本申请要求2016年6月6日提交的国际专利申请号pct/cn2016/084986的权益，该申请的内容通过引用以其全文并入本文。
背景技术：
对流体成分的浓度的测量在医学、生物医学研究和生物技术中是重要的。例如，期望监测患者血液中包括小分子在内的各种分子的浓度。实际上，小分子在生命科学的所有方面都发挥着非常重要的作用，因为它们广泛地参与多种细胞过程，如细胞信号传导、酶活性和分子运输。生物学和医学的进步已经导致鉴定出与人类疾病有关的大量小分子。在药物发现中，小分子构成了一个大而快速增长的活性药物文库。小分子还被广泛用作探索生物功能和评估新兴治疗剂的研究工具。
诸如糖尿病等慢性疾病的治疗可能需要连续监测一种或多种血液成分，如葡萄糖，其浓度在过高或过低时可能是危险的。血液内含物的快速和精确测量允许检测这些内含物的不希望的变化以及更有效和响应性地治疗潜在病况。
然而，对生命系统中小分子的特异且灵敏的检测是非常具有挑战性的。许多先前的监测血液浓度的方法需要从患者取出血液以用于外部分析，从而因依赖于患者顺应性或者需要植入装置而响应速度较差，并且这些装置的生物相容性较差或对血液浓度变化的精确度和灵敏度较差。例如，电化学转换器面临诸如响应受损和不可预测的信号漂移等难以解决的问题，从而需要频繁更换这类转换器的植入电极。还应用了诸如拉曼技术等光学技术。然而，尽管一些独特的拉曼标记可以在细胞的典型拉曼沉默区域中生成信号，但来自小分子的拉曼信号往往较弱并且可能很容易被与主要生物物质的强烈重叠所掩盖。因此，对于诸如氨基酸、糖、脂质、神经递质、代谢物和药物分子等完整小分子的体内实时检测是非常具有挑战性的。
在检测诸如蛋白质或核酸链等大分子时出现了更大的问题，由于它们的数目很大，因此需要更高的测量特异性。迄今为止，在体内，这类流体成分的实时检测通常被证明是不切实际的。
因此，需要提供能够以高的响应速率、特异性和灵敏度监测流体成分的浓度的改进的传感器和方法。本公开内容解决了这一需求以及更多的其他需求。
技术实现要素：
本公开内容提供了转换器传感器以及使用这些传感器来监测流体成分浓度的方法。
在各个方面，本公开内容提供了用于颗粒特异性浓度测量的纳米颗粒转换器。所述纳米颗粒转换器包含含有发色团的纳米颗粒，和酶。所述酶与所述纳米颗粒偶联。所述酶被配置用于催化反应。所述反应包含多种反应元素，包括一种或多种反应物和一种或多种产物。所述发色团发射荧光，所述荧光的量由所述多个反应元素中的反应元素的浓度决定。
已经开发出半导体聚合物点(pdot)作为新一类的荧光纳米颗粒。与有机染料和荧光蛋白质相比，pdot可以具有高出数量级的亮度并且更耐光漂白。例如，pdot可以比量子点亮一个数量级。此外，pdot的尺寸可以从几纳米调节到几十纳米而不影响它们的光谱性质。在用大纳米颗粒进行标记可能扰乱标记生物分子的天然行为的情况下，尺寸小的pdot是期望的。小的pdot还可用于拥挤的细胞或细胞间空间，它们可以在其中更好地渗透和分布自身。已经开发了各种方案来控制pdot的表面性质和生物缀合，这使得pdot能够用于细胞表面和亚细胞标记。另外，已经开发出基于pdot的比率传感器，包括针对ph、温度、诸如氧和过氧化氢等小分子以及诸如铁和铜等离子的传感器。
在一些方面，本公开内容提供了一种用于测量葡萄糖浓度的pdot转换器。所述pdot转换器包含pdot，所述pdot包括发射荧光的发色团，所述荧光由氧浓度决定。葡萄糖氧化酶与所述pdot偶联。所述葡萄糖氧化酶被配置用于催化涉及反应元素的反应。所述反应元素包括作为反应物的葡萄糖和氧。所述发色团在第一荧光波长和第二荧光波长发荧光；所述第一荧光波长处的荧光的量随氧浓度而变化。因此，所述pdot转换器包括的荧光比率等于在所述第一荧光波长处的荧光量与在所述第二荧光波长处的荧光量的比率，并且所述荧光比率由氧浓度决定。所述氧浓度受所述酶催化的与葡萄糖的反应影响；因此，所述荧光比率随所述葡萄糖浓度而变化，从而提供葡萄糖浓度的测量。
在各个方面，本公开内容提供了一种确定流体中分析物的浓度的方法。所述方法包括使所述流体与如本文所述的纳米颗粒转换器接触，以及测量所述纳米颗粒转换器的荧光。所述方法进一步包括基于所测量的荧光确定所述流体中分析物的浓度。
在各个方面，提供了一种用于测量血液中目标反应物的浓度的设备。所述设备包含多个荧光纳米颗粒转换器。所述设备进一步包含耦合至处理器和存储器的光学传感器。所述存储器包含指令，所述指令在被执行时致使所述处理器被配置为使用所述光学传感器来测量由所述多个荧光纳米颗粒转换器发射的荧光。所述荧光纳米颗粒转换器可以放置在与来自受试者血液的流体接触的皮下位置。当所述光学传感器面向皮肤时，所述光学传感器可适合于检测由所述多个荧光纳米颗粒转换器通过皮肤透射的荧光。
在各个方面，本公开内容提供了一种测量流体中分析物的浓度的方法。在所述流体内提供pdot。所述pdot包含发色团，并且所述发色团发射荧光，所述荧光的量由流体组分的浓度决定。所述分析物引起所述流体中的反应，并且所述反应改变所述流体组分的浓度。测量由所述发色团发射的荧光，所述流体中分析物的浓度是基于所测量的荧光。
在各个方面，提供了一种人造胰腺，其包含采用纳米颗粒转换器的葡萄糖传感器，从而提供反馈回路以触发胰岛素的分配以将血糖浓度维持在预定范围内。在一些方面，所述人造胰腺是可植入装置，而在一些方面，所述人造胰腺被配置用于葡萄糖浓度的透皮光学感测和胰岛素的注射。所述人造胰腺包含葡萄糖敏感的纳米颗粒转换器、照明源和适合于检测纳米颗粒发射波长处的荧光的检测器。所述装置进一步包含处理器，以根据所测量的荧光确定血糖浓度以及通过胰岛素泵调节胰岛素从储存腔室向患者的分配。所述检测器、处理器和泵提供反馈回路以将血糖水平维持在预定浓度范围内，所述浓度范围可任选地是用户可调节的。在一些方面，所述装置还包含存储器，其存储随时间测量的葡萄糖水平的对数。在一些方面，所述装置包含发射器以允许与移动装置和/或通过计算机网络进行无线通信。在一些方面，所述纳米颗粒转换器、光学传感器和处理器集成在一起，并且放置在皮下位置以检测来自与来自受试者血液的流体接触的多个纳米颗粒转换器的荧光。在一些方面，处于皮下位置的包含纳米颗粒转换器、检测器和处理器的集成装置可以通过皮肤与移动装置和/或通过计算机网络进行无线通信。
本公开内容提供了使用基于纳米颗粒如半导体聚合物点(pdot)的光学明亮转换器对分析物的灵敏检测和体内动态监测。荧光pdot是高度明亮且通用的纳米颗粒平台，用于生物成像和传感应用。在某些方面，氧响应性pdot与表面上的耗氧酶缀合，以灵敏地检测生物环境中小分子底物形式的分析物。在某些方面，所述分析物是葡萄糖。基于酶促反应速率常数和菲克氧扩散定律(fick’slawofoxygendiffusion)的本文公开的特定葡萄糖敏感转换器的分析建模和模拟表明，在典型的组织氧浓度下可以很好地区分不同浓度的小分子。还描述了实验结果，其展示了小鼠模型中的细胞内葡萄糖检测和血糖的长期体内动态监测。考虑到耗氧酶的较大文库，以及已知消耗或生成可针对其使用适当灵敏的荧光发色团的合适流体组分的其他酶，这种方法可以推广用于体内检测范围广泛的小分子，包括例如氨基酸、递质(例如，神经递质)、代谢物和药物。
提供本发明内容是为了以简要形式介绍在下文的详细描述中进一步描述的概念的一个选集。本发明内容并非旨在标识所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用作帮助确定所要求保护的主题的范围。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单个地指出每一单个出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐明。通过参考对利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的以下详细描述和附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，附图中：
图1a至图1h图示了使用来自用葡萄糖氧化酶催化的反应的o2调节信号检测葡萄糖的示例性纳米颗粒转换器的模拟o2消耗动力学和分布曲线。图1a和图1b分别图示了封闭比色皿和开放比色皿中的葡萄糖诱导的o2消耗动力学。图1c图示了具有5nmgox和20mm葡萄糖的体系沿着开放比色皿配置的z轴的时间和空间氧分布的3-d绘图。图1d图示了在500秒的时间点，具有不同葡萄糖浓度的开放比色皿中的氧分布曲线。图1e图示了在封闭组织氧环境中的o2消耗动力学。图1f图示了在具有氧扩散的组织中的o2消耗动力学。图1g图示了在20秒的时间点，具有氧扩散的圆形配置的2-d映射。图1h图示了在20秒的时间点，在具有和没有氧扩散的情况下用于葡萄糖测定的氧消耗的灵敏度。
图2a至图2d图示了包含pdot-gox组装物的纳米颗粒转换器的制备和表征。图2a是用于体内葡萄糖监测的pdot-gox生物缀合物的形成的示意图。图2b图示了裸pdot和pdot-gox的流体动力学直径。图2c图示了羧基pdot和pdot-gox的ζ电位。图2d图示了羧基pdot(左)和pdot-gox(右)的代表性tem图像。
图3a至图3d图示了纳米颗粒转换器如pdot转换器的其他特性。图3a图示了pdot-gox转换器在30天内的胶体稳定性。图3b示出了pdot-gox传感器的紫外-可见吸收光谱和光致发光光谱。图3c图示了聚芴纳米颗粒(pdhf)的荧光发射与磷光染料(ptoep)的吸收之间的光谱重叠。图3d图示了未掺杂的pdhfpdot和ptoep掺杂的pdot的发射光谱，其中激发波长为380nm。
图4a至图4d图示了pdot-gox纳米颗粒转换器的光谱性质。图4a示出了在不同葡萄糖浓度下pdot-gox转换器的发射光谱。图4b示出了随葡萄糖浓度变化的pdot-gox转换器的比率校准绘图(i648/i428)。图4c图示了在水性悬浮液中pdot-gox对葡萄糖的响应曲线。图4d图示了相对于潜在的干扰性碳水化合物，pdot-gox转换器对葡萄糖的选择性。
图5a和图5b图示了在低浓度下用酶密集包覆的纳米颗粒用于感测的用途。图5a图示了在各个葡萄糖浓度下，密集包覆gox的pdot的发射光谱。图5b示出了低分析范围内的pdot-gox的比率校准绘图(i648/i428)。
图6a至图6d图示了用包括pdot-gox转换器的各种材料处理的hela细胞的细胞活力。图6a至图6c分别示出了用不同浓度的pdot-gox转换器、gox和过氧化氢酶处理的细胞的24小时细胞活力。图6d示出了用约1:6比率的pdot-gox转换器和过氧化氢酶处理的细胞。
图7a至图7c图示了hela细胞中的细胞内葡萄糖感测。图7a示出了没有pdot-gox温育的hela细胞，作为对照组；图7b示出了在无糖培养基中与pdot-gox纳米颗粒温育24小时的细胞；而图7c示出了与pdot-gox温育24小时并补充葡萄糖4小时的细胞。
图8a图示了用pdot-gox转换器对小鼠进行的皮下荧光成像。图8a图示了具有不同浓度的pdot-gox转换器的三个注射部位的小鼠的荧光成像。图8b示出了注射有pdot-gox的三个不同部位的荧光强度。
图9示出了皮下注射纳米颗粒转换器的小鼠在室内光(顶部)和uv(底部)下的图像。
图10a至图10d图示了在活小鼠中的体内连续葡萄糖监测。图10a示出了注射有pdot-gox的活小鼠中不同葡萄糖浓度的体内荧光成像。图10b示出了在不施用葡萄糖和胰岛素的情况下，对照组的活小鼠中的pdot-gox的体内荧光成像。图10c示出了在活小鼠中注射的pdot-gox转换器的荧光强度和从来自剪断的尾巴的血液样品测量的葡萄糖浓度。图10d示出了在不施用葡萄糖和胰岛素的情况下，对照组中pdot-gox对血糖浓度的荧光响应。
图11a至图11f图示了长期葡萄糖监测和体内分布。图11a示出了皮下注射有pdot-gox转换器(底部)或灭菌的磷酸盐缓冲盐水(顶部)的小鼠的切除器官和皮肤组织的荧光图像。图11b示出了在从注射小鼠和对照小鼠收获的器官和组织中分布的pdot-gox的荧光强度的定量(*p<0.05)。图11c至图11e分别示出了在皮下施用后的7天、15天和30天，注射的pdot-gox响应血糖浓度的荧光强度。图11f图示了从用pdot-gox注射的小鼠(右)和用pbs注射的对照组(左)切除的器官切片的苏木精和伊红染色。
图12示出了在纳米颗粒转换器注射后30天对小鼠组织切片的组织化学分析。
图13a至图13c示出了在用纳米颗粒转换器注射后7天(图13a)、15天(图13b)和30天(图13c)的活小鼠的荧光成像。
图14a示出了用微型化荧光计进行的体内葡萄糖测量。图14a示出了皮下注射pdot-gox的小鼠在紫外光(385nm)下的照片。图14b图示了活小鼠中所植入的pdot-gox转换器在385nm激发下的荧光发射光谱的动力学变化。图14c示出了在葡萄糖和胰岛素注射后，活小鼠中所植入的pdot-gox转换器的强度比变化(650nm相对于480nm)。
图15a和图15b示出了在用于检测葡萄糖的pdot-gox转换器中，具有包含do-pfo、10％pdoep和10％psma的发色团的纳米颗粒转换器的荧光发射。图15a示出了多个葡萄糖浓度的发射光谱。图15b示出了所述转换器检测在0至约20mm的浓度范围内的葡萄糖的校准绘图，显示了整个范围内的比率响应曲线。图15c示出了体内鼠响应数据，显示发射曲线基本上跟踪所测量的葡萄糖浓度。图15d示出了接受葡萄糖的小鼠(顶部图像)和未接受葡萄糖的对照组(底部图像)的具有时间数据的图像。
图16a和图16b示出了在用于检测葡萄糖的pdot-gox转换器中，具有包含psma、1％pdoep和0.1％香豆素1的发色团的纳米颗粒转换器的荧光发射。图16a示出了多个葡萄糖浓度的发射光谱。图16b示出了所述转换器检测在0至约20mm的浓度范围内的葡萄糖的校准绘图，显示了比率响应曲线。
图17a和图17b示出了在用于检测葡萄糖的pdot-gox转换器中，具有包含psma、1％ptoepk和0.1％尼罗红的发色团的纳米颗粒转换器的荧光发射。图17a示出了多个葡萄糖浓度的发射光谱。图17b示出了所述转换器检测在0至约20mm的浓度范围内的葡萄糖的校准绘图，显示了比率响应曲线。
图18a和图18b示出了在用于检测抗坏血酸的纳米颗粒传感器中，具有包含pdhf、10％ptoep和10％psma的发色团的纳米颗粒转换器的荧光发射。图18a示出了多个抗坏血酸浓度的发射光谱。图18b示出了所述转换器检测在约2至约20mm的浓度范围内的抗坏血酸的校准绘图，显示了整个范围内的比率响应曲线。
图19a和图19b图示了使用纳米颗粒传感器在活小鼠中的体内连续抗坏血酸监测。图19a图示了在施用不同浓度的抗坏血酸的活小鼠中，所注射的纳米颗粒传感器的荧光强度。图19b示出了在具有注射的pdot传感器的活小鼠中，不同抗坏血酸浓度的体内荧光成像。
图20a和图20b图示了通过微型化光学检测系统的抗坏血酸血液浓度监测。图20a示出了在385nm激发下，活小鼠中注射的pdot对抗坏血酸的血液浓度的荧光发射光谱的动力学变化。图20b示出了在静脉内施用抗坏血酸后，对抗坏血酸的血液浓度的随时间变化的荧光强度响应。
图21示出了包含纳米颗粒-gox组装物的基于h2o2的纳米颗粒转换器的光谱响应。
具体实施方式
本公开内容大体涉及使用纳米颗粒转换器监测流体中分析物浓度的设备、组合物、系统和方法。在许多方面，分析物是流体中的分子。在许多方面，流体是血液；例如，本文公开的组合物、系统和方法可用于监测受试者血液中一种或多种选定分子的浓度。在许多方面，流体是泪液；例如，本文公开的组合物、系统和方法可用于监测受试者泪液中一种或多种选定分子的浓度。在许多方面，流体是汗液；例如，本文公开的组合物、系统和方法可用于监测受试者汗液中一种或多种选定分子的浓度。在许多方面，流体是唾液；例如，本文公开的组合物、系统和方法可用于监测受试者唾液中一种或多种选定分子的浓度。在许多方面，流体是淋巴液；例如，本文公开的组合物、系统和方法可用于监测受试者淋巴液中一种或多种选定分子的浓度。在许多方面，流体是脊髓液；例如，本文公开的组合物、系统和方法可用于监测受试者脊髓液中一种或多种选定分子的浓度。在许多方面，流体是尿液；例如，本文公开的组合物、系统和方法可用于监测受试者尿液中一种或多种选定分子的浓度。
如本文所用，术语“聚合物点”或“pdot”是指一种颗粒结构，其包括一种或多种塌缩形成稳定的亚微米大小颗粒例如纳米颗粒的半导体聚合物。在一些方面，聚合物点是发射可调(例如，从可见光区域到近红外区域)的高度荧光性的纳米颗粒。聚合物点可包括发色聚合物，其可以例如吸收光并随后通过荧光发射光。在一些实施方案中，聚合物点包括至少一种缩合聚合物，例如，半导体聚合物。对于具有多于一种缩合聚合物(例如，多于一种半导体聚合物)的聚合物点，缩合聚合物可以是相同或不同类型的聚合物。例如，pdot可包含半导体聚合物和非半导体聚合物二者。
可以由适当选择的酶、纳米颗粒和发色团组装用于监测选定分析物的纳米颗粒转换器。酶可以被选择为催化包括分析物的反应的酶，使得分析物的浓度可以影响反应速率。该反应可包括多种反应元素，包括反应物和产物。可以选择酶，使得其催化的反应的每种反应物存在于待分析的流体中。可以选择发色团，使得发色团的荧光由酶所催化的反应的反应物或产物的浓度决定。可以选择纳米颗粒以允许酶和发色团二者并入到纳米颗粒中或与纳米颗粒缀合。例如，纳米颗粒可以是pdot，允许酶共价键合到pdot并且允许发色团并入到和/或共价键合到pdot。在一些情况下，发色团可构成纳米颗粒的全部或基本上全部；例如，在一些情况下，pdot可以完全或基本上完全由一种或多种发色团制成。
在许多方面，可以如下从一组潜在的酶、发色团和纳米颗粒中选择酶、发色团和纳米颗粒以产生用于检测给定分析物的纳米颗粒转换器：从一组酶中选择催化其中分析物为反应物的反应的酶。对于每个这样的反应，鉴定出浓度将会因反应发生而改变的其他反应元素—例如，每次发生反应时，反应物浓度下降并且产物浓度上升(对于可逆反应，反应的逆转导致相反的效果)。从这些反应元素中，对于每种酶，从该组发色团中鉴定出荧光量响应于一种反应产物的浓度变化而变化的相应发色团。如果没有发色团匹配，则去除该酶。从剩余的那些酶/发色团对中选择一个这样的对并选择各自均可以偶联至和/或并入的纳米颗粒，如pdot，从而选择用于构建纳米颗粒转换器的元素。可以从发色团列表中选择以不同波长发射并且不响应任何反应元素而改变其强度的第二发色团，以用作对照发色团。或者，如果最初选择的发色团发射强度响应于反应物或产物浓度而改变的某波长的荧光并且发射强度不变的不同波长的荧光，则该单个发色团可用作其自身的对照。
在许多方面，本文所述的纳米颗粒转换器包含催化包括分析物的反应的酶。该反应具有反应元素，包括反应物和产物，其中之一是分析物。纳米颗粒包含发色团，其响应于光束照射而发射一个或多个波长下的荧光。至少一个波长下的荧光量取决于除分析物之外的反应物或产物分子的浓度。纳米颗粒的酶和发色团接近；因此，当酶催化的反应消耗反应物并产生产物时，所述反应物和产物的各自浓度发生变化，其中反应物浓度降低并且产物浓度增加。以升高的浓度存在的分析物使反应比低浓度下更快地进行，因此分析物的存在导致相对高的产物浓度和相对低的反应物浓度。因为发色团的荧光量取决于反应物或产物之一，所以来自发色团的荧光量通过在反应进行时改变其他反应元素的浓度来影响发色团的荧光量。因此，纳米颗粒的酶和发色团一起充当转换器，从而将分析物浓度的变化转化为荧光的变化。在一些方面，使用转换器的一个波长发射的荧光强度来确定分析物浓度。在一些方面，使用转换器的两个波长发射下的荧光强度比来确定分析物浓度。可以以波长选择性方式容易地测量该荧光，以根据光学传感器的信号确定分析物的浓度。
在一些方面，纳米颗粒包含半导体聚合物，其响应于用光束照射而在一个或多个波长下发射荧光。至少一种波长的荧光量取决于除分析物之外的反应物或产物分子的浓度。在一些情况下，纳米颗粒包含半导体聚合物和发射一个或多个波长下的荧光的染料。染料可以物理掺杂或化学附接至半导体聚合物以形成纳米颗粒。半导体聚合物可以具有向染料的能量转移，以增强或放大染料的荧光强度。
在许多方面，本文所述的流体是在受试者体内的流体，如血液、汗液、泪液、淋巴液、脊髓液、尿液、唾液，或身体组织内或由身体组织分泌的其他流体。受试者可以是动物，并且在许多方面，受试者是人。
本公开内容的各个方面提供了发色团，其特征有利于使用本文提供的纳米颗粒转换器有效且准确地测量分析物浓度。这些特征的实例包括但不限于：(1)高亮度，因此可以容易地检测和恢复转换器信号；(2)对由酶催化的反应的反应元素的高灵敏度；(3)高吸收截面，因此在不需强能量施加的情况下可以容易地诱导纳米颗粒转换器荧光；(4)良好的稳定性(例如，热稳定性)，因此纳米颗粒转换器可在体内长时间保持活性；(5)能够被检测和区分(在一些情况下包括透皮检测和区分)的波长；和/或(6)良好的抗疲劳性，以用于在用于连续分析物监测时减少降解。在某些方面，本公开内容中描述的纳米颗粒转换器的发色团包括这些特征中的一些或全部。
例如，在一些方面，本公开内容提供了纳米颗粒转换器，该纳米颗粒转换器展现出随流体成分的浓度而变化的在峰值发射波长下的信号荧光发射强度。纳米颗粒转换器还可以包含发色团，该发色团在峰值发射波长处具有不同的对照发射强度，其基本不会响应于流体成分的浓度而变化。在某些方面，峰值发射波长的范围为约200纳米至约300纳米、约250纳米至约350纳米、约300纳米至约400纳米、约350纳米至约450纳米、约400纳米至约500纳米、约450纳米至约550纳米、约500纳米至约600纳米、约550纳米至约650纳米、约600纳米至约700纳米、约650纳米至约750纳米、约700纳米至约800纳米、约750纳米至约850纳米、约800纳米至约900纳米、约850纳米至约950纳米、约900纳米至约1000纳米、约950纳米至约1050纳米、约1000纳米至约1100纳米、约1150纳米至约1250纳米，或约1200纳米至约1300纳米。
作为另一个实例，本公开内容的一些方面提供了纳米颗粒转换器，该纳米颗粒转换器展现出对于长期体内分析物浓度监测的足够稳定性，例如，纳米颗粒转换器能够在延长的时间段内稳定地检测分析物浓度而没有显著降解。在各个方面，纳米颗粒转换器的稳定性有利于确保所述转换器可以在体内长时间使用而无需更换。在一些方面，如果群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％或至少99.95％的纳米颗粒转换器在指定时间段内保持响应于分析物浓度变化而调节荧光的能力，则该纳米颗粒转换器群体被认为是“稳定的”。在一些方面，如果纳米颗粒转换器的发射强度在指定时间段内保持测量分析物浓度变化的能力，则该纳米颗粒转换器被认为是“稳定的”。在一些方面，即使绝对发射强度可能显著降低，但如果两个发射峰的强度比在指定时间段内保持测量分析物浓度变化的能力，则该纳米颗粒转换器被认为是“稳定的”。在一些方面，如果时间常数(例如，衰减到荧光信号强度的1/e的时间)为至少约3小时、约6小时、约12小时、约24小时、约1天、约2天、约4天、约10天、约20天、约30天、约1个月、约2个月、约4个月、约6个月、约1年或更长，则该纳米颗粒转换器被认为是稳定的。在一些方面，纳米颗粒转换器保持足够的信号强度，使得可以在整个指定时间段内可靠地进行分析物检测。
在本公开内容的一些方面，选择或设计发色团发射光谱以在峰值发射波长处展现窄带发射性质，以便减少或最小化与其他发射源的重叠。例如，在某些方面，发色团具有不大于约5纳米、约10纳米、约15纳米、约20纳米、约25纳米、约30纳米、约35纳米、约40纳米、约45纳米、约50纳米、约60纳米、约70纳米、约80纳米、约90纳米或约100纳米的峰值发射带宽(例如，发射峰的半峰全宽(fwhm))。
发色团组成
各种类型的发色团适合于与本公开内容的方法和系统一起使用，包括但不限于染料、染色剂、蛋白质、聚合物、珠子、颗粒或其组合。在一些方面，纳米颗粒转换器包含一种或多种发色团(例如，荧光团)。本文所述的发色团可用于根据各种机制产生纳米颗粒转换器。在一些方面，纳米颗粒包含半导体聚合物，其响应于用光束照射而发射一个或多个波长下的荧光。半导体聚合物的荧光量可取决于反应物或产物分子的浓度。在一些方面，纳米颗粒包含半导体聚合物和发射一个或多个波长下的荧光的染料。染料的荧光量取决于反应物或产物分子的浓度。染料可以物理掺杂或化学附接至半导体聚合物以形成纳米颗粒。发色聚合物可以具有向染料的能量转移，以增强或放大染料的荧光强度。
在一些方面，纳米颗粒转换器包括至少一种发色半导体聚合物颗粒(也称为“聚合物点”或“pdot”)，该发色半导体聚合物颗粒包含一种或多种塌缩成稳定的亚微米大小颗粒的聚合物(例如，半导体聚合物、非半导体聚合物或其组合)。与其他类型的发色团相比，半导体聚合物颗粒在某些方面是有利的，出于以下几个原因：(1)它们非常明亮，比量子点亮至多30倍，并且具有特别的光稳定性；(2)它们具有快速的光子发射速率(通常具有亚纳秒的寿命)，因此它们非常适合快速光学检测；(3)它们具有良好的生物相容性，并且不是像量子点一样由细胞毒性重金属组成；(4)它们展现出放大的能量转移，因此它们的荧光发射可以很好地调节，例如通过光致变色分子经由能量转移。
发色聚合物颗粒的多种结构和组成适用于本文提供的方面。本文提供的发色聚合物颗粒由单一聚合物构成，或者替代地包含聚合物的共混物。在某些方面，将一种或多种聚合物塌缩、沉淀和/或冷凝以形成聚合物基质。在一些方面，发色聚合物颗粒的性质取决于成分聚合物的结构和/或性质。因此，聚合物骨架(主链)、侧链、末端单元和取代基团在某些方面是变化的，以获得特定的性质。在一些方面，通过改变聚合物骨架(主链)的结构来调节发色聚合物颗粒的光学性质。
在一些方面，本文提供的发色聚合物颗粒包括一种或多种发色团，在本文中也称为发色单元。在某些方面，发色团吸收光的某些波长，例如从紫外区域到近红外区域，并且可以是或不是发光的。在一些方面，发色单元包括但不限于具有离域π电子的结构单元、小有机染料分子单元和/或金属络合物单元。在各个方面，发色团是聚合物基质的一部分或被并入到聚合物基质中，例如通过共混、交联等。在一些方面，发色聚合物是半导体聚合物。
在某些方面，本公开内容的发色聚合物颗粒包括一种或多种发色聚合物。在一些方面，发色聚合物的至少一部分吸收光的某些波长(例如，从uv到近红外光谱)。根据本公开内容的发色聚合物可以是或可以不是发光的。在一些方面，发色聚合物包括一种或多种发色单元。发色聚合物的实例包括但不限于包含具有离域π电子的结构单元的聚合物(例如，半导体聚合物)、包含小有机染料分子单元的聚合物、包含金属络合物单元的聚合物以及包含任何组合的单元的聚合物。在一些方面，发色单元并入到聚合物骨架中。在一些方面，发色单元共价附接至侧链或聚合物的末端单元。在某些方面，使用通常本领域公知的标准合成方法制备发色聚合物。
多种类型的发色聚合物颗粒适合于用作本公开内容的光学标记方法的平台。发色聚合物颗粒可采用多种配置，包括但不限于具有均匀的均质组成的整体聚合物颗粒或具有不同核和帽结构的聚合物颗粒。本文提供的发色聚合物颗粒可通过本领域的任何方法形成，包括但不限于依赖于沉淀的方法、依赖于乳液(例如，细乳液或微乳液)形成的方法和依赖于缩合的方法。适用于与本文所述的技术一起使用的发色聚合物颗粒的实例可以见于例如pct申请号pct/us2010/056079、pct/us2012/071767、pct/us2011/056768、pct/us2013/024300和pct/us2013/063917以及美国专利公开号2013/0266957，这些申请的每一个通过引用并入本文。
在一些方面，发色聚合物颗粒是纳米颗粒。在一些方面，本文提供的纳米颗粒的大小根据“临界尺寸”来定义，“临界尺寸”是指纳米颗粒的最小尺寸。一些纳米颗粒的形状大致为球形，这导致临界尺寸为球形颗粒的直径。在一些方面，某些纳米颗粒(如纳米球和纳米立方体)的尺寸完全是纳米级的。在一些方面，并非纳米颗粒的每个维度是纳米级的。例如，纳米圆柱体可以具有纳米级的直径，但具有微米级的长度。多种纳米颗粒形状适用于本文所述的方面，包括但不限于球形、圆柱形、椭圆形、多面体、棱柱、棒、线或其组合。如本领域技术人员将理解的，纳米颗粒的形状在某些方面有助于光学性质(例如，纳米棒可具有与纳米球不同的光学性质)。
在一些方面，发色聚合物颗粒的典型大小小于100纳米。在某些方面，胶体聚合物纳米颗粒由疏液聚合物内部组成。任选地，聚电解质也可以形成纳米颗粒。在某些方面，发色聚合物颗粒包含至少一种已形成稳定颗粒的发色聚合物。例如，粒径可以在5纳米至500纳米之间变化。在一些方面，颗粒的临界尺寸(例如，直径)小于1,000纳米、小于700纳米、小于500纳米、小于400纳米、小于300纳米、小于200纳米、小于100纳米、小于50纳米、小于40纳米。在一些方面，颗粒的临界尺寸小于30纳米、小于20纳米或小于10纳米。
在一些方面，本文所述的发色聚合物颗粒包括由一种或多种发色聚合物形成的聚合物基质。任何合适数目和组合的发色聚合物类型均可以并入到本文所述的发色聚合物颗粒中，如一种或多种发色聚合物、两种或更多种发色聚合物、三种或更多种发色聚合物、四种或更多种发色聚合物、五种或更多种发色聚合物、六种或更多种发色聚合物、七种或更多种发色聚合物、八种或更多种发色聚合物、九种或更多种发色聚合物、十种或更多种发色聚合物、五十种或更多种发色聚合物或一百种或更多种发色聚合物。发色聚合物相对于整个发色聚合物颗粒质量的质量浓度可以在1％至99％、10％至99％、20％至99％、30％至99％、40％至99％或者50％至99％之间变化。
多种类型和组成的发色聚合物适用于根据本公开内容的方面的用途。发色聚合物可以是均聚物或杂聚物。在各个方面，发色聚合物是半导体聚合物、非半导体聚合物或其组合。例如，许多半导体聚合物适用于根据本公开内容的发色聚合物颗粒。半导体聚合物的实例包括但不限于：基于聚芴的聚合物，包括但不限于基于聚(9,9-二己基芴基-2,7-二基)(pdhf)的聚合物和基于聚(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)(pfo)的聚合物；基于芴的共聚物，包括但不限于，基于聚[{9,9-二辛基-2,7-二亚烯乙基-亚芴基}-alt-co-{2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-l,4-亚苯基}](pfpv)的聚合物、基于聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-co-(l,4-苯并-{2,l,3}-噻二唑)](pfbt)的聚合物、基于聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-co-(4,7-二-2-噻吩基-2,1,3-苯并噻二唑)](pftbt)的聚合物和基于聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-co-(4,7-二-2-噻吩基-2,l,3-苯并噻二唑)](pf-0.1tbt)的聚合物；亚苯基亚乙烯基聚合物，包括但不限于，基于聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基亚乙烯](meh-ppv)的半导体聚合物和基于聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)](cn-ppv)的半导体聚合物；基于亚苯基亚乙炔基的聚合物，包括但不限于聚(2,5-二(3’,7’-二甲基辛基)亚苯基-1,4-亚乙炔基)(ppe)的半导体聚合物；基于bodipy的半导体聚合物；基于方酸的半导体聚合物；或其组合。
多种发色聚合物结构适合于根据本公开内容的各个方面的用途。在一些方面，发色聚合物是线性聚合物。在其他方面，发色聚合物是支化聚合物。在某些方面，发色聚合物是树枝状聚合物。在某些方面，发色聚合物是刷状聚合物。在某些方面，发色聚合物是星形聚合物。
在一些方面，本文所述的发色聚合物颗粒含有基于聚苯乙烯的梳状聚合物。基于聚苯乙烯的梳状聚合物的非限制性实例包括聚苯乙烯接枝丙烯酸、聚苯乙烯接枝环氧乙烷、聚苯乙烯接枝丁醇等。在一些方面，本文所述的发色聚合物颗粒含有基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物。基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物的非限制性实例包括聚(甲基丙烯酸甲酯)接枝丙烯酸、聚(甲基丙烯酸甲酯)接枝环氧乙烷等。在一些方面，本文所述的发色聚合物颗粒含有这样的梳状聚合物，所述梳状聚合物包含羧基、胺、硫醇、酯、琥珀酰亚胺酯、叠氮化物、炔烃、环辛炔或膦基团。
在一些方面，本文所述的发色聚合物颗粒含有在末端单体单元上官能化的聚合物，例如具有羧基、胺、硫醇、酯、琥珀酰亚胺酯、叠氮化物、炔烃、环辛炔、膦或类似官能团。这样的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基)丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、聚异丁烯、聚二烯、聚亚苯基、聚乙烯、聚(乙二醇)、聚丙交酯、聚苯乙烯、聚硅氧烷、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚氨酯、其嵌段共聚物、其无规共聚物或交替共聚物等。
在一些方面，本文所述的发色聚合物颗粒含有具有一个或多个官能化单体单元的共聚物，例如两亲聚合物，包括但不限于：基于聚((甲基)丙烯酸)的聚合物，如：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-n-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-n,n-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)；基于聚二烯的共聚物，如：聚(丁二烯(1,2加成)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1,2加成)-b-甲基丙烯酸)、聚(丁二烯(1,4加成)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,4加成)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1,4加成)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1,4加成)-b-n-甲基4-乙烯基碘化吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)和聚(异戊二烯-b-n-甲基2-乙烯基碘化吡啶鎓)；基于聚(环氧乙烷)的共聚物，如：聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-丙交酯)、聚(环氧乙烷-b-丙交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-n-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-硝基苄基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-n,n-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-四氢糠基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)；基于聚异丁烯的共聚物，如聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)；基于聚苯乙烯的共聚物，如聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段接合处可断裂的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁烯)、聚(苯乙烯-b-n,n-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-n-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-n-甲基2-乙烯基碘化吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-n-甲基-4-乙烯基碘化吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-co-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-co-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-co-异戊二烯磺酸酯)；基于聚硅氧烷的共聚物，如聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)；基于聚(二茂铁基二甲基硅烷)的共聚物，如聚(二茂铁基二甲基硅烷-b-环氧乙烷)；基于聚(2-乙烯基萘)的共聚物，如聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)；基于聚(乙烯基吡啶和n-甲基乙烯基碘化吡啶鎓)的共聚物，如聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(n-甲基2-乙烯基碘化吡啶鎓-b-环氧乙烷)、聚(n-甲基4-乙烯基碘化吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)peo末端官能oh；以及基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的共聚物，如聚(乙烯基吡咯烷酮-b-d/l-丙交酯)；等等。
在本公开内容的一些方面，本文提供的发色聚合物颗粒包括聚合物cn-ppv，也称为聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)]，是一种明亮、致密且发射橙光的半导体聚合物颗粒。在某些方面，cn-ppv具有优异的荧光性质，如大的吸收截面、高量子产率和快速发射率。在一些方面，发色聚合物颗粒包括基本上由cn-ppv组成的聚合物。在一些方面，颗粒包括cn-ppv和至少一种其他材料。例如，cn-ppv可以与提供额外功能的共聚物或其他材料混合。
在一些方面，本公开内容的发色聚合物颗粒包括具有至少两种不同发色单元的半导体共聚物。例如，共轭共聚物可含有以给定比例存在的芴和苯并噻唑发色单元。用于合成半导体共聚物的典型的发色单元包括但不限于芴单元、亚苯基亚乙烯基单元、亚苯基单元、亚苯基亚乙炔基单元、苯并噻唑单元、噻吩单元、咔唑芴单元、硼-二吡咯亚甲基单元及其衍生物。不同的发色单元可以隔开(如在嵌段共聚物中)或混合在一起。在一些方面，通过书写主要发色物质的标识来表示发色共聚物。例如，pfbt是含有一定比例的芴和苯并噻唑单元的发色聚合物。在一些情况下，破折号用于指示次要发色物种的百分比和随后的次要发色物种标识。例如，pf-0.1bt是含有90％聚芴(pf)和10％苯并噻唑(bt)的发色共聚物。
在某些方面，发色聚合物颗粒包括半导体聚合物的共混物。共混物可包括均聚物、共聚物和寡聚物的任何组合。可以选择用于形成发色聚合物颗粒的聚合物共混物，以便调节所得聚合物颗粒的性质，例如，以获得聚合物颗粒的所需激发或发射光谱。
在本公开内容的各个方面，半导体发色聚合物颗粒提供改进的检测灵敏度，部分是因为它们展现出比其他荧光报道分子更高的量子产率。在一些方面，所使用的发色聚合物颗粒的量子产率大于5％、大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。在各个方面，半导体发色聚合物颗粒提供改进的检测灵敏度，部分是因为它们展现出大的吸收截面。在各个方面，半导体发色聚合物颗粒提供改进的检测灵敏度，部分是因为它们展现出比其他荧光报道分子更快的发射速率。在某些方面，所用的发色聚合物颗粒的发射速率为约100皮秒至约50纳秒。
在一些方面，本文的发色聚合物颗粒包括带有小有机染料分子、金属络合物、光致变色染料及其任何组合的单元的聚合物，例如，光学惰性聚合物如共价连接或接枝小有机染料、金属络合物、光致变色染料或其任何组合的聚苯乙烯。在一些方面，发色聚合物颗粒包括与作为发光单元的小有机染料分子、金属络合物、光致变色染料或其任何组合共价连接的半导体聚合物。这样的发光单元可以调节发光颜色、增加量子产率以及改善发色聚合物颗粒的光稳定性。在一些方面，小有机染料或金属络合物具有传感功能，并因此向发色聚合物颗粒添加额外的功能，如蛋白质感测能力。
在一些方面，纳米颗粒转换器包括一种或多种发色团(例如，荧光团)。发色团发射取决于流体成分的荧光。在一些方面，流体成分是由纳米颗粒转换器的酶催化的反应中的反应元素，该反应包括分析物。在一些情况下，流体成分是反应的产物；在一些情况下，流体成分是反应的反应物。在一些方面，反应速率随分析物浓度变化，从而改变流体成分的浓度并致使转换器荧光相应地变化。
在一些方面，发色团包括染料。在一些方面，染料对一种或多种流体成分敏感。在一些方面，染料对氧敏感。可与本文公开的纳米颗粒转换器一起使用的氧敏感染料的实例包括pt(ii)-卟啉和pd(ii)-卟啉、磷光ru(ii)络合物和ir(iii)络合物。氧敏感染料的实例包括但不限于pt(ii)八乙基卟啉(ptoep)、pt(ii)内消旋-四(五氟苯基)卟啉(pttfpp)、pt(ii)八乙基卟啉酮(ptoepk)、pd(ii)八乙基卟啉(pdoep)和pd(ii)内消旋-四(五氟苯基)卟啉(pdtfpp)、pd(ii)-内消旋-四-(4-羧基苯基)卟啉(pdtpcpp)、pd(ii)-内消旋-四-(4-羧基苯基)四苯并卟啉树枝状聚合物(pdtcptbp)、pt(ii)-粪卟啉(ptcp)、pt(ii)-内消旋-四苯并卟啉丁基八酯(pttbp)、pt(ii)-粪卟啉-酮(ptcpk)、环金属化ir(iii)l-氯-桥联二聚体香豆素络合物(ir(iii)(cx)2(acac))和[ru(bpy)2(2-(4-羧基苯基)咪唑并-[4,5-f][1,10]菲咯啉)h2)]2 ([ru(bpy)2(pich2)]2 )。
在一些方面，发色团包含对离子、ph和温度敏感的染料。构建纳米颗粒转换器的染料的实例包括钠敏感染料、钾敏感染料、钙敏感染料、镁敏感染料、铁敏感染料、锌敏感染料、铜敏感染料、锰敏感染料、ph-敏感染料、温度敏感染料。包含对离子、ph和温度敏感的发色团的纳米颗粒包括例如pct/us2010/056079中描述的那些纳米颗粒。
在一些方面，发色团包含对一种或多种流体成分敏感的半导体发色聚合物。可以将半导体聚合物设计和合成为具有对一种或多种流体成分敏感的荧光。在一些方面，半导体发色聚合物对氧敏感。合成氧敏感的半导体发色聚合物的策略的实例包括将氧敏感单元并入到半导体聚合物骨架中或将氧敏感单元附接至半导体聚合物的侧链。可以附接氧敏感单元的半导体发色聚合物的实例包括基于聚(9,9-二己基芴基)(pdhf)的聚合物、基于聚(9,9-二辛基芴基)(pfo)的聚合物、基于聚{[9,9-二-(3-(3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲氧基)己基芴基-2,7-二基-co-[9,9-二辛基芴基-2,7-二基]}(do-pfo)的聚合物、基于聚[{9,9-二辛基-2,7-二亚乙烯基-亚芴基}-alt-co-{2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-l,4-亚苯基}](pfpv)的聚合物、基于聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-co-(l,4-苯并-{2,l,3}-噻二唑)](pfbt)的聚合物、基于聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-co-(4,7-二-2-噻吩基-2,1,3-苯并噻二唑)](pftbt)的聚合物、亚苯基亚乙烯基聚合物，包括但不限于基于聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基亚乙烯基](meh-ppv)、基于聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)](cn-ppv)、基于聚(2,5-二(3’,7’-二甲基辛基)亚苯基-1,4-亚乙炔基(ppe)、基于bodipy和基于方酸的半导体聚合物。
在一些方面，发色团发射取决于过氧化氢(h2o2)浓度的荧光。过氧化氢可以是产物反应元素。在一些方面，纳米颗粒包含发色聚合物，该发色聚合物发射取决于过氧化氢浓度的荧光。在一些方面，纳米颗粒包含发色聚合物和发射一个或多个波长下的荧光的染料。染料的荧光量可取决于过氧化氢的浓度。例如，染料可以物理掺杂或化学附接至发色聚合物以形成纳米颗粒。发色聚合物可以在发色聚合物与染料之间具有能量转移，以增强或放大染料的荧光强度。可与本文公开的纳米颗粒转换器一起使用的过氧化氢敏感染料的实例包括香豆素衍生物、荧光素衍生物、罗丹明衍生物、花菁衍生物，硼-二吡咯亚甲基(bodipy)衍生物。
在一些方面，发色团包含染料和半导体发色聚合物，并且染料和半导体聚合物相互作用以产生增强的荧光。在一些方面，半导体聚合物对流体成分不敏感；来自这种聚合物的荧光可以提供稳定的内标，从而用作对其他波长下的可变荧光信号的对照。半导体发色聚合物可以具有向染料的能量转移，以放大和增强染料的荧光。可与本文公开的纳米颗粒转换器一起使用的半导体发色聚合物的实例包括基于聚(9,9-二己基芴基)(pdhf)的聚合物、基于聚(9,9-二辛基芴基)(pfo)的聚合物和基于聚{[9,9-二-(3-(3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲氧基)己基芴基-2,7-二基-co-[9,9-二辛基芴基-2,7-二基]}(do-pfo)的聚合物、基于聚[{9,9-二辛基-2,7-二亚乙烯基-亚芴基}-alt-co-{2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-l,4-亚苯基}](pfpv)的聚合物、基于聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-co-(l,4-苯并-{2,l,3}-噻二唑)](pfbt)的聚合物、基于聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-co-(4,7-二-2-噻吩基-2,1,3-苯并噻二唑)](pftbt)的聚合物、亚苯基亚乙烯基聚合物，包括但不限于基于聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基亚乙烯基](meh-ppv)、基于聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)](cn-ppv)、基于聚(2,5-二(3’,7’-二甲基辛基)亚苯基-1,4-亚乙炔基(ppe)、基于bodipy和基于方酸的半导体聚合物。在一些方面，染料对一种或多种流体成分敏感。在一些方面，染料对氧敏感。可与本文公开的纳米颗粒转换器一起使用的氧敏感染料的实例包括pt(ii)-卟啉和pd(ii)-卟啉、磷光ru(ii)络合物和ir(iii)络合物。氧敏感染料的其他实例包括但不限于pt(ii)八乙基卟啉(ptoep)、pt(ii)内消旋-四(五氟苯基)卟啉(pttfpp)、pt(ii)八乙基卟啉酮(ptoepk)、pd(ii)八乙基卟啉(pdoep)和pd(ii)内消旋-四(五氟苯基)卟啉(pdtfpp)、pd(ii)-内消旋-四-(4-羧基苯基)卟啉(pdtpcpp)、pd(ii)-内消旋-四-(4-羧基苯基)四苯并卟啉树枝状聚合物(pdtcptbp)、pt(ii)-粪卟啉(ptcp)、pt(ii)-内消旋-四苯并卟啉丁基八酯(pttbp)、pt(ii)-粪卟啉-酮(ptcpk)、环金属化ir(iii)l-氯-桥联二聚体香豆素络合物(ir(iii)(cx)2(acac))和[ru(bpy)2(2-(4-羧基苯基)咪唑并-[4,5-f][1,10]菲咯啉)h2)]2 ([ru(bpy)2(pich2)]2 )。染料可以与半导体聚合物物理共混或化学附接以形成纳米颗粒。
在一些方面，发色团包含多种染料。第一染料对一种或多种流体成分敏感，并且第二染料可与该敏感染料相互作用以产生增强的荧光。在一些方面，至少一种染料对流体成分不敏感，因此提供稳定的荧光作为内标。多种染料可以发射不同波长的荧光，从而允许独立测量每种染料的荧光。敏感染料和非敏感染料可彼此相互作用以放大和增强对一种或多种流体成分敏感的染料的荧光。
在一些方面，发色聚合物颗粒包含与其他发色聚合物物理混合或化学交联的半导体聚合物，如共价连接或接枝小有机染料、金属络合物、光致变色染料或其任何组合的非活性聚合物，以便具有其他功能，如蛋白质感测。
在一些方面，发色聚合物颗粒包括半导体聚合物，该半导体聚合物与其他组分如荧光染料、无机发光材料、磁性材料、金属材料等物理混合或化学交联，以便调节发光颜色、改善量子产率和/或光稳定性，并且/或者提供其他功能，如磁性功能、等离子体共振功能等。
可以通过改变组成和/或结构来调节给定发色聚合物颗粒的光学性质，如吸收波长。已经开发出具有从uv到红外(包括整个可见光谱)的吸收波长范围的半导体聚合物。在一些方面，使用具有约200纳米至约300纳米、约250纳米至约350纳米、约300纳米至约400纳米、约350纳米至约450纳米、约400纳米至约500纳米、约450纳米至约550纳米、约500纳米至约600纳米、约550纳米至约650纳米、约600纳米至约700纳米、约650纳米至约750纳米、约700纳米至约800纳米、约750纳米至约850纳米、约800纳米至约900纳米、约850纳米至约950纳米或约900纳米至约1000纳米的峰值吸收波长的发色聚合物颗粒。
已经开发出具有从uv到红外(包括整个可见光谱)的发射波长范围的半导体聚合物。在一些方面，使用具有约200纳米至约300纳米、约250纳米至约350纳米、约300纳米至约400纳米、约350纳米至约450纳米、约400纳米至约500纳米、约450纳米至约550纳米、约500纳米至约600纳米、约550纳米至约650纳米、约600纳米至约700纳米、约650纳米至约750纳米、约700纳米至约800纳米、约750纳米至约850纳米、约800纳米至约900纳米、约850纳米至约950纳米、约900纳米至约1000纳米、约950纳米至约1050纳米、约1000纳米至约1100纳米、约1150纳米至约1250纳米或1200纳米至约1300纳米的峰值发射波长的发色聚合物颗粒。
在一些方面，本公开内容提供了具有窄带发射的发色聚合物颗粒。窄带发射对于某些应用是有利的，包括但不限于多个荧光信号的分辨。聚合物颗粒的发射波长可以从紫外区域到近红外区域变化。在一些方面，发射带的fwhm为小于约100纳米、约70纳米、约65纳米、约60纳米、约55纳米、约50纳米、约45纳米、约40纳米、约35纳米、约30纳米、约25纳米、约20纳米或约10纳米。在一些方面，本文所述的聚合物颗粒的fwhm可以为约5纳米至约100纳米、约10纳米至约70纳米、约20纳米至约60纳米或约30纳米至约50纳米。
在一些方面，本公开内容的各种发色聚合物颗粒包括具有窄带发光单元(例如，窄带单体和/或窄带单元)的聚合物。例如，本公开内容可包括均聚物或杂聚物，其包括窄带单体，如bodipy和/或bodipy衍生物单体、方酸和/或方酸衍生物单体、金属络合物和/或金属络合物衍生物单体、卟啉和/或卟啉衍生物单体、金属卟啉和/或金属卟啉衍生物单体、酞菁和/或酞菁衍生物单体、镧系元素络合物和/或镧系元素络合物衍生物单体、苝和/或苝衍生物单体、花菁和/或花菁衍生物单体、罗丹明和/或罗丹明衍生物单体、香豆素和/或香豆素衍生物单体，和/或呫吨和/或呫吨衍生物单体。在某些方面，窄带单元是例如窄带单体或嵌入或附接至聚合物颗粒的荧光纳米颗粒。荧光纳米颗粒可以是例如量子点。任选地，窄带单元包括在本公开内容的聚合物颗粒中产生窄发射的聚合物或荧光染料分子。
在本公开内容的一些方面，本文提供的设备、组合物、系统和方法利用一种或多种发色团(例如，染料或半导体发色聚合物)，该发色团能够例如响应于入射辐射如uv、可见光、远红光、近红外光或其他光而生成一个或多个波长下的荧光。在一些情况下，在给定波长下的来自发色团的荧光量随流体成分的局部浓度而变化(信号发色团)；在其他方面，来自发色团的荧光量不会响应于所述局部浓度而变化(对照发色团)。在某些方面，如本文提供的纳米颗粒可以并入信号发色团和对照发色团，分别发射在信号波长和对照波长下的荧光。尽管在具有一个或两个不同发射波长的纳米颗粒的背景下描述了本文的各个方面，但应当理解，本文提出的方法也适用于发射超过两个波长的纳米颗粒。例如，可以提供以两个信号波长和一个或两个对照波长发射的纳米颗粒，这可以用于多个分析物测量信号。可以提供具有不同信号/对照波长对的多个不同纳米颗粒，其各自响应于不同的分析物(或任选地响应于相同的分析物，例如，用于冗余信号传导)。
在某些方面，当在不同浓度的流体成分中时，生成信号波长的荧光的发色团展现出不同的光学特性(例如，发射光谱、吸收光谱、峰值发射波长、峰值激发波长、发射强度、发射寿命、发射率)。例如，发色团可响应于流体成分如分子的浓度增加而表现出增加(或减少)的荧光。在一些方面，荧光的变化可以是随流体成分浓度成比率的。该分子可以是氧，例如，该氧可以是涉及待测量分析物并且由酶催化的反应中的反应物或产物。酶可以与包含发色团的纳米颗粒偶联，使得酶所催化的反应改变分子的局部浓度，从而响应于分析物浓度的变化改变发色团的荧光。在一些方面，这样的变化可以是成比率的。例如，可以在对照波长下生成荧光，使得对照与信号的荧光比率可以用作分析物浓度的信号，从而消除或减少某些噪声源和荧光强度测量的不确定性。
酶组合物
在本文公开的某些方面，提供的小分子检测是基于纳米颗粒氧转换器与催化小分子氧化反应的耗氧酶的整合。在一些情况下，纳米颗粒转换器可以直接与酶混合用于测量。在一些情况下，提供共价缀合以将纳米颗粒与酶连接，从而产生可用于细胞内感测的紧凑探针。在纳米颗粒表面上形成酶电晕后，纳米颗粒-酶生物缀合物表现为纳米反应器，该纳米反应器在酶所敏感的小分子分析物的存在下消耗其内部氧储存。因此，当氧耗尽时，通过氧转换器的光学信号监测小分子浓度。该感测方案的表现取决于以下因素，包括：(1)分析物的存在是否可以引起氧分布曲线的明显变化；(2)氧转换器是否能够将氧转换为光信号。另外，体内检测还与诸如局部微血管灌注、组织氧的可用性和酶活性等问题密切相关。在以下部分中，提供葡萄糖作为实例，通过该实例，对于体外和体内应用，可以用理论分析和实验证据来说明本文所述的纳米颗粒转换器在感测分析物浓度中的有效性。基于本文描述的实例，可以通过选择适当反应性酶和对由该酶催化的反应中的反应元素敏感的相应发色团来制造产生用于检测包括小分子、大分子和其他流体成分在内的多种分析物的荧光信号的纳米颗粒转换器。
在许多方面，本文提供的纳米颗粒转换器包含酶，并且该酶催化反应。该反应包括待测量的分析物，并且产生产物并消耗反应物，产物和反应物统称为反应元素。在许多方面，反应元素包括流体成分，并且流体成分的浓度由反应改变。例如，流体成分可以是反应产物，并且反应可以增加流体成分的浓度。或者，流体成分可以是反应物，并且反应可以降低其浓度。在一些方面，流体成分是氧，并且氧是反应物。在一些方面，耗氧酶和分析物分别包含以下对中的一种或多种：葡萄糖氧化酶和葡萄糖；抗坏血酸氧化酶和抗坏血酸；谷氨酸氧化酶和谷氨酸；多巴胺β-羟化酶和多巴胺；胆固醇氧化酶和胆固醇；以及醇氧化酶和醇、乳酸氧化酶和乳酸以及黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤、单胺氧化酶和单胺、nadph氧化酶和nadph、l-古洛糖酸内酯氧化酶和l-古洛糖酸内酯、赖氨酰氧化酶和赖氨酸、漆酶及其各种底物如酚，以及细胞色素p450氧化酶及其各种底物(包括药物)。在一些情况下，耗氧酶是胺氧化酶，并且分析物是氨基酸。在一些情况下，耗氧酶是细胞色素p450，并且分析物是当被细胞色素p450催化时与氧反应的药物。在一些情况下，耗氧酶是nadph氧化酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶)，并且分析物是nadph。在一些情况下，耗氧酶是黄嘌呤氧化酶，并且分析物是黄嘌呤。在一些情况下，耗氧酶是古洛糖酸内酯氧化酶，并且分析物是古洛糖酸内酯。
在一些方面，流体成分不是氧；例如，流体成分可以是离子，酶可以催化改变离子浓度的反应，并且发色团可以产生由所述离子浓度调节的荧光；流体成分可以是酸或碱，酶可以催化改变ph的反应，并且发色团可以产生由所述ph调节的荧光；或者流体成分可以是热能，酶可以催化改变温度的反应，并且发色团可以产生由所述温度调节的荧光。在一些方面，流体成分可以是过氧化氢，酶可以催化改变过氧化氢浓度的反应，并且发色团可以产生由所述过氧化氢浓度调节的荧光。例如，过氧化氢可以是反应的产物。
在一些方面，将多种酶与纳米颗粒转换器偶联以催化相应的多个反应。多个反应形成反应链，其中一个反应的一种或多种是另一反应的反应物。例如，可由多种酶提供酶级联，其中每种酶执行级联的步骤。多个反应中的至少一个涉及分析物作为反应物，并且至少一个反应具有作为用于调节发色团发射强度的反应元素的流体成分。
装置组件
在一些方面，本文所述的系统包括计算机，该计算机包括一个或多个处理器，以及其上存储有可执行指令的存储器装置。在一些方面，使用计算机来执行本文所述的方法。在各个方面，可以使用计算机来实现上文所图示和描述的任何系统或方法。在一些方面，计算机包括经由总线子系统与多个外围子系统通信的处理器。这些外围子系统可以包括存储子系统(包括存储器子系统和文件存储子系统)、用户接口输入装置、用户接口输出装置和网络接口子系统。
在一些方面，总线子系统提供了一种用于使得计算机的各个组件和子系统能够按照预期与彼此通信的机构。总线子系统可以包括单总线或多总线。
在一些方面，网络接口子系统提供了与其他计算机和网络的接口。网络接口子系统可以用作从计算机接收数据和向其他系统传输数据的接口。例如，网络接口子系统可以使得计算机能够连接至互联网并促进使用互联网的通信。
在一些方面，计算机包括用户接口输入装置，如键盘、定位装置(如鼠标、轨迹球、触摸板或图形输入板)、扫描仪、条形码扫描仪、并入显示器中的触摸屏、音频输入装置(如语音识别系统，麦克风)以及其他类型的输入装置。总的来说，术语“输入装置”的使用旨在包括用于向计算机输入信息的所有可能类型的装置和机构。
在一些方面，计算机包括用户接口输出装置，如显示子系统、打印机、传真机或非视觉显示器(如音频输出装置)等。例如，显示子系统可以是平板装置如液晶显示器(lcd)或投影装置。总的来说，术语“输出装置”的使用旨在包括用于从计算机输出信息的所有可能类型的装置和机构。
在一些方面，计算机包括提供用于存储基础编程和构建的数据的计算机可读存储介质的存储子系统。在一些方面，存储子系统存储在由处理器执行时提供本文所述方法和系统的功能的软件(程序、代码模块、指令)。这些软件模块或指令可以由一个或多个处理器执行。存储子系统还可以提供用于存储根据本公开内容所使用的数据的存储库。存储子系统可以包括存储器子系统和文件/磁盘存储子系统。
在一些方面，计算机包括存储器子系统，该存储器子系统可以包括多个存储器，所述存储器包括用于在程序执行期间存储指令和数据的主随机存取存储器(ram)和存储固定指令的只读存储器(rom)。文件存储子系统为程序和数据文件提供非暂时性永久(非易失性)存储，并且可以包括硬盘驱动器、usb棒、固态驱动器、光驱、可移动介质匣盒以及其他类似的存储介质。
计算机可以是各种类型，包括智能电话、平板计算机、个人计算机、便携式计算机、工作站、网络计算机、主机、信息亭、服务器或任何其他数据处理系统。由于计算机和网络的性质不断变化，本文中所包含的计算机的描述旨在仅作为出于说明计算机的方面的目的的具体示例。具有比本文所述系统更多或更少的组件的许多其他配置是可能的。
本发明的其他方面
在各个方面，提供了用于分析物浓度测量的纳米颗粒转换器。该纳米颗粒转换器包括包含发色团的纳米颗粒，并且酶与该纳米颗粒偶联。该酶催化包含多个反应元素的反应。该反应元素包含一种或多种反应物，包括分析物，和一种或多种产物。发色团发射的荧光的量由多个反应元素中的反应元素的浓度决定。可通过适当的光照射，如紫外线、可见光、远红光、近红外光或其他光，来诱导荧光发射。
在一些方面，所述反应元素之一是氧，并且发色团发射的荧光量由氧浓度决定。在一些情况下，所述酶包括葡萄糖氧化酶。所述一种或多种反应物可包括葡萄糖和氧，并且所述一种或多种产物包括过氧化氢和d-葡糖酸-1,5-内酯。
在一些方面，所述纳米颗粒转换器进一步包含过氧化氢酶。
在一些方面，从发色团发射的荧光量由反应物的浓度决定；在一些方面，从发色团发射的荧光量由产物浓度决定。
在一些方面，所述纳米颗粒包括pdot。所述酶可以与该纳米颗粒共价键合。
在一些方面，所述发色团包含半导体聚合物。在一些方面，所述发色团包含染料。该染料可以包含在纳米颗粒内。所述发色团可包含半导体聚合物和染料，并且该染料和半导体聚合物相互作用以产生增强的荧光。在一些情况下，所述发色团包含两种或更多种半导体聚合物的共混物。
在一些方面，从发色团发射的荧光包括信号荧光波长和对照荧光波长。从发色团发射的荧光可包含荧光比率，该荧光比率等于在信号波长下发射的荧光量与在对照荧光波长下发射的荧光量的比率。该信号荧光比率可以由多个反应元素中的反应元素的浓度决定。在许多情况下，该荧光比率随分析物的浓度成比例地变化。在一些情况下，信号波长荧光随分析物浓度基本上线性地增长，而对照波长荧光保持基本恒定。
在各个方面，分析物是葡萄糖，并且分析物浓度的范围在0至约20mm葡萄糖的范围内。在一些情况下，分析物浓度的范围在约3mm葡萄糖至约15mm葡萄糖的范围内。
在一些方面，纳米颗粒含有至少20重量％的发色团。例如，该纳米颗粒可含有至少50重量％的发色团，或至少90重量％的发色团。在一些情况下，该纳米颗粒包含约100重量％的发色团。
在一些方面，所述纳米颗粒包含用于荧光检测第二分析物的第二发色团和与纳米颗粒偶联的第二酶。第二酶催化包含第二多个反应元素的第二反应。第二多个反应元素包含包括第二分析物在内的第二一种或多种反应物和第二一种或多种产物。从第二发色团发射的荧光量由第二多个反应元素中的第二反应元素的浓度决定。第二发色团的荧光包含与另一发色团的荧光不同的波长。
在一些方面，所述纳米颗粒转换器包含含有第二发色团的第二纳米颗粒，和与纳米颗粒偶联并被配置用于催化包含第二多个反应元素的第二反应的第二酶。第二多个反应元素包含包括第二分析物在内的第二一种或多种反应物和第二一种或多种产物。从第二发色团发射的荧光量由第二多个反应元素中的第二反应元素的浓度决定。
在一些情况下，所述酶选自抗坏血酸氧化酶、谷氨酸氧化酶、多巴胺β-羟化酶、胆固醇氧化酶、醇氧化酶、胺氧化酶和细胞色素p450。在一些情况下，分析物选自抗坏血酸、谷氨酸、多巴胺、胆固醇、醇。在一些情况下，分析物可以是氨基酸、药物、蛋白质、核酸分子或递送分子。在一些情况下，分析物可以是碳水化合物、脂质或代谢物。在一些情况下，分析物是糖。
在一些方面，分析物浓度是血液浓度。在一些方面，分析物浓度是在淋巴、唾液、泪液、间质液、脊髓液或尿液中的浓度。
在一些方面，所述纳米颗粒转换器包含多种酶，并且所述多种酶催化相应的多个反应，每个反应包含相应的多个反应元素。分析物是多个反应之一的反应物，并且从发色团发射的荧光由至少一个反应的反应元素的浓度决定。在一些情况下，一种酶反应的一种或多种产物是另一种酶反应的反应物，从而形成酶反应链。因此，分析物浓度可以通过参与酶反应链来影响发色团的荧光。
在一些情况下，所述纳米颗粒转换器的临界尺寸为小于约1000nm、小于700nm、小于约500nm或小于约100nm。在一些情况下，所述纳米颗粒转换器的临界尺寸在约15nm至约45nm的范围内。
在各个方面，提供了一种用于测量生物流体中的分析物浓度的设备。该设备包含如根据本文公开的方面提供的多个荧光纳米颗粒转换器。该设备进一步包含耦合至处理器和存储器的光学传感器，以及被配置用于用光照射多个荧光纳米颗粒以便从其诱导荧光的照明源。该存储器包括指令，该指令在被执行时致使处理器使用光学传感器来测量由所述多个荧光纳米颗粒转换器发射的荧光。
在一些方面，生物流体是血液、淋巴、唾液、泪液、间质液、脊髓液或尿液。
在一些方面，所述多个荧光纳米颗粒转换器适合于定位在患者的皮肤下，并且在面向皮肤时，光学传感器适合于检测由多个荧光纳米颗粒转换器通过皮肤透射的荧光。在一些情况下，光学传感器被配置用于检测信号荧光波长处的信号荧光量和对照荧光波长处的对照荧光量，并且存储器包含致使处理器基于所述测量的信号荧光和对照荧光量来确定测量的荧光比率的指令。在一些情况下，该存储器包含致使处理器基于所测量的荧光比率确定分析物的浓度的指令。
在各个方面，提供了一种用于检测葡萄糖浓度的接触镜。该接触镜包含可佩戴在眼睛上的可渗透的透明膜，并且该接触镜含有根据本文公开的方面的多个纳米颗粒转换器。所述纳米颗粒转换器被配置为响应于扫描仪的照射产生荧光，并且荧光的量提供可被扫描仪检测的信号，以用于确定眼睛表面上的流体中的葡萄糖的浓度。该接触镜的膜可被成形为在佩戴时矫正人的视力。
在各个方面，提供了一种用于测量受试者的汗液中的葡萄糖浓度的装置。该装置包含根据本文公开的方面的多个荧光纳米颗粒转换器，该转换器通过该装置定位以在佩戴时接触受试者的皮肤。该装置进一步包含被配置用于用光照射所述多个荧光纳米颗粒以便从其诱导荧光的照射源，和安设在该装置中并定向用于检测来自所述多个荧光纳米颗粒转换器的荧光的光学传感器。处理器耦合至光学传感器。该处理器被配置为基于由光学传感器检测的荧光来确定汗液中的葡萄糖浓度。该处理器可进一步被配置为基于汗液中的葡萄糖浓度确定血液中的葡萄糖浓度。
在各个方面，提供了一种确定流体中的分析物浓度的方法。使该流体与根据本文公开的方面的纳米颗粒转换器接触。测量该纳米颗粒转换器的荧光，并且基于测量的荧光确定该流体中分析物的浓度。在一些情况下，该方法包括用光照射纳米颗粒转换器，从而诱导荧光。
在一些方面，所述确定包括将所测量的荧光与纳米颗粒转换器的校准曲线进行比较，以确定流体中的分析物浓度。在一些方面，所述测量包括测量多个荧光波长，并且所述确定是基于所测量的波长的比率。在一些情况下，所述流体是血液、汗液或泪液。
在一些方面，提供了一种测量流体中分析物的浓度的方法。该分析物引起流体中的反应，并且该反应改变流体组分的浓度。使该流体与包含发色团的pdot接触，并且该发色团发射荧光，该荧光的量由流体组分的浓度决定。由荧光团发射荧光，并且基于荧光确定流体中分析物的浓度。
在一些方面，从发色团发射的荧光包含荧光比率，该荧光比率等于在信号荧光波长下发射的荧光量与在对照荧光波长下发射的荧光量的比率，并且该荧光比率由流体组分的浓度决定。在一些情况下，所述浓度的确定包括测量信号荧光波长和对照荧光波长处的荧光，从而基于所述测量确定测量的荧光比率，以及基于测量的荧光比率确定分析物的浓度。
在一些方面，分析物是抗坏血酸，并且流体组分是氧。在一些情况下，所确定的浓度为1mm至20mm的抗坏血酸。在一些方面，所述流体是血液、汗液或泪液。
鉴于本文的公开内容，对于本领域技术人员来说显而易见的是，根据预期应用可以容易地改变本公开内容的任何设备、装置、系统及其组件的具体尺寸。此外，应当理解，本文描述的实例和方面仅用于说明性目的，并且本领域技术人员可以想到根据其进行的各种修改或变化，并且这些修改或变化包括在本申请的精神和范畴内以及所附权利要求的范围内。本文描述的方面的众多不同组合是可能的，并且这样的组合被视为本公开内容的一部分。
如本文所用，a和/或b包括a或b中的一个或多个以及其组合，如a和b。如本文所用，当本公开内容描述了包含一种或多种元素的方面时，还公开了由所述元素组成的方面。
结合任何方面或本文的方面所讨论的所有特征都可以容易地适用于其他方面和本文的方面中。在不同方面中对于类似特征使用不同的术语或参考标记并不必然暗示着差异，有明确阐述的那些除外。因此，本公开内容旨在仅通过参考所附权利要求来描述，而不限于本文公开的方面。
除非另外指明，否则目前描述的方法和过程可以以任何次序执行。例如，描述步骤(a)、(b)和(c)的方法可以首先执行步骤(a)，随后执行步骤(b)，继而执行步骤(c)。或者，该方法可以以不同的次序执行，举例而言，诸如首先执行步骤(b)，随后执行步骤(c)，继而执行步骤(a)。此外，除非另外特别指明，否则那些步骤可以同时或分开执行。
本文所示的细节是举例说明，并且仅出于对本公开内容的优选方面的说明性讨论的目的，并且呈现这些细节是为了提供被认为是对本发明各个方面的原理和概念性方面最有用且最容易理解的描述。就这一点而言，除了基本理解本发明所必要的之外，没有尝试更详细地示出本发明的结构细节，随附图和/或实例所进行的描述使本领域技术人员明显明白如何在实践中体现本发明的若干形式。
虽然本文中已经示出和描述了本公开内容的优选方面，但应当理解，本公开内容不限于所描述的本公开内容的特定方面，这是因为可以对特定方面做出改变并且仍然落入所附权利要求的范围内。所采用的术语是出于描述本公开内容的特定方面的目的，而不是旨在限制。反而，本公开内容的范围由所附权利要求确定。
在提供数值范围的情况下，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每个中间值(除非上下文另有明确所指，精确至下限的单位的十分之一)，以及所陈述范围内的任何其他陈述值或中间值都包括在本文提供的公开内容内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围内，并且也包括在本发明内，但服从于所陈述范围内的任何具体排除的限制。在所陈述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些所包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本文提供的公开内容中。
结合方面或本文的方面讨论的所有特征都可以容易地适用于其他方面和本文的方面。在不同方面中对于类似特征使用不同的术语或参考标记并不暗示着差异，有明确阐述的那些除外。因此，本公开内容旨在仅通过参考所附权利要求来描述，并且不限于本文公开的方面。
实施例
包括以下实施例来进一步描述本公开内容的一些方面，并且不应使用以下实施例来限制本发明的范围。
实施例1
用于分析物浓度测量的纳米颗粒转换器的操作原理
在一个实施例中，通过考虑葡萄糖氧化酶的葡萄糖酶促反应和氧扩散的模型模拟了典型样品配置中氧浓度的空间和时间变化。图1a至图1h图示了使用来自用葡萄糖氧化酶催化的反应的o2调节信号检测葡萄糖的示例性纳米颗粒转换器的模拟o2消耗动力学和分布曲线。使用含有葡萄糖氧化酶(gox)的典型比色皿(1cm×1cm×3cm)来模拟由葡萄糖诱导的氧消耗。简而言之，在封闭系统(没有氧扩散)中，在gox和葡萄糖存在下的耗氧动力学可表示为a([o2]-[o2]0) b(ln[o2]-ln[o2]0＝-(t-t0))
其中[o2]0对应于在反应临开始前的t0时刻在空气饱和溶液中的[o2]。参数a和b可以由gox浓度、给定葡萄糖浓度的酶促反应速率常数计算。当葡萄糖相对于氧过量存在时，该表达式是有效的，由于生理葡萄糖浓度(通常在约mm范围内)远高于空气饱和溶液(约250μm)和组织(<100μm)中的氧浓度，其通常是正确的。基于上述等式，图1a中示出了含有gox(5nm)和不同浓度葡萄糖的封闭比色皿中氧浓度的动态变化。可以看出，随着酶反应的发生，初始氧浓度(约250μm，空气饱和溶液)降低，并且此后由不同葡萄糖浓度诱导的差异是有区别的。由于对于具有不同葡萄糖含量的溶液，溶液中的氧(没有氧供应和扩散的封闭系统)的可用性有限，氧最终消耗至类似的平衡水平。
氧扩散与开放比色皿配置和皮下组织中的葡萄糖测定有关。为了简化模拟，将比色皿的z轴离散成一系列薄层，将氧模型化为仅从顶部开口扩散。通过由菲克定律控制的氧消耗和扩散的组合效应来模拟每层中的时间氧浓度。最终在氧消耗与扩散之间建立平衡，从而在大量反应时间后产生平坦的浓度曲线，如图1b所示。图1c图示了具有5nmgox和20mm葡萄糖的体系沿着开放比色皿配置的z轴的时间和空间氧分布的3-d绘图，以及取决于酶促反应时间的每层中的时间演变。在500秒的时间点，通过氧映射良好区分葡萄糖浓度，特别是在比色皿的底部。图1d图示了在500秒的时间点，在具有不同葡萄糖浓度的开放比色皿中的氧分布曲线。该结果表明，借助于氧转换器，可以用荧光计中的开放比色皿配置有效且高效地测量生物流体中的葡萄糖浓度。
提供了对皮下组织中的球形样品的氧映射的进一步模拟，其中组织氧浓度(<100μm)远小于空气饱和溶液中的氧浓度(约250μm)。为了满足体内实时葡萄糖监测的要求，提供50nm的gox浓度以实现快速响应时间。正如预期的那样，与低gox浓度的响应时间相比，样品中心处的时间氧变化产生了较短的响应时间。图1e图示了在封闭组织氧环境中的这些o2消耗动力学。使氧从圆形边缘扩散到内部，类似于实际植入中的3d球形物体的薄层。图1f图示了在具有氧扩散的组织中的o2消耗动力学，显示出在氧扩散存在下的时间演变指示葡萄糖酶促反应，从而产生在相对短的时间内不同的氧分布曲线。图1g图示了在20秒的时间点具有氧扩散的圆形配置的2-d映射。如通过2d映射进一步指示的，对不同的葡萄糖水平清楚地区分氧概况，表明通过氧转换器的皮下葡萄糖测量是高度可行的。值得注意的是，与没有氧扩散的情况相比，氧扩散在一定程度上在葡萄糖测定中产生了非常高的灵敏度。该差异在图1h中示出，该图示出了在20秒的时间点在具有和没有氧扩散的情况下用于葡萄糖测定的氧消耗的灵敏度。为了在实际实验中调节氧或葡萄糖的扩散，可以采用多种策略，如将转换器嵌入多孔凝胶或具有不同包封层的其他基质中。
实施例2
用于分析物浓度测量的纳米颗粒转换器的生产
在该实施例中，在用于检测葡萄糖的示例性系统中产生并表征纳米颗粒转换器。使用再沉淀法进行半导体聚合物点的水性分散。在典型的制备中，通过在惰性气氛下搅拌过夜，将半导体聚合物pdhf、功能聚合物psma和磷光染料ptoep分别溶解在无水四氢呋喃(thf)中以制备1mg/ml储备溶液。将三种溶液稀释并在thf中混合以产生pdhf浓度为100μg/ml、ptoep浓度为10μg/ml且psma浓度为10μg/ml的溶液混合物。在水浴超声波仪中，将2ml量的溶液混合物快速添加至10ml的milli-q水中，同时对混合物进行超声处理，随后进行另外的100秒超声处理。通过氮气汽提去除thf，并将溶液在90℃的热板上浓缩至5ml，随后通过0.2微米过滤器过滤。在纳米颗粒形成期间，psma分子的马来酸酐单元在水性环境中水解，从而在pdot上生成羧基基团。磷光染料分子由于其疏水性而被包封在pdot内。pdot分散体澄清且稳定数月而没有聚集迹象。
可以通过使用氧响应转换器将葡萄糖诱导的氧浓度的波动转换成光信号。图2a至图2d图示了包含pdot-gox组装物的纳米颗粒转换器的制备和表征。pdot转换器包含掺杂有发色团的荧光半导体聚合物[聚(9,9-二己基芴基-2,7-二基)，pdhf]，该发色团包括氧敏感的磷光染料(铂(ii)八乙基卟啉，ptoep)。在该设计中，缀合的聚合物pdhf用作光收集器，其将能量转移至ptoep染料，从而导致对氧浓度高度敏感的明亮磷光。
图2a是用于体内葡萄糖监测的pdot-gox生物缀合物形成的示意图。如图2a所示，用表面羧基基团对氧敏感pdot进行官能化。利用pdot的羧基基团与酶中的胺基团之间的edc催化反应，用gox包覆该pdot。通过利用pdot表面上的羧基基团与gox酶上的胺基团之间的edc催化反应进行生物缀合。在该生物缀合反应中，将80μl的浓缩的hepes缓冲液(1m，ph6.5)添加至4ml的官能化pdot溶液(milliq水中50μg/ml)中，从而得到ph为6.5的20mmhepes缓冲液中的pdot溶液。然后，将100μl的葡萄糖氧化酶(在20mmph＝6.5hepes中10μm)添加至溶液中并充分涡旋混合。将80μl的新鲜制备的edc溶液(在milliq水中5mg/ml)添加至溶液中，并将上述混合物在旋转振荡器上在室温下放置4小时。最后，使用sephacrylhr-300凝胶培养基通过凝胶过滤将所得的pdot生物缀合物与游离生物分子分离。可以改变gox与pdot的比率以产生具有不同动态范围的pdot-gox传感器。
动态光散射测量表明，pdot的流体动力学直径在生物缀合后从24nm增加到32nm，如图2b所示，而pdot-gox的表面ζ电位从-31mv变为-20mv，如图2c所示。粒径和表面电位测量均证实了gox在颗粒表面上的成功缀合和存在。透射电子显微镜(tem)显示pdot-gox纳米颗粒是球形的并且是单分散的。图2d图示了羧基pdot(左)和pdot-gox(右)的代表性tem图像。
pdot-gox生物缀合物在磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液中也展现出持续超过30天的极好的胶体稳定性。图3a图示了pdot-gox转换器在30天内的胶体稳定性。出于体内葡萄糖监测的目的，pdot-gox缀合物具有无与伦比的亮度和高灵敏度，允许容易地检测来自甚至少量植入的传感器材料的信号。pdot转换器还满足植入式传感器的生物相容性要求，同时为长期透皮检测提供足够的发光信号。
荧光光谱表明pdot-gox组装物用于生物流体中的葡萄糖检测的高灵敏度、高选择性和可调节动态范围。pdot转换器展现出来自pdhf的380nm处的主要吸收和来自ptoep的648nm处的主要磷光峰。图3b示出了pdot-gox传感器的紫外-可见吸收光谱和光致发光光谱。红光发射与紫外激发很好地分离，这对于通过肉眼监测发射信号是一个很大的优点。图3c图示了在pdhf的荧光发射与磷光染料ptoep的吸收之间的光谱重叠。这种重叠提供了发色团之间的能量转移，从而允许被pdhf供体吸收的紫外光泵浦ptoep受体。图3d图示了未掺杂的pdhfpdot和ptoep掺杂的pdot的发射光谱，其中激发波长为380nm。由于从pdhf供体到ptoep受体发生有效的
实施例3
纳米颗粒转换器的表征
在该实施例中，测量了pdot-gox纳米颗粒转换器的光谱和物理性质。通过动态光散射(dls)和透射电子显微镜(tem)表征pdot的粒径和形态。使用1cm一次性聚苯乙烯比色皿在25℃下用malvernnanozs仪器进行动态光散射。在相同的malvernnanozs仪器上进行ζ电位测量。通过将pdot分散体滴涂到铜网格上来制备用于tem测量的样品。使样品在室温下干燥，随后使用在120kv下操作的hitachih-600显微镜获得tem图像。用schimadzuuv-2550扫描分光光度计使用1cm玻璃比色皿记录紫外-可见吸收光谱。使用hitachif-4500荧光分光光度计获得荧光光谱。在将葡萄糖添加至比色皿后10分钟测量不同葡萄糖浓度下的pdot-gox的荧光光谱，其中激发波长为380nm。计算红光发射与蓝光发射的强度比(i648/i428)以绘制灵敏度曲线。
图4a示出了在不同葡萄糖浓度下pdot-gox转换器的发射光谱。在步长为2时，从0至20mm葡萄糖的曲线各不相同；在648nm峰值处，曲线以从最低浓度到最高浓度的强度顺序排列，其中20mm最强。pdot-gox生物缀合物显示出对葡萄糖浓度敏感的明亮的红色磷光，而弱的蓝色荧光保持恒定。恒定的蓝色荧光和敏感的红色磷光赋予其成比率的感测，这对于诸如定量测定细胞和组织葡萄糖水平的应用是有用的。图4b示出了随葡萄糖浓度变化的pdot-gox转换器的比率校准曲线(i648/i428)。如图4b所示，648nm处的发射与428nm处的发射的比率在生理学相关的血糖范围(约4mm至约18mm)中显示出与葡萄糖浓度的线性关系。通过将灵敏度定义为曲线的线性部分的斜率，pdot-gox传感器显示出每mm20％的强度变化，这使其成为最灵敏的荧光葡萄糖传感器之一。另外，可以通过改变生物缀合反应中gox与pdot的摩尔比来调节pdot-gox组装物的动态范围。
图4c图示了在水性悬浮液中pdot-gox对葡萄糖的响应曲线。水性环境中的pdot-gox平台在几分钟内展现出快速的葡萄糖响应。在将葡萄糖添加至比色皿中的pdot-gox溶液中之后，通过普通荧光计测量传感器响应。使用1cm玻璃比色皿在25℃下在hepes缓冲液(ph＝6.5)中用配备有氙灯的荧光分光光度计(hitachif-4500，japan)测量传感器的响应时间。获取所有响应曲线，其中激发波长为380nm。通过将30μl的葡萄糖溶液添加至3ml的pdot-gox悬浮液中，记录随时间变化的648nm处的pdot-gox(10μg/ml)的荧光强度。注意到葡萄糖扩散到激发体积需要时间，648nm处的发射强度增加到恒定值并在10分钟内达到稳定，表明传感器在几分钟内快速响应。为了评估pdot-gox传感器的选择性，在添加各种碳水化合物物质(10mm)并在380nm激发后10分钟测量pdot-gox的荧光光谱。响应时间主要由葡萄糖扩散和酶促反应决定。
由于gox酶的特定催化反应，pdot-gox传感器对潜在的干扰底物(如不同的碳水化合物衍生物)显示出高选择性。图4d图示了相对于潜在的干扰性碳水化合物，pdot-gox转换器对葡萄糖的选择性。与例如基于硼酸识别的葡萄糖感测染料相比，高选择性为体内葡萄糖监测提供了很大的优势。此外，通过可逆测量来评估操作稳定性，其中将葡萄糖添加至pdot-gox溶液用于测量，并在每个循环后通过脱盐柱去除。对于超过10次重复测量，传感器的响应保持不变。快速和可逆的响应实现了连续葡萄糖测量，从而允许直接并入葡萄糖传感器。在25℃和4℃下储存2个月后，传感器保留了其初始响应的95％以上。这些结果表明pdot-gox生物缀合物具有很好的操作和储存稳定性。
实施例4
纳米颗粒转换器对低分析物浓度敏感
在该实施例中，描述了具有选定灵敏度的纳米颗粒转换器，特别是提供了在低分析范围内具有分析物灵敏度的纳米颗粒转换器。图5a和图5b图示了用酶密集包覆的纳米颗粒用于低浓度感测的用途。图5a图示了在各个葡萄糖浓度下密集包覆gox的pdot的发射光谱，而图5b示出了低分析范围内的pdot-gox的比率校准绘图(i648/i428)。如图5a和图5b所示，密集包覆gox的pdot在相对低的分析范围(1-4mm)中显示出高灵敏度(25％/mm)，这可用于低血糖症中的葡萄糖监测。
实施例5
纳米颗粒转换器生物相容性
在该实施例中，描述了确认本文所述的纳米颗粒转换器的细胞系的生物相容性的实验。生物相容性是确定纳米颗粒转换器(例如pdot-gox纳米颗粒)是否可用作体内葡萄糖监测的可植入传感器的重要因素。使用hela细胞中的细胞活力测定评估pdot-gox纳米颗粒的细胞毒性。将hela细胞系用于细胞毒性研究和细胞内葡萄糖成像。细胞培养物使用具有酚红的dulbecco改进的eagle培养基(dmem)(lifetechnologiesgibco，usa)，其补充有10％胎牛血清(fbs)、50u/ml青霉素和50μg/ml链霉素。将细胞在37℃的空气/co2(95:5)气氛中在温育箱(thermoscientific，usa)内维持在t75细胞培养瓶(nest，wuxichina)中。在实验之前将细胞预培养直至达到汇合。
对于细胞毒性研究，将细胞在96孔板(每孔100μl中7000个细胞)中接种24小时，随后将pdot、gox、cat(过氧化氢酶)和pdot-gox( cat)(不同的最终浓度)分别添加至细胞培养基。将细胞与各种材料温育24h，随后添加mtt(20μl，5mg/ml，biosharp，hefeichina)，持续3小时。去除培养基并向每个孔中添加dmso(150μl)(sigma-aldrich，shanghaichina)并在室温下轻轻摇动10min以溶解所有形成的沉淀物。通过使用酶标仪(biotekcytation3，usa)测量490nm处的吸光度。细胞活力由与pdot-gox溶液温育的细胞的吸光度与仅与培养基温育的细胞的吸光度之比表示。
图6a至图6d图示了用包括pdot-gox转换器在内的各种材料处理的hela细胞的细胞活力。图6a、图6b和图6c分别示出了用不同浓度的pdot-gox转换器、gox和过氧化氢酶处理的细胞的24小时细胞活力。图6a还图示了mcf-7和ges-1细胞经受与hela细胞相同的方案的24hr细胞活力，并且显示活力对细胞系没有依赖性。如图6b所示，由于过氧化氢的生成，单独的gox诱导细胞死亡。然而，在过氧化氢酶的存在下，pot-gox纳米颗粒(<10μg/ml)在温育24小时后与细胞生物相容，如图6d所示。在该浓度范围内，pdot-gox传感器能够通过内吞作用进入细胞。将hela细胞与pdot-gox纳米颗粒在无糖培养基中温育12小时。
对于细胞内葡萄糖感测，将1.5×104个hela细胞接种到用聚-l-赖氨酸(nest，wuxichina)包被的22mm玻璃底培养皿上，并使之在dulbecco改进的eagle培养基(dmem)中生长过夜(37℃，5％co2)。然后，将细胞在含有pdot-gox(10μg/ml)和过氧化氢酶(cat，250kda，sigma-aldrich，shanghaichina)(300nm)的无糖dmem中培养12小时。将葡萄糖进一步补充到细胞培养物(25mm)中温育4小时。然后用温pbs缓冲液洗涤细胞三次，然后在荧光显微镜下观察。
在具有0.45nalucplfln20x物镜的倒置荧光显微镜(olympusix71，japan)下获取荧光图像。激发光由汞灯生成，通过带通滤波器(semrockff01-377/50-25，rochester，nyusa)过滤。通过带通滤波器(semrockff01-655/40-25，rochester，nyusa)过滤荧光信号，并在andorixon3帧转移emccd(andor，uk)上成像。
图7a至图7c图示了hela细胞中的细胞内葡萄糖感测。图7a示出了没有pdot-gox温育的hela细胞，作为对照组，而图7b示出了在无糖培养基中与pdot-gox纳米颗粒温育24小时的细胞。如图7所示，荧光成像表明细胞明显内化了pdot-gox纳米颗粒。然后将葡萄糖补充到培养细胞的培养基中。图7c示出了与pdot-gox温育24小时并补充葡萄糖4小时的细胞。与未接受葡萄糖的细胞相比，细胞内发光大大增强，表明通过pdot-gox传感器成功检测了细胞内葡萄糖。
实施例6
体内鼠模型中的生物相容性
在该实施例中，描述了使用鼠受试者确认本文所述的纳米颗粒转换器用于体内连续分析物监测的生物相容性的实验。所有动物实验均涉及8周龄balb/c雄性小鼠(vitalriverlaboratories(vrl)，beijingchina)，重约25g。实验组大小包括每次处理三只动物，从而实现足够的结果复制与动物数目减少的平衡。所有成像的动物都包括在分析中。在成像之前将动物禁食8h以用于体内葡萄糖监测。用腹膜内注射100μl水合氯醛(10wt％)来麻醉每只小鼠。此后，将200μl的pdot-gox(50μg/ml)皮下注射到小鼠的背侧，以用于连续体内葡萄糖监测。
由于非凡的亮度，微克范围内的pdot转换器是透皮可检测的；用小动物成像系统清楚地区分具有三个不同浓度的植入部位。用配备有andorikon-m帧转移ccd(andorikon-m934，uk)和氙光源(asahispectramax-303，japan)的定制小动物成像系统获取荧光动物成像。在麻醉施用后二十五分钟，通过使用5s的曝光时间在543nm的激发和655nm的发射下进行荧光成像。在成像后立即使用手术刀快速去除至多1cm的尾部从小鼠的尾部采集血液样品，并且通过使用标准血糖仪(accu-chek，rochediagnostics)测量血糖浓度。然后，用200μl无菌葡萄糖溶液(1m)腹膜内处理小鼠以增加血糖浓度。十五分钟后，腹膜内注射100μl的无菌胰岛素盐水溶液(0.5u/ml，wanbangbiopharmaceuticals，xuzhouchina)以降低血糖浓度。在该过程中，我们每5分钟捕获荧光图像并测量血糖浓度，直到血糖浓度回到正常范围。对于对照组中的动物，同时给小鼠注射相同剂量的无菌盐水而不是葡萄糖和胰岛素。按照相同的程序进行荧光成像。在葡萄糖监测实验后通过注射过量麻醉剂使动物安乐死。
图8a和图8b图示了皮下注射有pdot-gox转换器的小鼠的荧光成像。图8a图示了具有不同浓度的pdot-gox转换器的三个注射部位的荧光成像，而图8b示出了注射有pdot-gox的三个不同部位的荧光强度。实际上，在用uv灯激发下，0.25μg(5μl，50μg/ml)的pdot-gox甚至是通过皮肤层和毛发而肉眼可见的。图9示出了在室内光(顶部)和uv(底部)下皮下注射纳米颗粒转换器的小鼠的图像，其中纳米颗粒转换器的荧光清晰可见。能够使用少量材料进行植入有助于减少植入部位处的炎症并满足可植入传感器的生物相容性要求。
通过全动物生物光子成像证明了pdot-gox组装物对活小鼠中血糖波动的体内响应。通过腹膜内注射葡萄糖将小鼠的血糖水平升高至约20mm，这处在高血糖范围内。然后用胰岛素注射将血糖水平降低至约10mm，这处在正常血糖范围内。为了比较，使用来自剪断的尾部的血液样品，用商业血糖仪每5分钟测量血糖浓度。作为起点，在麻醉施用后第25分钟捕获活小鼠中植入的pdot-gox传感器的荧光图像。然后，用200μl无菌葡萄糖溶液(1m)腹膜内处理小鼠以增加血糖水平。15分钟后，腹膜内施用100μl的无菌胰岛素盐水(0.5u/ml)以降低血糖水平。
在整个过程期间，每5分钟捕获荧光图像以监测血糖浓度的变化。图10a和图10b分别示出了具有和不具有葡萄糖/胰岛素处理的小鼠的荧光图像。如成像结果所示，荧光信号在葡萄糖施用后立即增加，并在注射胰岛素后降低至原始水平。相反，来自没有葡萄糖/胰岛素的小鼠的荧光保持不变。图10c示出了具有葡萄糖和胰岛素施用的三只小鼠中pdot-gox传感器的平均发光强度和标准偏差，其随血糖浓度变化。如图中清楚所示，发光强度(圆圈)与血糖水平(正方形)密切相关，并且随着血糖波动不断跟踪浓度变化。对于未接受葡萄糖注射的小鼠，发光强度和葡萄糖浓度均保持相对恒定，如图10d所示。这些观察结果明确地证实了pdot-gox传感器的优异体内响应，其提供了足以透皮监测血糖浓度变化的信号和灵敏度。
实施例7
纳米颗粒转换器的药代动力学和稳定性
评估了皮下注射后pdot-gox纳米颗粒的药代动力学和体内分布。图11图示了长期葡萄糖监测和体内分布。在传感器植入后30天处死小鼠。对于生物分布研究，通过过量麻醉剂将葡萄糖监测实验后的小鼠安乐死。切除器官和组织(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、大腿肌肉和植入部位附近的皮肤组织)以用于荧光成像分析。最后，将切除的器官和组织置于福尔马林中以供组织学和荧光分析。
将切除的器官和组织在10％缓冲的福尔马林中固定过夜。通过一系列分级乙醇浴将组织脱水，使用二甲苯清洁，随后用蜡渗透。然后将渗透的组织包埋在蜡块中。然后使用切片机将组织切成5μm切片，并用苏木精和伊红(h&e)染色。在光学显微镜下观察组织切片。为了在皮下施用后获得主要器官和组织中的传感器分布，还采用荧光成像进行分析。在具有uv激发滤波器(375nm)和红光发射滤波器(655nm)的荧光显微镜上捕获没有h&e染色的组织切片的荧光图像。切除皮下组织和各种器官以用于生物光子成像。
图11a示出了皮下注射有pdot-gox转换器(底部)或无菌的磷酸盐缓冲盐水(顶部)的小鼠的切除器官和皮肤组织的荧光图像。如图像所示，仅从皮下组织观察到强荧光，表明pdot-gox在植入部位保持长达一个月。在这个时间点，与对照动物相比，在包括肝脏、脾脏、肺、肾脏、心脏和肌肉在内的各种器官中没有观察到显著差异，如图11b所示。
对组织切片的进一步显微镜检查显示没有来自这些器官的可检测的发光，这与生物光子成像结果一致。图12示出了在纳米颗粒转换器注射后30天对小鼠组织切片的组织化学分析。体内分布研究表明，pdot-gox纳米颗粒主要困在皮下植入部位并且不进入外周血。注射溶液中的水分子可被外周组织快速吸收，从而产生几乎没有扩散的稳定的纳米颗粒组装物。该观察与底物上的pdot聚集体即使在有机溶剂中也具有低溶解度的结论一致。
植入部位的pdot-gox组装物显示出在较长时间段内的敏感葡萄糖检测，这是连续葡萄糖监测器开发的主要目标。在指定的时间间隔进行生物光子成像：注射pdot-gox传感器后7、15和30天。图13a至图13c示出了在用纳米颗粒转换器注射后7天(图13a)、15天(图13b)和30天(图13c)的活小鼠的荧光成像。
植入的pdot-gox组装物在7天和15天展现出很大的响应，而没有明显的降解迹象，分别如图11c和图11d所示，其中荧光(圆圈)紧密跟踪葡萄糖(正方形)。30天后，传感器的发光强度仍然与血糖水平密切相关，并且不断跟踪浓度变化，其中在上下周期中相对于葡萄糖变化的相对较小的强度变化的灵敏度仅有很小的降低，如图11e所示。这种轻微降解可能是由于酶在pdot表面上的催化活性降低。图11f图示了从用pdot-gox注射的小鼠(右)和用pbs注射的对照组(左)切除的器官切片的苏木精和伊红染色。与对照组相比，未观察到明显的器官损伤和炎症。组织学分析显示在主要器官和组织中没有毒性作用，从而表明与pdot材料的生物相容性。
实施例8
用便携式装置进行葡萄糖浓度监测的纳米颗粒转换器
纳米颗粒转换器允许定量测量体内葡萄糖浓度，即使没有复杂的成像仪器，如该实施例中所示。使用便携式的基于光纤的显微光谱仪检测皮下植入的pdot-gox组装物的葡萄糖响应。图14a示出了皮下注射pdot-gox的小鼠在紫外光(385nm)下的照片。在与用于体内成像的方案相同的方案下，通过收集透皮荧光信号测量植入的pdot-gox传感器的发射光谱。图14b图示了活小鼠中所植入的pdot-gox转换器在385nm激发下的荧光发射光谱的动态变化，以及显示植入的pdot-gox转换器在葡萄糖和胰岛素注射后的活小鼠中的强度比变化(650nm相对于480nm)的插图。如图14b所示，650nm处的发射强度清楚地反映了由于葡萄糖和胰岛素的影响导致的葡萄糖水平的波动。最高峰出现在10分钟时，此后随着葡萄糖水平被胰岛素降低而每隔10分钟平稳下降(其中0分钟的测量除外)。0和40分钟时的光谱和葡萄糖水平大致相等，并且最低强度曲线对应于60分钟测量。480nm处的蓝光发射保持恒定，并且可用作比率测量的内部参考。图14c示出了在葡萄糖和胰岛素注射后，活小鼠中所植入的pdot-gox传感器的强度比变化(650nm相对于480nm)。结果也密切地跟随血糖的升高和降低，如通过血糖仪使用来自剪断的尾部的血液样品测量的。用紧凑且便携式的微光谱仪进行快速和定量的测量尤其适用于与智能电话的系统集成或可穿戴装置的开发。
实施例9
纳米颗粒转换器的其他发色团和酶实施例
该实施例说明了使用替代发色团布置的几个另外的纳米颗粒转换器。所描述的实施例是不详尽的，仅说明可以使用本文所述的技术形成的结构的广泛范围。尽管提供gox作为用于检测葡萄糖的示例性酶，但是可以提供替代的酶用于监测其他分析物；例如，可以通过将gox酶换成氧化替代分析物的酶，从而消耗氧并引起相关发色团的荧光变化，来用替代分析物替换本文所述的葡萄糖敏感性。以这种方式，任何氧敏感发色团均可用于在与耗氧酶组合时提供转换器荧光信号以用于检测任意分析物(其中酶催化与该分析物的耗氧反应)。
]图15a至图15d示出了在用于检测葡萄糖的pdot-gox转换器中，具有包含do-pfo、10％pdoep和10％psma的发色团的纳米颗粒转换器的荧光发射。图15a示出了多个葡萄糖浓度的发射光谱。图15b示出了所述转换器检测在0mm至约20mm的浓度范围内的葡萄糖的校准绘图，显示了整个范围内的比率响应曲线。图15c示出了体内鼠响应数据，显示发射曲线基本上跟踪所测量的葡萄糖浓度。图15d示出了接受葡萄糖的小鼠(顶部图像)和未接受葡萄糖的对照组(底部图像)的具有时间数据的图像。
图16a和图16b示出了在用于检测葡萄糖的pdot-gox转换器中，具有包含psma、1％pdoep和0.1％香豆素1的发色团的纳米颗粒转换器的荧光发射。图16a示出了多个葡萄糖浓度的发射光谱。图16b示出了所述转换器检测在0mm至约20mm的浓度范围内的葡萄糖的校准绘图，显示了比率响应曲线。
图17a和图17b示出了在用于检测葡萄糖的pdot-gox转换器中，具有包含psma、1％ptoepk和0.1％尼罗红的发色团的纳米颗粒转换器的荧光发射。图17a示出了多个葡萄糖浓度的发射光谱。图17b示出了所述转换器检测在0mm至约20mm的浓度范围内的葡萄糖的校准绘图，显示了比率响应曲线。
实施例10
用于检测反应性分析物的纳米颗粒传感器
在本公开内容的另一方面，提供了能够在不需要催化酶的情况下检测反应性分析物的纳米颗粒传感器。纳米颗粒传感器可用于检测抗坏血酸，例如，通过提供纳米颗粒如包含氧敏感发色团的pdot。由于抗坏血酸是还原剂，它会自发地反应以消耗氧。因此，所述传感器可用于检测抗坏血酸的存在；例如，当抗坏血酸以药物量存在时。
图18a和图18b示出了在用于检测抗坏血酸的pdot纳米颗粒传感器中，具有包含pdhf、10％ptoep和10％psma的发色团的示例性纳米颗粒传感器的荧光发射。图18a示出了多个抗坏血酸浓度的发射光谱。图18b示出了所述转换器检测在约2mm至约20mm的浓度范围内的抗坏血酸的校准绘图，显示了整个范围内的比率响应曲线。
图19a和图19b图示了使用纳米颗粒传感器在活小鼠中的体内连续抗坏血酸监测。图19a图示了在施用不同浓度的抗坏血酸的活小鼠中，所注射的纳米颗粒传感器的荧光强度。图19b示出了在具有注射的pdot传感器的活小鼠中，不同抗坏血酸浓度的体内荧光成像。
图20a和图20b图示了通过微型化光学检测系统的抗坏血酸血液浓度监测。图20a示出了在385nm激发下，活小鼠中所注射的pdot对抗坏血酸的血液浓度的荧光发射光谱的动力学变化。图20b示出了在静脉内施用抗坏血酸后，对抗坏血酸的血液浓度的随时间变化的荧光强度响应。因此，已经证明了用包含氧敏感发色团的纳米颗粒传感器体内检测抗坏血酸。
实施例11
使用纳米颗粒转换器对受试者进行葡萄糖监测的可穿戴装置
本文所述的纳米颗粒转换器的长期稳定性、高可靠性和快速可逆响应允许使用pdot-gox转换器进行体内葡萄糖监测。在该实施例中，皮下注射pdot-gox转换器，允许通过采用透皮uv照射并检测所发射的荧光的探针进行连续透皮监测以连续测定血糖水平，如所述的体内试验所证明的。提供了一种可穿戴装置，其包含对pdot-gox转换器的荧光发射敏感的光学传感器，和提供光的照明源，该光处于为纳米颗粒的荧光提供能量的波长下。光学传感器适合于检测通过受试者皮肤透射的荧光，以允许连续透皮监测血糖。光学传感器耦合至安设在装置内的处理器和存储器。该存储器包含指令，该指令在被执行时，致使处理器使用光学传感器来测量由多个pdot-gox转换器响应于葡萄糖的存在和来自光源的照射而发射的荧光。该装置进一步包含用于提供电力的电池。
实施例12
纳米颗粒转换器作为人造胰腺的葡萄糖传感器
在该实施例中，在人造胰腺中采用pdot-gox转换器作为葡萄糖传感器，从而提供反馈回路以在高测量葡萄糖下触发胰岛素分配或在低测量葡萄糖下停止胰岛素分配。该装置包含响应于葡萄糖超过或低于预定阈值而触发的警报功能。人造胰腺是可植入装置，其包含葡萄糖敏感纳米颗粒转换器、提供紫外光的照射源以及适合于检测纳米颗粒发射波长处的荧光的光学检测器。该装置进一步包含处理器，以用于使用类似于本文所述校准曲线的校准曲线从所测量的荧光确定血糖水平，并用于调节胰岛素通过胰岛素泵从储存腔室向患者的分配。可以根据需要从患者外部的来源补充储存腔室。检测器、处理器和泵提供反馈回路以将血糖水平维持在预定范围内，并且如果葡萄糖水平落在预定范围之外则可以触发警报。用户可调节该预定范围，以允许更严格或更宽松的血糖控制。该装置还包含存储器，用于记录随时间变化的葡萄糖水平用于校准目的，以及为用户提供葡萄糖水平历史。该装置进一步包含发射器，以允许与移动装置和/或通过计算机网络进行可选无线通信。
实施例13
包含纳米颗粒转换器的接触镜
在该实施例中，提供了一种包含纳米颗粒转换器的接触镜，以用于检测在眼睛上佩戴有接触镜的受试者的泪液中的分析物。当由受试者佩戴时，纳米颗粒转换器随着流体渗透接触镜而与眼睛的泪液接触。该接触镜包括含有葡萄糖氧化酶和发色团的纳米颗粒转换器，如上所述配置用于检测葡萄糖。将转换器嵌入接触镜的基本上透明的膜中，该膜被成形成向佩戴者提供视力矫正。向受试者提供可置于眼睛上方的扫描仪，该扫描仪提供照射以在纳米颗粒转换器中诱导荧光并且包含用于检测所诱导的荧光的检测器。纳米颗粒转换器发射具有响应于分析物的浓度而变化的强度的光，从而提供受试者泪液中分析物浓度的测量。泪液中分析物的浓度与血液中分析物的浓度相关；因此，该测量提供了血液中分析物浓度的测量。扫描仪还可以提供视网膜扫描，以用于检测诸如糖尿病性视网膜病变等病况。
实施例14
从汗液测量中检测血糖水平的装置
在该实施例中，提供了一种装置，其用于基于受试者的汗液中葡萄糖的检测来测量血糖水平。提供了一种装置，其包含可佩戴的带、多个纳米颗粒转换器、照明源和光学传感器。纳米颗粒转换器包含葡萄糖氧化酶和发色团，如上所述配置用于检测葡萄糖。纳米颗粒转换器安设在装置的表面上，使得当由受试者佩戴时，纳米颗粒转换器接触受试者的皮肤。由于汗液通常存在于皮肤上，因此纳米颗粒转换器能够接触受试者的汗液。受试者的汗液含有与血液中的葡萄糖成比例变化的葡萄糖；因此，测量汗液的葡萄糖浓度允许确定血糖水平。
该装置的照明源被定位成向接触受试者皮肤的纳米颗粒转换器提供照射，从而诱导荧光。纳米颗粒转换器产生基于所接触皮肤上的汗膜中的葡萄糖浓度而变化的荧光。通过耦合至处理器的光学传感器检测荧光。处理器基于由光学传感器检测到的荧光确定汗液中的葡萄糖浓度。然后，处理器基于汗液中的葡萄糖浓度确定血糖浓度。
实施例15
基于产物反应元素(h2o2)检测的纳米颗粒转换器
在该实施例中，在用于检测流体成分的示例性系统中产生并表征用于检测产物反应元素的纳米颗粒转换器。使用再沉淀法形成纳米颗粒的水性分散体。在一种制备中，通过在惰性气氛下搅拌过夜将功能聚合物psma和过氧化氢敏感染料分别溶解在无水四氢呋喃(thf)中以制备1mg/ml储备溶液。将溶液稀释并在thf中混合以产生溶液混合物，将该溶液混合物在水浴超声波仪中进一步快速添加至milli-q水中，同时对混合物进行超声处理。通过氮气汽提去除thf，并将溶液在90℃的热板上浓缩至5ml，然后通过0.2微米过滤器过滤。在纳米颗粒形成期间，psma分子的马来酸酐单元在水性环境中水解，从而在pdot上生成羧基基团。将h2o2敏感染料分子包封在纳米颗粒内或使其与聚合物缔合。过氧化氢(h2o2)是细胞呼吸的副产物并且可以在许多酶催化反应中生成。例如，h2o2浓度可受葡萄糖氧化酶催化的葡萄糖氧化反应的影响。通过使用h2o2响应性pdot转换器，可以将葡萄糖所诱导的过氧化氢浓度的变化转化为光学信号。图21示出了包含纳米颗粒-gox组装物的基于h2o2的纳米颗粒转换器的光谱响应。在添加葡萄糖后，由于gox催化的葡萄糖氧化反应生成的h2o2的存在，观察到明显的荧光增加。因此，基于由偶联至组装物的酶催化的分析物反应的产物介导的荧光，纳米颗粒-gox组装物用作用于检测分析物(在该实施例中是葡萄糖)的纳米颗粒转换器。
可以如上所述类似地制备其他纳米颗粒或pdot转换器，包括基于离子或金属离子的pdot转换器、基于ph的pot转换器和基于热的pot转换器。金属离子在许多酶的生物学功能中起重要作用。离子可用作电子供体或受体、路易斯酸或结构调节剂。离子直接参与催化过程。例如，羧肽酶a、肝醇脱氢酶、天冬氨酸转氨甲酰酶和碱性磷酸酶表明金属离子在金属酶中的不同作用，而锌离子在用于维持正常生长和发育的核苷酸聚合酶中起到重要作用。因此，离子敏感的pdot可用于构建纳米颗粒转换器，以通过并入催化改变离子浓度的反应的酶，从而生成随分析物浓度变化的荧光来检测分析物。类似地，质子供体和受体(例如，酸和碱)可以在酶催化中提供和接受质子。例如，丝氨酸蛋白酶催化机制的初始步骤涉及活性位点的组氨酸接受来自丝氨酸残基的质子。因此，ph敏感的pdot可用于构建纳米颗粒转换器，以用于通过并入催化改变ph的反应的酶从而生成随分析物浓度变化的荧光来检测分析物。
虽然本文中已经示出并描述了本发明的优选方面，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些方面仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明方面的各种替代方案可用于实施本发明。旨在以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
