一种降血糖药物的筛选方法与流程

1.本发明属于药物筛选方法的建立和应用技术领域，具体涉及一种降血糖药物 的筛选方法。


背景技术：

2.糖尿病是一种由个体遗传因素和环境因素(肥胖率上升、高能量饮食和低运 动水平等)相互作用引起的糖代谢紊乱疾病，最终导致胰腺β细胞功能障碍。截 至2019年，全世界糖尿病患者增加到4.63亿，预计到2045年将有7亿人患糖 尿病。在中国，近90％的糖尿病患者是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus， t2dm)，其膳食结构受到限制，生活质量下降，医疗负担繁重。
3.目前降血糖药物的评价方法主要包含有化学方法、细胞学方法和动物模型 法。但由于胰岛细胞慢性高糖损伤作用机制复杂，动物模型法实验种间差异 大、周期较长、重复性较差，传统的化学方法如α
‑
淀粉酶和α
‑
葡萄糖苷酶或细 胞学方法检测指标均比较单一，不能对活性物质活性强弱及作用机制进行全面 准确评价。因此亟需建立一种新的降糖活性评价方法。细胞代谢组学以细胞代 谢物为研究对象，通过代谢组数据库和精密仪器对胞内代谢产物进行定性和定 量分析，寻找条件干预后的差异代谢物，并通过分析活性物质干预后细胞代谢 物多指标的变化可以对活性强弱进行全面分析及评价。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种降血糖药物的筛选方法，通过对模型细胞代谢物 的分析，确定与降血糖相关的生物标志物及其含量变化，从而建立降血糖药物 的筛选模型，并用于降血糖相关药物的筛选，从而为药物的筛选提供一种新的 模式。
5.本发明首先提供一种与降血糖药物的筛选相关的生物标志物组合，所述的 组合为丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、还原谷胱甘肽、氧化谷胱甘肽、苏氨酸、半 胱氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、马尿酸、肌醇、 硝基酪氨酸、胞嘧啶核苷、马来酸、延胡索酸、琥珀酸、色氨酸、谷氨酰胺、蛋 氨酸、组氨酸。
6.本发明还提供一种通过上述的生物标志物的含量来筛选降血糖药物的模 型，所述的模型如下：
7.y＝
‑
7*10
‑4x2 0.0474x 0.1645(0<x<40),r2＝0.9522
8.其中x代表样品的预测值，y代表降血糖活性值，y值在0
‑
1之间，y值越 接近于1，说明降血糖效果越好；y值越接近0，说明降血糖效果越差。
9.其中x代表样品的预测值，其获得方法为：
10.1)用待筛选的药物处理高血糖细胞系，并测定上述的生物标志物组合中各 代谢物在药物处理组和对照组的含量；
11.2)对获取的对照组和模型组各代谢物含量信息进行预处理，使对照组和模 型组的各代谢物的峰对齐；
12.所述的预处理，是进行归一化、正交信号校正osc处理；
13.3)得到代谢物导入simca软件，进行pca分析，根据对照组和模型组的 分组趋势确定r2值和q2值；然后进行正交偏最小二乘法判别分析(opls
‑
da) 对获取的数据信息进行判别分析，得到分组模型后，将样品处理组得到代谢组导 入simca软件，得到预测值，
14.本发明再一个方面提供一种用于降血糖药物的筛选方法，是使用上述的筛选 降血糖药物的模型来筛选具有效果的降血糖药物组分；
15.所述的方法，包括如下的步骤：
16.1)用待筛选的药物处理高血糖细胞系，并测定上述的生物标志物组合中各 代谢物在药物处理组和对照组的含量；
17.2)对获取的对照组和模型组各代谢物含量信息进行预处理，使对照组和模 型组的各代谢物的峰对齐；
18.所述的预处理，是进行归一化、正交信号校正osc处理；
19.3)得到代谢物导入simca软件，进行pca分析，根据对照组和模型组的 分组趋势确定r2值和q2值；然后进行正交偏最小二乘法判别分析(opls
‑
da) 对获取的数据信息进行判别分析，得到分组模型后，将样品处理组得到代谢组导 入simca软件，得到预测值，代入到模型公式中，得到降血糖活性值；根据活 性值大小，确定样品的降血糖效果大小。
20.本发明方法通过系统生物学策略，通过一组或一群生物靶标综合评价抗氧 化活性，相对于单一指标而言，更加全面、准确。细胞代谢组学是以生物体内 源性物质为研究对象，使得复杂的生命体系与抗氧化活性有机的关联，与化学 方法比较，更具有代表性。细胞代谢组学所需样品量少、便于高通量筛选，与 体内法比较，具有明显的优势。细胞代谢组学主要基于lc
‑
ms和nmr等技术 手段，具有灵敏度高、选择性好、快速、准确性高、可控性强等多种优点，并 且能够真实反映细胞体系内的生物学信息，从而弥补了目前药物筛选方法的缺 陷，为建立新的药物筛选方法提供了思路。
附图说明
21.图1：高糖对ins
‑
1胰岛细胞细胞活力的影响图；
22.图2：高糖、二甲双胍及格列齐特对ins
‑
1细胞胰岛素分泌量的影响图；
23.图3：细胞代谢物gc
‑
ms图谱图；
24.图4：细胞代谢物lc
‑
ms图谱图；
25.图5：gc
‑
ms数据分析结果图；
26.图6：lc
‑
ms数据分析结果图；
27.图7：不同ejsg组opls
‑
da预测得分散点图a)及y预测值柱状图b)；
28.图8：ejsg为标准物质建立的标准曲线图；
29.图9：不同glqt组opls
‑
da预测得分散点图(a)及y预测值柱状图(b)；
30.图10：glqt为标准物质建立的标准曲线图；
31.图11：不同样品组的opls
‑
da预测得分散点图(a)及y预测值柱状图(b)；
32.图12：样品组的opls
‑
da预测得分散点图及y
‑
ii预测值柱状图。
具体实施方式
33.下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
34.实施例1建立模型
35.1、高血糖细胞模型的构建及验证
36.由图1可知，和对照组(5.6mm葡萄糖培养的细胞)比较，16.7mm、33.3mm 葡萄糖作用于细胞24h后，细胞存活率均有不同程度的下降，33.3mm葡萄糖组 细胞存活率下降为(81.23
±
1.21)％。33.3mm葡萄糖 5μmol/l盐酸二甲双胍组显 著高于33.3mm葡萄糖组(85.53
±
2.14)％，差异有统计学意义(p<0.05)。说明 16.7mm、33.3mm葡萄糖作用于细胞24h后，对ins
‑
1细胞具有损伤作用，而 33.3mm葡萄糖 5μmol/l盐酸二甲双胍能够缓解高糖对细胞的损伤作用；最终 确定33.3mm处理组是模型组。
37.胰腺细胞专门用于感知周围葡萄糖水平的升高，并通过释放胰岛素迅速做出 反应。由图2可知，与正常葡萄糖(5.6mm葡萄糖)处理组相比，33.3mm葡 萄糖作用于细胞后，5mm葡萄糖和25mm葡萄糖刺激胰岛素分泌量均升高，说 明高糖损伤后细胞分泌的胰岛素敏感性降低而使其胰岛素分泌量增加。33.3 mm 5μmol/l盐酸二甲双胍组胰岛素分泌量下降，差异具有统计学意义。33.3 mm 5μmol/l格列奇特组胰岛素分泌量增加，差异具有统计学意义。
38.2、生物标记物的发现及鉴定
39.gc
‑
ms和lc
‑
ms分析结果如图3和图4所示，得到的代谢物信息通过simca 软件分析(图5和图6)，得到了多种差异性代谢物，通过数据库和对照品鉴定 分析，gc
‑
ms得到26个标志物，分别为：甘露糖、牛磺酸、谷氨酰胺、肌醇、 腺嘌呤、谷氨酸、马尿酸、鸟氨酸、琥珀酸、肾上腺素、羟脯氨酸、色氨酸、赖 氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、苏糖醇、焦谷氨酸、丝氨酸、三羟丁酸、 亮氨酸、辛酸、棕榈反油酸、异亮氨酸、丙氨酸、假尿嘧啶核苷。lc
‑
ms数据 分析得到17个标志物，分别为：半胱氨酸、肌醇、柠檬酸、天冬氨酸、顺丁烯 二酸、苏氨酸、牛磺酸、精氨酸、氧化谷胱甘肽、还原谷胱甘肽、组氨酸、反丁 烯二酸、缬氨酸、蛋氨酸、胞嘧啶核苷、硝基酪氨酸、色氨酸。
40.通过对gc
‑
ms和lc
‑
ms得到的标志物进行分析，最终确认19种与二甲双 胍相关的潜在生物标志物，分别为：丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、还原谷胱甘肽、 氧化谷胱甘肽、苏氨酸、半胱氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、苯 丙氨酸、马尿酸、肌醇、硝基酪氨酸、胞嘧啶核苷、马来酸、延胡索酸、琥珀酸； 21种与格列奇特相关的潜在生物标志物，分别为：丙氨酸、丝氨酸、还原谷胱 甘肽、氧化谷胱甘肽、苏氨酸、半胱氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨 酸、苯丙氨酸、马尿酸、肌醇、硝基酪氨酸、马来酸、延胡索酸、琥珀酸、色氨 酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、组氨酸。
41.最终确定与降血糖药物的筛选相关的生物标志物组合为丙氨酸、丝氨酸、 谷氨酸、还原谷胱甘肽、氧化谷胱甘肽、苏氨酸、半胱氨酸、牛磺酸、异亮氨 酸、亮氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、马尿酸、肌醇、硝基酪氨酸、胞嘧啶核 苷、马来酸、延胡索酸、琥珀酸、色氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、组氨酸。
42.3、基于代谢组学技术的降血糖药物筛选方法的建立
43.3.1以ejsg为标准建立筛选方法
44.以ejsg(二甲双胍)相关的19个差异代谢物峰为变量，进行y值预测分 析。此时将
不同ejsg组细胞代谢物数据带入此回归方程，得到其对应的y值。 y值的大小反映了不同浓度ejsg活性的大小，并以此建立标准曲线。图7(a)为 基于对照组和模型组建立的opls
‑
da模型预测不同浓度ejsg降糖活性强弱得 分散点图。图中虚线为每组样品在x轴上的拟合值，从图中可以看出，ejsg 1
‑
5 组样品点逐渐远离模型组样品点，可定性的表明其降糖活性越来越大。图7(b) 为基于对照组和模型组建立的opls
‑
da模型预测不同浓度ejsg组y预测柱 状图。模型组y值为0，对照组为1，ejsg1
‑
5组的y值逐渐增大，可定量对 ejsg降活性强弱进行评价。
45.图7中各样品点ypred数值见表1，取模型组，取模型组，即0μm ejsg组， 1、5、10、20、40μm ejsg组的y预测值(ypred)平均数后进行曲线拟合。 将ejsg浓度作为横坐标，ypred作为纵坐标进行二次拟合，见图8，采用拟合 方程进行计算，拟合方程为：
46.y＝
‑
1.5*10
‑3x2 0.0692x 0.1059(0<x<40),r2＝0.882
47.其中x代表样品的预测值，y代表降血糖活性值，y值在0
‑
1之间，y值越 接近于1，说明降血糖效果越好；y值越接近0，说明降血糖效果越差。
48.表1不同浓度ejsg组ypred
‑
i值
[0049][0050][0051]
将1μm的降糖能力定义为1个活性单位，则此处将拟合方程进行逆运 算，以此定义：hypoglycemic activity
[0052]
hypoglycemic activity(ha
‑
1)unit＝[23.07
‑
3.33*(54.24
‑
60*ypred)
1/2
]*ha
‑
1μm ejsg
[0053]
利用该函数方程对待评价物质的降糖活性进行定量，选取一定浓度的待评价 样品在高糖存在状况下对细胞进行保护，取细胞代谢物进行y预测值带入方程 后可得到样品的降糖活性值。
[0054]
3.2以glqt为标准建立筛选方法
[0055]
以glqt(格列齐特)组细胞代谢物中21个差异代谢物峰为变量，进行y 值预测分析。此时将不同浓度glqt组细胞代谢物数据带入此回归方程，得到 其对应的y值。y值的大小反映了不同浓度glqt活性的大小，并以此建立标 准曲线。图9(a)为基于对照组和模型组
建立的opls
‑
da模型预测不同浓度glqt 降糖活性强弱得分散点图。图中虚线为每组样品在x轴上的拟合值，从图中可 以看出，glqt1
‑
5组样品点逐渐远离模型组样品点，可定性的表明其降糖活性 越来越大。图9(b)为基于对照组和模型组建立的opls
‑
da模型预测不同浓度 glqt组y预测柱状图。模型组y值为0，对照组为1，glqt1
‑
5组的y值逐 渐增大，可定量对glqt降活性强弱进行评价。
[0056]
图9中各样品点ypred数值见表2，取模型组，即0μm glqt组，1、5、 10、20、40μm ejsg组的y预测值(ypred)平均数后进行曲线拟合。将glqt 浓度作为横坐标，ypred作为纵坐标进行二次拟合，见图10，采用拟合方程进 行计算，拟合方程为：
[0057]
y＝
‑
7*10
‑4x2 0.0474x 0.1645(0<x<40),r2＝0.9522
[0058]
表2不同浓度glqt组ypred
‑
ii值
[0059][0060][0061]
将1μm的降糖能力定义为1个活性单位，则此处将拟合方程进行逆运 算，以此定义：
[0062]
hypoglycemic activity(ha
‑
2)unit＝[3.39
‑
0.71*(68.53
‑
280*ypred)
1/2
]*ha
‑
1μm glqt
[0063]
利用该函数方程对待评价物质的降糖活性进行定量，选取一定浓度的待评价 样品在高糖存在状况下对细胞进行保护，取细胞代谢物进行y预测值带入方程 后可得到样品的降糖活性值。
[0064]
4、基于代谢组学技术的降血糖药物筛选方法的应用
[0065]
4.1、样品准备
[0066]
利用上述建立的方法对表3中的样品进行评价
[0067]
表3样品资料表
[0068][0069]
4.2、以ejsg为标准品评价样品的降血糖活性
[0070]
图11(a)为a、b、c、d、e、f样品的预测得分散点图，可以对其降糖活 性进行定性分析。a、b、c样品为不同橄榄苦苷含量的油橄榄叶提取物，由图 可见，a离对照组较近，c离模型组较近，表明a的降糖活性较c强，b的降 糖活性介于a和c之间；d为鱼籽多肽粗提物，其点分布在对照组与模型组之 间，有一定的降糖效果；e为橄榄果渣乙酸乙酯提取，f为橄榄果渣正丁醇提取， 同为橄榄叶粗提物，由图可见，e离对照组较近，f离模型组较近，表明e的降 糖活性较f强。
[0071]
图11(b)为样品的opls
‑
da模型y预测柱状图，可以对降糖活性进行定 量分析。a的y预测值大于b和c的y预测值，表明其降糖活性强；样品d的 y预测值为0.2710，表明其降糖活性较弱；e的y预测值大于f，表明乙酸乙酯 提取物活性较正丁醇提取物强。取各组相应的y预测值，见表4，取平均后带入 方程hypoglycemic activity(ha
‑
i)unit＝[23.07
‑
(602.67
‑
666.67*ypred
‑
i) 1/2
]*ha
‑
1μm met
，可计算其降糖活性(表5)。
[0072]
表4：不同样品组ypred
‑
i值表
[0073][0074]
表5：不同样品降糖活性表
[0075][0076]
从表5中可见a、b、c作为不同含量橄榄苦苷油橄榄叶提取物，a的降 糖活性明显高于b和c且a>b>c，有明显的剂量依赖趋势。d ha
‑
i unit为2.53， 在这六个样品中，其降糖活性最低。e和f样品分别为橄榄果渣的乙酸乙酯提取 物和正丁醇提取物，e降糖活性ha
‑
i unit为8.44高于f降糖活性5.48。
[0077]
4.3、以ejsg为标准品评价样品的降血糖活性
[0078]
图12(a)为a、b、c、d、e、f样品的预测得分散点图，可以对其降糖 活性进行定性分析。a、b、c样品为不同橄榄苦苷含量的油橄榄叶提取物，由 图可见，a离对照组较近，c离模型组较近，表明a的降糖活性较c强，b的 降糖活性介于a和c之间；d为鱼籽多肽粗提物，其点分布在对照组与模型组 之间，有一定的降糖效果；e为橄榄叶乙酸乙酯提取，f为橄榄叶正丁醇提取， 同为橄榄叶粗提物，e离对照组较近，f离模型组较近，表明e的降糖活性较f 强。
[0079]
图12(b)为样品的opls
‑
da模型y预测柱状图，可以对降糖活性进行定 量分析。a的y预测值大于b和c的y预测值，表明其降糖活性强；样品d的 y预测值为0.1999，表明其降糖活性较其它样品弱；e的y预测值大于f，表明 乙酸乙酯提取物活性较正丁醇提取物强。取各组相应的y预测值，见表6，取平 均值后带入方程hypoglycemic activity(ha
‑
ii)unit＝[33.86
‑ꢀ
(1381.31
‑
1428.57*ypred
‑
ii)
1/2
]*ha
‑
1μm gld
，可计算其降糖活性，见表7。
[0080]
表6不同样品组ypred
‑
ii值
[0081]
[0082]
表7不同样品降糖活性
[0083][0084][0085]
从表7中可见a、b、c作为不同含量橄榄苦苷油橄榄叶提取物，a的降 糖活性明显高于b和c且a>b>c，有明显的剂量依赖趋势。d ha
‑
ii unit为 0.76，在这六个样品中，其降糖活性值最低。e和f样品分别为橄榄果渣的乙酸 乙酯提取物和正丁醇提取物，e降糖活性ha
‑
ii unit为8.50高于f降糖活性5.90。
[0086]
综上，本发明方法通过系统生物学策略，通过一组或一群生物靶标综合评价 抗氧化活性，相对于单一指标而言，更加全面、准确。细胞代谢组学是以生物体 内源性物质为研究对象，使得复杂的生命体系与抗氧化活性有机的关联，与化学 方法比较，更具有代表性。细胞代谢组学所需样品量少、便于高通量筛选，与体 内法比较，具有明显的优势。细胞代谢组学主要基于lc
‑
ms和nmr等技术手 段，具有灵敏度高、选择性好、快速、准确性高、可控性强等多种优点，并且能 够真实反映细胞体系内的生物学信息，从而弥补了目前药物筛选方法的缺陷，为 建立新的药物筛选方法提供了思路。