闭容器、微生物取样器、带滤膜的过滤器和生理盐水瓶，该封闭容器的材质为塑料或玻璃。
11.再一发明目的：本发明还提供了一种基于纳米金颗粒的微生物浓度指示液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先在氯金酸溶液中加入保护剂，在20
‑
50℃下搅拌均匀后加入还原剂，搅拌至溶液为红色，在20
‑
50℃下离心去除上清液，补水后重复上述离心过程2次，最后将所得的沉积物用ph为5.8
‑
7.8的缓冲液进行稀释，即得纳米金指示液，其中氯金酸溶液和保护剂以及还原剂之间的摩尔比为1：(10
‑
1000)：(1
‑
2000)，所述保护剂包括或仅有n，n，n
‑
三甲基
‑
(11
‑
巯基十一烷基)氯化铵。
12.进一步的，所述保护剂包括n，n，n
‑
三甲基
‑
(11
‑
巯基十一烷基)氯化铵，所述保护剂还包括11
‑
巯基十一烷酸、十六烷基胺、聚乙烯吡咯烷酮中的1
‑
3种。
13.进一步的，所述还原剂为硼氢化钠、vc中的至少一种。
14.再一发明目的：本发明还提供了一种采用基于纳米金颗粒的微生物浓度指示液或采用基于纳米金颗粒的微生物浓度指示装置的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：用取样器吸取样液，用带滤膜的过滤器对样液进行过滤，后用生理盐水对滤膜进行洗涤，洗涤后的溶液加入纳米金指示液中，观察颜色变化。
15.再一发明目的：本发明还提供了一种如权利要求1所述的基于纳米金颗粒的微生物浓度指示液或如权利要求6所述的制备方法得到的基于纳米金颗粒的微生物浓度指示液或如权利要求5所述的微生物浓度指示装置，其特征在于：在水质检测或器械消毒灭菌效果检测中对细菌群落和/或真菌群落进行检测的应用。尤其是指表面带负电荷的细菌、真菌，以及其他表面带负电荷的微生物或者可以通过条件改变使其表面带负电荷的微生物均可适用。
16.采用上述方案，本发明的微生物浓度指示液在细菌和真菌群落的检测方面具有操作方便、快速、准确、便携的优点，检测1h即可通过肉眼观察颜色变化进行判读，适合在水质检测、器械清洗消毒效果检测等方面的应用。
17.下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述。
具体实施方式
18.一、本发明的具体实施例按以下步骤制备：
19.s1、将氯金酸溶液加入保护剂中，后加入还原剂，升温至30
‑
50℃搅拌。
20.s2、加入还原剂，继续按s1的温度进行搅拌，直至溶液变为红色。
21.s3、在10000r/min,30
‑
50℃条件下离心15min，除去上清液，补水至10ml，重复上述离心过程2次，最后将所得的沉积物用ph＝5.8
‑
7.8的缓冲液稀释至原体积的一半，即得纳米金指示液.
22.用取样器吸取不同浓度的大肠杆细菌样液，用带滤膜的过滤器对样液进行过滤，后用生理盐水对滤膜进行洗涤，洗涤后的溶液加入纳米金指示液中，观察颜色变化。下列实施例涉及的具体原料及工艺条件参考表1，具体的结果见表2。
23.表1不同实施例的物料添加及制作条件情况
24.[0025][0026]
上述实施例中，实施例1
‑
5中，变量为氯金酸溶液与保护剂、还原剂的摩尔比；实施例6
‑
11中，采用了不同的保护剂，实施例12与实施例11相比，采用了不同的还原剂vc，实施例13
‑
14与实施例11相比，采用了不同的反应过程温度，实施例15
‑
16与实施例14相比，采用了不同ph的缓冲液。其中，实施例17的离心温度在30℃，采用了ph＝7.5的缓冲液。
[0027]
本发明的纳米金颗粒指示液在制备过程中，还可以在加入保护剂之后，加入还原剂之前，这个过程加入纳米金种子液。
[0028]
实施例18
[0029]
s1、将5ml的0.001m氯金酸溶液加入5ml的0.2m n，n，n
‑
三甲基
‑
(11
‑
巯基十一烷基)氯化铵、1g 11
‑
巯基十一烷酸中，在30℃下进行搅拌。
[0030]
s2、在10ml 0.00035m氯金酸溶液中加入0.006g柠檬酸钠，再加入0.3ml的0.1m硼氢化钠，搅拌2
‑
5h，制得种子液。
[0031]
s3、在s1中加入0.05ml的0.1m vc溶液，搅拌下取1.2ml s2中的种子液加入s1中，30℃下搅拌直至溶液深红色。
[0032]
s4、在10000r/min,30℃条件下离心15min，除去上清液，补水至10ml，重复上述离心过程2次，最后将所得的沉积物用ph＝6.0的缓冲液稀释至原体积的一半，即得纳米金指
示液.
[0033]
用取样器吸取不同浓度的大肠杆细菌样液，用带滤膜的过滤器对样液进行过滤，后用生理盐水对滤膜进行洗涤，洗涤后的溶液加入纳米金指示液中，观察颜色变化。
[0034]
实施例19
[0035]
s1、将5ml的0.0005m氯金酸溶液加入5ml的0.1m n，n，n
‑
三甲基
‑
(11
‑
巯基十一烷基)氯化铵中和0.5g十六烷基胺，在30℃下进行搅拌。
[0036]
s2、在10ml 0.00025m氯金酸溶液中加入1ml的0.25mm柠檬酸钠，再加入2.5ml的1m硼氢化钠，搅拌2
‑
5h，制得种子液。
[0037]
s3、在s1中加入0.1ml的0.1m vc碱性溶液，搅拌下取0.1ml s2中的种子液加入s1中，30℃下搅拌直至溶液深红色。
[0038]
s4、在10000r/min,30℃条件下离心15min，除去上清液，补水至10ml，重复上述离心过程2次，最后将所得的沉积物用ph＝7.0的缓冲液稀释至原体积的一半，即得纳米金指示液.
[0039]
用取样器吸取不同浓度的大肠杆细菌样液，用带滤膜的过滤器对样液进行过滤，后用生理盐水对滤膜进行洗涤，洗涤后的溶液加入纳米金指示液中，观察颜色变化。
[0040]
上述*对比例1是根据文献“南彩云,张宇等.基础实验：金纳米粒子的制备及其光学性质[j].”制备，如下：取20ml 0.01％氯金酸溶液于50ml圆底烧瓶中,放入磁子,装上球形冷凝管,加热至沸腾。在高速搅拌的同时,迅速加入2ml 1％柠檬酸钠溶液,激烈搅拌下回流10min,撤去热源,继续搅拌15min,冷却溶液至室温。
[0041]
上述**对比例2是用本领域常规选择的阳离子表面活性剂ctab作为保护剂进行制备指示液。具体步骤如下：s1、将5ml的0.0005m氯金酸溶液加入5ml的0.2m ctab中，后加入0.5ml的0.2m聚乙烯吡咯烷酮，升温至40℃搅拌。
[0042]
s2、加入1ml 1m硼氢化钠，继续40℃搅拌，直至溶液变为红色。
[0043]
s3、在10000r/min,30℃条件下离心15min，除去上清液，补水至10ml，重复上述离心过程2次，最后将所得的沉积物用ph＝7.5的缓冲液稀释至原体积的一半，即得纳米金指示液。
[0044]
二、具体结果如表2所示：
[0045]
表2不同实施例在不同浓度微生物条件下的颜色指示结果
[0046][0047][0048]
三、结果分析总结
[0049]
实施例1
‑
5、9
‑
19与对比试验1相比，区别在于制备的温度条件不同，且对比1无添加保护剂，通过对比1制作的纳米金颗粒表面带负电荷，其指示液在检测细菌、真菌群落方面，未发生颜色变化，说明制作条件和保护剂的选择尤为重要。
[0050]
实施例1
‑
5、9
‑
19与实施例6
‑
8以及对比试验2相比，区别在于所用的保护剂不同，虽然对比1所用的保护剂也是阳离子表面活性剂，理论上合成的纳米金颗粒表面应带正电荷，但实际上其表面带负电荷，结果呈现出，其指示液在检测细菌、真菌群落方面，未发生颜色变化，说明保护剂的选择至关重要。
[0051]
本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内
容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。