一种肝爽颗粒指纹图谱检测方法与流程

1.本发明属于图谱检测技术领域，涉及一种肝爽颗粒指纹图谱检测方法。


背景技术：

2.中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。中药指纹图谱的特点包括整体性、特征性及可量化等方面，突出中药的完整面貌，在研究中药有效成分，控制中药质量以及鉴别方面的作用越来越突出。
3.肝爽颗粒(国药准字z20027671)为保定步长天浩制药有限公司生产的独家中药品种，对急、慢性肝炎，肝硬化，肝功能损害有独特的疗效。肝爽颗粒由柴胡(醋制)、白芍、当归、茯苓、白术(炒)、党参、鳖甲(烫)、蒲公英、虎杖、枳壳、夏枯草、丹参、桃仁13味药材组成，功效疏肝健脾、清热散淤、保护肝脏、软坚散结。用于急慢性肝炎、肝硬化、肝功能损害。方中柴胡疏肝解郁；党参益气健脾，二药配伍疏肝健脾，共为君药。白术健脾燥湿，加强党参健脾之功；当归补血活血；丹参凉血活血；虎杖清热解毒；四药合用，清热散淤，用为臣药。茯苓健脾渗湿以助白术；白芍补血柔肝以加强当归补血之功；桃仁活血祛瘀，以配合丹参活血；鳖甲软坚散结；蒲公英清热解毒；夏枯草清热软坚；枳壳行气宽胸，与柴胡相配则一升一降，调气之功更著，上七位共为佐药。柴胡引诸药入肝胆，兼使药之用。诸药配伍，共奏疏肝健脾，清热散淤，软坚散结之功。
4.肝爽颗粒的现有药品标准中，主要通过芍药苷这一种单一成分对肝爽颗粒进行质量控制。但由于肝爽颗粒药味繁多，成分复杂，个别成分分析具有一定的片面性，要控制肝爽颗粒的质量，只针对其一两个化学成分进行表征和控制是不够的，难以全面反映药品的全面信息。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的技术问题，本发明提供一种肝爽颗粒指纹图谱检测方法，具有准确度高，稳定性高，重复性好的特点，能够较为全面反映肝爽颗粒的质量，保证产品的质量。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
7.一种肝爽颗粒指纹图谱检测方法包括以下步骤：
8.1)采用甲醇对肝爽颗粒进行超声提取，得到待检测供试品溶液；
9.2)采用超高效液相色谱法对供试品溶液进行高效液相色谱检测，记录40min内的色谱数据；根据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统a版》，由色谱数据生成肝爽颗粒指纹图谱；
10.所述超高效液相色谱法的条件为：色谱柱为waters acquity uplc h
‑
class柱；检测波长为210～400nm；流动相a为乙腈，流动相b为体积分数0.05％～0.2％的磷酸水溶液；流速为0.3～0.5ml/min；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序如下所示：
11.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)
09645928108713158713188515198020248020286040336040355050402080。
12.进一步的，所述步骤1)的具体过程是，精密称取肝爽颗粒粉末0.3g，并置于具塞锥形瓶中，加入50％～90％甲醇水溶液50ml，超声处理30min，放冷，采用50％～90％甲醇水溶液补足减失的质量，定容、摇匀，在1200rpm下离心10min，取上清液，过0.2～0.5μm微孔滤膜，过滤液为供试品溶液。
13.进一步的，所述超声功率为400～800w，超声频率为30～50khz，时间为20～60min。
14.进一步的，所述步骤2)中，色谱柱规格为2.1mm
×
50mm，1.7μm；柱温为30～50℃；进样体积为0.5～2μl。
15.进一步的，所述肝爽颗粒指纹图谱检测方法还包括以下步骤；3)配制混合对照品溶液，然后采用与供试品溶液相同的超高效液相色谱条件对混合对照品溶液进行测试，得到混合对照品溶液的色谱图；将混合对照品溶液的色谱图与步骤2)得到的肝爽颗粒指纹图谱进行对比，指认得出肝爽颗粒指纹图谱的色谱峰。
16.进一步的，所述混合对照品溶液的配制方法是，分别精密称取以下对照品：阿魏酸、虎杖苷、菊苣酸、柚皮苷、橙皮苷、迷迭香酸、新橙皮苷、丹酚酸b、大黄素和大黄素甲醚；并将称取的所有对照品与甲醇溶液混合配制成混合对照品溶液；所述混合对照品溶液中各对照品的的质量浓度分别为20μg/ml。
17.进一步的，以虎杖苷色谱峰为参照时，所述肝爽颗粒指纹图谱包括23个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为：
18.1号峰，相对保留时间为0.3195；
19.2号峰，相对保留时间为0.4468；
20.3号峰，相对保留时间为0.4712；
21.4号峰，相对保留时间为0.7869；
22.5号峰，相对保留时间为0.8963；
23.6号峰，相对保留时间为1；
24.7号峰，相对保留时间为1.0308；
25.8号峰，相对保留时间为1.1917；
26.9号峰，相对保留时间为1.4104；
27.10号峰，相对保留时间为1.4760；
28.11号峰，相对保留时间为1.5101；
29.12号峰，相对保留时间为1.5782；
30.13号峰，相对保留时间为1.7378；
31.14号峰，相对保留时间为1.8003；
32.15号峰，相对保留时间为1.9263；
33.16号峰，相对保留时间为2.0361；
34.17号峰，相对保留时间为2.1522；
35.18号峰，相对保留时间为2.2769；
36.19号峰，相对保留时间为3.0551；
37.20号峰，相对保留时间为3.1623；
38.21号峰，相对保留时间为3.3091；
39.22号峰，相对保留时间为3.5005；
40.23号峰，相对保留时间为3.7839。
41.进一步的，其中，5号峰为阿魏酸；6号峰为虎杖苷；7号峰为菊苣酸；11号峰为柚皮苷；12号峰为橙皮苷；13号峰为迷迭香酸；14号峰为新橙皮苷；16号峰为丹酚酸b；21号峰为大黄素；23号峰为大黄素甲醚。
42.本发明的有益效果是：
43.1、本发明提供的肝爽颗粒指纹图谱检测方法，得到的肝爽颗粒指纹图谱具有23个达到有效分离的共有峰，能够有效地表征肝爽颗粒的质量，有利于全面监控药物的质量、可靠性高。
44.2、本发明通过对18个不同批次的肝爽颗粒进行检测，结果表明，相同位置色谱峰的相对保留时间的rsd均在5％之内，说明本发明提供的指纹图谱具有较好的重现性，具有准确度高、稳定性高的特点。
附图说明
45.图1为本实施例200816批供试品色谱图；
46.图2为本发明实施例4混合对照品的超高效液相色谱图；图中：5号峰为阿魏酸；6号峰为虎杖苷；7号峰为菊苣酸；11号峰为柚皮苷；12号峰为橙皮苷；3号峰为迷迭香酸；14号峰为新橙皮苷；16号峰为丹酚酸b；21号峰为大黄素；23号峰为大黄素甲醚；
47.图3为本发明18个批次肝爽颗粒指纹图谱的叠加图谱；
48.图4为本发明不同波长色谱图。
具体实施方式
49.现结合附图以及实施例对本发明做详细的说明。
50.首先对实施过程中所使用的仪器、试剂进行说明。
51.1、仪器设备
52.waters acquity uplc h
‑
class液相色谱仪，配置四元泵、pad检测器(美国waters公司)；sqp型万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；te124s型分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；kq
‑
800kde型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；milliq型
纯水仪，(美国millipore公司)。
53.2、对照品、供试品及试剂
54.(1)对照品
55.阿魏酸(批号110773
‑
201915，质量分数99.4％)、虎杖苷(批号，质量分数％)、菊苣酸(批号111752
‑
201703，质量分数97.6％)、柚皮苷(批号110722
‑
201815，质量分数91.7％)、橙皮苷(批号110721
‑
201617，质量分数96.1％)、迷迭香酸(批号111871
‑
201706，质量分数90.5％)、新橙皮苷(批号111857
‑
201804，质量分数99.4％)、丹酚酸b(批号111562
‑
201716，质量分数94.1％)、大黄素(批号110756
‑
201913，质量分数96.0％)、大黄素甲醚(批号110758
‑
201817，质量分数99.2％)均购于中国食品药品检定研究院。
56.(2)供试品
57.本发明用肝爽颗粒的批号分别为：200814、200815、200816、201215、201217、201218、201219、201220、201221、210302、210303、210304、210306、210307、210308、210309、210310、210311均由保定天浩制药有限公司提供。
58.(3)试剂
59.乙腈，色谱纯，德国默克公司；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
60.实施例
61.本实施例提供的肝爽颗粒指纹图谱检测方法包括以下步骤：
62.1)采用甲醇对肝爽颗粒进行超声提取，得到待检测供试品溶液；
63.具体过程是，精密称取肝爽颗粒粉末0.3g，并置于具塞锥形瓶中，加入质量浓度为70％甲醇水溶液50ml，超声处理30min，放冷，采用质量浓度为70％甲醇水溶液补足减失的质量，定容、摇匀，在1200rpm下离心10min，取上清液，过0.3μm微孔滤膜，过滤液为供试品溶液。
64.本实施例中，超声功率为600w，超声频率为35khz，时间为20min。
65.本实施例中，肝爽颗粒为200816批供试品。
66.2)采用超高效液相色谱法对供试品溶液进行高效液相色谱检测，记录40min内的色谱数据(参见图1)；根据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统a版》，由色谱数据生成肝爽颗粒指纹图谱，参见图3；
67.本实施例提供的超高效液相色谱法的条件为：色谱柱为waters acquity uplc h
‑
class柱；色谱柱规格为2.1mm
×
50mm，1.7μm；柱温为40℃；进样体积为0.5μl；检测波长为300nm；流动相a为乙腈，流动相b为体积分数0.1％的磷酸水溶液；流速为0.5ml/min；洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱程序如表1所示：
68.表1梯度洗脱的洗脱程序
69.[0070][0071]
3)配制混合对照品溶液，然后采用与供试品溶液相同的超高效液相色谱条件对混合对照品溶液进行测试，得到混合对照品溶液的色谱图(参见图2)；将混合对照品溶液的色谱图与步骤2)得到的肝爽颗粒指纹图谱进行对比，指认得出肝爽颗粒指纹图谱的色谱峰。
[0072]
混合对照品溶液的配制方法是，分别精密称取以下对照品：阿魏酸、虎杖苷、菊苣酸、柚皮苷、橙皮苷、迷迭香酸、新橙皮苷、丹酚酸b、大黄素和大黄素甲醚；并将称取的所有对照品与甲醇溶液混合配制成混合对照品溶液；所述混合对照品溶液中各对照品的的质量浓度分别为20μg/ml。
[0073]
本实施例中，选择上述10种成分有依据：主要根据肝爽颗粒原药材在2020版药典中有记录的成分进行选择，同时结合指纹图谱中峰值较高的成分进行选择；即选择的这10种成分均为肝爽颗粒原材料中的主要成分。
[0074]
当以虎杖苷色谱峰为参照时，肝爽颗粒指纹图谱包括23个共有峰，其结果参见表3，然后对保留时间求平均值，得到各共有峰的平均相对保留时间分别为：
[0075]
1号峰，相对保留时间为0.3195；
[0076]
2号峰，相对保留时间为0.4468；
[0077]
3号峰，相对保留时间为0.4712；
[0078]
4号峰，相对保留时间为0.7869；
[0079]
5号峰，相对保留时间为0.8963；
[0080]
6号峰，相对保留时间为1；
[0081]
7号峰，相对保留时间为1.0308；
[0082]
8号峰，相对保留时间为1.1917；
[0083]
9号峰，相对保留时间为1.4104；
[0084]
10号峰，相对保留时间为1.4760；
[0085]
11号峰，相对保留时间为1.5101；
[0086]
12号峰，相对保留时间为1.5782；
[0087]
13号峰，相对保留时间为1.7378；
[0088]
14号峰，相对保留时间为1.8003；
[0089]
15号峰，相对保留时间为1.9263；
[0090]
16号峰，相对保留时间为2.0361；
[0091]
17号峰，相对保留时间为2.1522；
[0092]
18号峰，相对保留时间为2.2769；
[0093]
19号峰，相对保留时间为3.0551；
[0094]
20号峰，相对保留时间为3.1623；
[0095]
21号峰，相对保留时间为3.3091；
[0096]
22号峰，相对保留时间为3.5005；
[0097]
23号峰，相对保留时间为3.7839。
[0098]
本实施例中，相对保留时间均为平均值。
[0099]
本发明的23个共有峰中，5号峰为阿魏酸；6号峰为虎杖苷；7号峰为菊苣酸；11号峰为柚皮苷；12号峰为橙皮苷；13号峰为迷迭香酸；14号峰为新橙皮苷；16号峰为丹酚酸b；21号峰为大黄素；23号峰为大黄素甲醚。
[0100]
本实施例中，以虎杖苷为参照的。由于相对保留时间＝单个共有峰保留时间/虎杖苷保留时间，如果以肝爽颗粒中其他中药为参照，得到的相对共有峰保留时间与虎杖苷为参照得出的结果会有不同，但其结果会与虎杖苷为参照得出的结果会呈一定比例关系。本实施例中不一一进行试验说明，只采用以虎杖苷为参照说明，肝爽颗粒指纹图谱的准确性和可靠性。
[0101]
上述实施例中，待检测供试品溶液的配制时，甲醇水溶的质量浓度为50％～90％，微孔滤膜的大小在0.2～0.5μm内，超声功率在400～800w内，超声频率在30～50khz，时间为20～60min之内均可。超高效液相色谱法时，检测波长在210～400nm；流动相b为体积分数0.05％～0.2％的磷酸水溶液；流速为0.3～0.5ml/min；色谱柱柱温为30～50℃；进样体积为0.5～2μl之内均可得到色谱图。
[0102]
为了进一步说明本发明提供的检测方法的优越性，进行以下实验验证。
[0103]
试验1精密度实验
[0104]
本实施例提供的肝爽颗粒指纹图谱检测方法包括：
[0105]
(1)取肝爽颗粒(200816批)，精密称取肝爽颗粒粉末0.3g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇水溶液50ml，超声处理30min，放冷，用70％甲醇水溶液补足减失的质量，摇匀，离心(1200rpm，10min)，取上清液，过0.22μm微孔有机滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0106]
(2)采用下列超高效液相色谱条件对供试品溶液进行测试，
[0107]
色谱柱：waters acquity uplc h
‑
class柱；
[0108]
检测波长：300nm；
[0109]
流动相：流动相a为乙腈，流动相b为体积分数0.1％的磷酸水溶液；
[0110]
洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序如表1所示；
[0111]
流速：0.4ml/min；
[0112]
柱温：40℃；
[0113]
色谱柱规格：2.1mmx50mm,1.7μm；
[0114]
进样体积：1μl；
[0115]
按照上述色谱条件连续进样6针，得到肝爽颗粒一个批次的色谱图(参见图1)，以虎杖苷色谱峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果如表2和表3所示：
[0116]
表2精密度实验(各共有峰的相对峰面积)
[0117][0118][0119]
注：(s)为参照峰
[0120]
表3精密度实验(各共有峰的相对保留时间)
[0121][0122][0123]
由表2和表3可知，各共有峰的相对峰面积rsd％＜5％、相对保留时间rsd％＜5％，说明本实施例提供的检测方法精密度良好。
[0124]
试验2重复性实验
[0125]
本实施例提供的肝爽颗粒指纹图谱检测方法包括：
[0126]
(1)取肝爽颗粒(200816批)，平行称取6份，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按实施例1中色谱条件分别进样，得到肝爽颗粒一个批次的色谱图，参见图1，并以虎杖苷色谱峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，
并计算rsd值，结果如表4和表5所示。
[0127]
表4重复性实验(各共有峰的相对峰面积)
[0128][0129][0130]
表5重复性实验(各共有峰的相对保留时间)
[0131][0132][0133]
由表4和表5可知，各共有峰的相对峰面积rsd％＜5％、相对保留时间rsd％＜5％，说明该方法重复性良好。
[0134]
试验3稳定性实验
[0135]
本实施例提供的肝爽颗粒指纹图谱检测方法包括：
[0136]
(1)取肝爽颗粒(200816批)，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例1中色谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h条件进样，以虎杖苷色谱峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果如表6和表7
所示。
[0137]
表6稳定性实验(各共有峰的相对峰面积)
[0138][0139][0140]
表7稳定性实验(各共有峰的相对保留时间)
[0141][0142][0143]
由表6和表7可知，各共有峰的相对峰面积rsd％＜5％、相对保留时间rsd％＜5％，说明供试品溶液在24h内基本稳定。
[0144]
试验4相似度和稳定性
[0145]
本实施例提供的肝爽颗粒指纹图谱检测方法包括：
[0146]
(1)供试品溶液的制备
[0147]
取以上18个批次的肝爽颗粒，批号依次为200814、200815、200816、201215、201217、201218、201219、201220、201221、210302、210303、210304、210306、210307、210308、
210309、210310、210311，分别编号为s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7、s8、s9、s10、s11、s12、s13、s14、s15、s16、s17、s18分别精密称取肝爽颗粒粉末0.3g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇水溶液50ml，在功率800w，频率40khz下超声处理30min，放冷，用70％甲醇水溶液补足减失的质量，摇匀，离心(1200rpm，10min)，取上清液，过0.22μm微孔有机滤膜滤过，取续滤液，得18个批次的中药复方制剂供试品溶液。
[0148]
(2)混合对照品溶液的制备
[0149]
分别精密称取各对照品适量，加甲醇配制成含阿魏酸、虎杖苷、菊苣酸、柚皮苷、橙皮苷、迷迭香酸、新橙皮苷、丹酚酸b、大黄素、大黄素甲醚的质量浓度分别为20μg/ml的混合对照品溶液，即得。
[0150]
(3)超高效液相色谱条件
[0151]
色谱柱：waters acquity uplc h
‑
class柱(规格为2.1mm
×
50mm，1.7μm)；
[0152]
流动相：流动相a为乙腈，流动相b为体积分数0.1％的磷酸水溶液；
[0153]
洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱方式如表1所示；
[0154]
流速：0.4ml/min；
[0155]
柱温：40℃；
[0156]
进样量：1μl；
[0157]
检测波长：300nm；
[0158]
(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1μl，采用上述超高效液相色谱条件进行测试，分别得到供试品溶液的液相色谱和对照品溶液的液相色谱。
[0159]
对照品溶液的液相色谱如图2所示，图2中5号峰为阿魏酸、6号峰为虎杖苷、7号峰为菊苣酸、11号峰为柚皮苷、12号峰为橙皮苷、13号峰为迷迭香酸、14号峰为新橙皮苷、16号峰为丹酚酸b、21号峰为大黄素、23号峰为大黄素甲醚对照品。
[0160]
将供试品溶液的液相色谱导入指纹图谱相似度评价软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统a版》分析，以s1供试品作为对照图谱，选取“时间窗宽度”为0.1min，采用平均数法计算，多点校正、数据匹配，生成叠加色谱图，即18个批次的肝爽颗粒指纹图谱(如图3所示)；以18批供试品图谱为基础的“共有模式”以及生成的对照图谱。
[0161]
将18批制剂的指纹图与生成的对照图谱进行相似度分析，计算各共有峰的相对保留时间，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间，并计算rsd值。结果如表8、表9所示：
[0162]
表8 18批制中药复方剂指纹图谱相似度
[0163]
[0164][0165]
表9 18批次中药复方制剂指纹图谱相对保留时间测定结果
[0166][0167]
[0168][0169]
由表8和表9可知，不同批次肝爽颗粒指纹图谱与对照图谱的相似度均在0.99之上，表明不同批次间的相似度较高；不同批次肝爽颗粒各共有峰相对保留时间rsd％＜5％，表明本发明提供的测试方法稳定性较好。
[0170]
试验5波长确定
[0171]
按照试验4中s3批次供试品溶液的配制方法以及测试方法进行实验，区别在于，本试验分别在检测波长210nm、235nm、330nm条件下进行实验。
[0172]
将试验4中s3批次供试品溶液的色谱图(波长300nm)、与本试验种不同检测波长下供试品的色谱图进行对比，结果如图4所示。
[0173]
由图4中检测波长210nm的色谱图、235nm的色谱图、300nm的色谱图、330nm的色谱图可知，本发明将检测波长设置为300nm，能够检测的色谱峰数量最多、色谱峰响应值较高、基线较平稳。