光甘草定在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途的制作方法

1.本发明涉及光甘草定在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途。


背景技术：

2.类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)是一种以对称性、侵蚀性和进行性的慢性关节炎症为表现的自身免疫性疾病，其主要病理特点为关节滑膜组织异常增生及侵袭和慢性炎症和血管翳的形成。流行病调查显示，ra全球发病率为0.5～1％，我国发病率为0.5％；随着病程的延长，ra导致关节血管翳形成和滑膜增生侵袭引起关节软骨及骨质破坏，最终导致关节畸形及功能障碍，10年以上患者致残率超过50％。ra不仅造成患者身体机能障碍，也给社会和家庭造成了心里和经济负担，被称作“不死的癌症”。现有治疗ra的药物主要有：激素类(如地塞米松)、缓解病情的抗风湿药(dmards，如甲氨蝶呤，jak抑制剂)、非甾体抗炎药(nsaids)、生物制剂(如重组tnf
‑
α、il
‑
6单抗制剂)等。然而，由于ra病程长，易复发，需要长期服药，现有的激素、nsaids和dmards等药物副作用较大，长期服用易造成一系列副作用，如胃肠道出血、溃疡以及肝肾毒性；生物机制价格高昂且并非对所有患者都有效，也给患者带来了巨大的经济压力。因此，研发其他确切有效、价格较低和副作用较小的替代治疗药物就显得很有必要。
3.ra滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthiritis synovial fibroblast,rasf)在ra的病理过程中发挥着重要作用，现有证据表明rasf与关节滑膜增生、关节炎症、血管翳形成、软骨和骨破坏等病理变化等密切相关。ra发生时，在炎症因子(如tnf
‑
α、il
‑
6等)的刺激下，rasf表现出类肿瘤细胞样的增生，自然凋亡受到抑制(低于3％)，造成滑膜细胞的增生增厚，侵袭软骨，造成软骨破坏。rasf可产生多种炎症因子如tnf
‑
α、il
‑
6、il
‑
8等，加重关节滑膜炎症；此外，rasf可分泌血管生成因子(vegf)等，从而诱导滑膜新生血管形成，形成血管翳。rasf还释放一系列蛋白水解酶，如基质金属蛋白酶(mmps)和组织蛋白酶等，造成软骨和骨组织的降解，导致关节功能损伤。因此，诱导ra患者关节rasf的凋亡被认为是治疗和控制ra的有效可行策略。
4.目前，中医药治疗ra有着独特的优势且副作用较西药小，近年来越来越受到重视。甘草为临床中医药辅助治疗ra使用频次最高的传统中药材之一，其主要活性成分为三萜、黄酮和多糖等，但还没有关于其中的活性成分能单独应用于类风湿关节炎的治疗研究报道。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了光甘草定在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途。
6.进一步地，所述药物是抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的药物。
7.更进一步地，所述药物是诱导类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的药物。
8.更进一步地，所述药物是上调类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中促凋亡相关基因的
药物。
9.更进一步地，所述相关基因为caspase
‑
3和caspase
‑
9基因。
10.更进一步地，所述药物是下调类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中凋亡抑制相关基因的药物。
11.更进一步地，所述相关基因为bcl
‑
2基因。
12.本发明最后提供了一种治疗类风湿关节炎的药物，它是以光甘草定为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
13.本发明光甘草定在制备治疗类风湿关节炎的药物中的新用途，通过作用机制研究发现，光甘草定(glabridin，gd)能显著抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞mh7a的增殖，其半数抑制率(ic
50
)低于30μg/ml，具有明显的量效和时效关系。其抑制mh7a细胞的作用与诱导凋亡发生密切相关，能够明显上调mh7a细胞中caspase
‑
3和caspase
‑
9基因，下调bcl
‑
2基因。光甘草定具有开发成为疗效好，安全性高的类风湿关节炎治疗药物的潜力，具有综合开发与应用前景。
14.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
15.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
16.图1光甘草定抑制mh7a细胞的增殖的量效和时效关系(a量效关系，b时效关系)
17.图2光甘草定对mh7a细胞的凋亡诱导作用
18.图3光甘草定上调mh7a细胞中caspase
‑
3和caspase
‑
9基因，下调bcl
‑
2基因
具体实施方式
19.实施例1
20.1实验材料
21.1.1药物
22.本发明药物：光甘草定(glabridin，gd)。
23.对照药物：生理盐水。
24.1.2细胞
25.人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞mh7a细胞(中国北京北纳生物科技)。
26.1.3主要试剂
27.annexin v
‑
fitc/pi凋亡检测试剂盒(武汉boster生物工程有限公司)；dmem高糖培养基(美国gibco生物)；mtt试剂盒(武汉boster生物)；trizol试剂(美国thermo fisher)；逆转录试剂盒(武汉boster生物)；扩增引物(上海生工)；人源肿瘤坏死因子(tnf)α(北京4a生物)。
28.1.4主要仪器
29.co2恒温细胞培养箱(美国thermo fisher)；酶标仪(美国bio
‑
rad)；流式细胞仪
(美国bd公司)；荧光定量pcr仪(美国bio
‑
rad)。
30.2实验方法
31.2.1细胞毒研究
32.采用mtt法测定光甘草定对mh7a细胞存活率的影响。取对数生长期的mh7a细胞进行消化，使用完全培养基进行细胞重悬后，以96孔培养板进行培养，每孔加入细胞悬液100μl(约2
×
103个细胞/孔)，设置6个复孔，置于培养箱中培养12h。随后,使用20ng/ml tnf
‑
α刺激mh7a(除正常组外)，并使用不同浓度的光甘草定(孔内终浓度0.5，1，2，4，8，16，32和64μg/ml)培养12h、24h、36h、48h和72h。在暗室环境下加入mtt(20μl/孔)，继续培养4小时，随后小心吸出培养基，注意不要破坏形成的结晶沉淀。加入dmso(150μl/孔)，水平摇床低速摇晃10min，待结晶充分融化。采用全自动微孔板检测器(检测波长570nm)测定孔内吸光度值，计算细胞活力(细胞增殖率/％)：
[0033][0034]
2.2流式细胞术凋亡作用研究
[0035]
(1)mh7a细胞被播种到6孔板(1
×
105/孔)中，在37℃培养12小时；
[0036]
(2)待胞贴壁后，孔内加入tnf
‑
α(20ng/ml)进行刺激，细胞加入光甘草定(孔内终浓度5，30μg/ml)干预处理24h；
[0037]
(3)处理完成后，细胞以不含edta的胰酶进行消化，并收集细胞；
[0038]
(4)细胞以pbs洗3次，离心，细胞沉淀加入500μl结合缓冲液重新混悬，再加5μlannexin v
‑
fitc，继续加5μl pi进行混匀；
[0039]
(5)室温下，在暗室中孵育10min，流式细胞仪上机检测tnf
‑
α刺激后的mh7a细胞凋亡情况，记录凋亡率/％。
[0040]
2.3 mh7a细胞中凋亡基因mrna的表达
[0041]
2.3.1细胞总rna提取
[0042]
(1)6孔板中加入mh7a细胞(2
×
105/孔)，贴壁后，tnf
‑
α细胞(20ng/ml)和光甘草定(5，30μg/ml)加入孔板中与细胞共培养24h；
[0043]
(2)倒掉培养基，pbs洗3次，低温条件下离心(<4℃)，mh7a细胞放入去rna酶的eppendorf离心管中，加入适量提前预冷的trizol，微量加样器不断来回抽吸破碎细胞，碎冰上静置5min；
[0044]
(3)eppendorf离心管中加入氯仿(0.2ml)，用力上下摇晃30s充分萃取，室温下静置5min，10000rpm离心20min(4℃)；
[0045]
(4)待分层后，吸取eppendorf离心管中上层液体，放入另一去rna酶的eppendorf离心管，加相同体积异丙醇，上下摇晃后，放置30min，10000r/min离心15min(4℃)，小心吸去上层液体，底部沉淀为rna；
[0046]
(5)75％乙醇1ml洗涤rna沉淀，10000r/min离心10min(4℃)，吸去上层液体，室温干燥rna沉淀10min；
[0047]
(6)rna沉淀加入depc h2o(20μl)溶解，检测并计算rna浓度及纯度，分装，
‑
80℃储存。
[0048]
2.3.2逆转录cdna
[0049]
(1)按照试剂盒规定的操作方法，加入各反应试剂到pcr反应管中，离心10s混匀；
[0050]
(2)在pcr仪上进行下列条件的反应将各组细胞rna逆转录为cdna：
[0051]
37℃，温育2min；
[0052]
55℃，孵育10min；
[0053]
85℃，10s，灭活酶。
[0054]
(3)将获得的逆转录产物立即取出保存于
‑
20℃，用于后续实验。
[0055]
2.3.3扩增
[0056]
(1)在冰上依次将2
×
qpcr mix 12.5μl、7.5μm基因引物2.0μl、逆转录产物2.5μl、ddh2o 8.0μl加入乳白色pcr反应管中，建立总体积为20μl的qrt
‑
pcr反应体系；
[0057]
(2)按拟定的反应参数，进行聚合酶链式反应：95℃预变性，10min；循环数35次(变性温度95℃，持续时间15s；退火温度60℃，持续时间60s)；60℃升温至95℃(每15s升温0.3℃)；
[0058]
(3)用于qrt
‑
pcr分析的引物见表1；
[0059]
表1.荧光定量pcr(qrt
‑
pcr)引物
[0060][0061]
f:正义引物,r:反义引物
[0062]
3结果与分析
[0063]
本发明检测了光甘草定(glabridin，gd)对mh7a细胞(一种典型的类风湿关节炎滑膜成纤维模型细胞系)的抗增殖作用，发现光甘草定的浓度为0.5μg/ml～64μg/ml时，能显著抑制mh7a细胞的细胞增殖，其半数抑制率(ic
50
)低于30μg/ml，并且具有明显的量效和时效关系(图1)，其对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞mh7a细胞系有显著的细胞毒作用。
[0064]
因此，本发明进一步对光甘草定对mh7a细胞的细胞毒的详细机制进行了研究，进一步流式细胞术分析研究发现，光甘草定抑制mh7a细胞增殖的作用与诱导mh7a发生细胞凋亡密切相关(图2)，实时荧光定量pcr实验表明光甘草定并且能够明显上调mh7a细胞中caspase
‑
3和caspase
‑
9基因，而下调bcl
‑
2基因(图3)。
[0065]
实验结果说明，光甘草定对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞具有显著的细胞增殖抑
制作用，在类风湿关节炎病程控制和症状改善方面具有很好的应用和开发潜力。